Burada, HIV-1 Gag ve lipid membranları arasındaki etkileşimlerin, buğday tohumu bazlı in vitro translasyon sisteminde sentezlenen YFP etiketli Gag ve bir elektroformasyon tekniği ile hazırlanan GUV'ler kullanılarak görsel olarak analiz edildiği bir in vitro membran bağlanma testini gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
HIV-1, yapısal bir protein, Pr55 Gag (veya Gag) virüs montaj sırasında hücrelerin plazma zarına bağlanmaktadır. Gag bağlayıcı Membran viral parçacık üretimi ciddi bozulmaya Gag membran bağlama sonuçlarında bir kusur beri virüs parçacık oluşumu için önemli bir adımdır. Gag-lipid membran etkileşimlerin mekanik ayrıntıları elde etmek için, in vitro yöntemler, NMR protein ayak izi, yüzey plazmon rezonansı, lipozom flotasyon santrifüj veya floresan lipit boncuk göre, şimdiye kadar geliştirilmiş bağlanma. Bununla birlikte, bu, in vitro yöntemler, her birinin kısıtlamaları vardır. Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek ve daha önce kurulmuş yöntemleri tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz HIV-1 Gag ve lipid membranların arasındaki etkileşimleri bir "hücre benzeri" bir ortamda gerçekleştiği in vitro testi geliştirdi. Bu testte, Gag lipid zarlar bağlanabilen görsel YFP tagge kullanılarak analiz edilird Gag buğday sentezlenen vitro çeviri sistemi ve bir electroformation tekniği ile hazırlanan GUVs içinde germ-merkezli. Burada arka plan açıklamak ve protokoller tahlil için gerekli miristoillenmiş tam uzunlukta Gag proteinleri ve GUV membranlar elde etmek ve mikroskopi ile bağlayıcı Gag-Şef algılamak için.
Giriş
İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü tip 1 (HIV-1), çoğu hücre tiplerinde de toplanır ve plazma membranı (PM) ile ilgili tomurcukları zarflı bir virüstür. HİV-1 virüs parçacıklarının montajı Pr55 GAG (GAG) olarak adlandırılan 55 kDa viral çekirdek proteini ile tahrik edilir. Gag dört ana yapısal alana, yani, matris kapsid nükleokapsid ve P6, ve iki aralayıcı peptit SP1 ve SP2 arasında oluşan bir ön-madde poliprotein olarak sentezlenir. Montaj sırasında, matris (MA) etki montaj sitesine Gag hedeflenmesi sorumludur, kapsid (CA) etki Gag-Gag etkileşimlerini aracılık, nükleokapsid (NC) etki viral genomik RNA acemi ve p6 acemi ev sahibi faktörler yardım plazma ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Gün: buğday tohumu Lizat tabanlı In Vitro Transkripsiyon-çeviri Sisteminin Kullanılması Gag Proteinlerin İfadesi
HIV-1 Gag hazırlanması 1.
- (-20 ºC diğer reaktifler buğday tohumu lizatları -80 ºC 'de saklanır) dondurucular ticari buğday tohumu CECF kiti tüm reaktifleri çıkarın. Buz üzerine çözülme ve Tablo 1 'de gösterildiği gibi, bileşenler karışımı.
| Mix-1 (Besleme mix) | |
| besleme çözümü | 900 ul |
| Amino asitler <.... |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki protokolü kullanarak, POPC + POPS + Chol oluşan GUVs hazırlanan (: 4.66: 2.33: mol oranında 3). Bu bileşim, yaklaşık PM PS ve kolesterol konsantrasyonları yansıtacak şekilde seçildi. Beyin-PI (4,5) P2 POPC + POPS + Kol karışımın içine dahil edildiğinde Sağlam ve Gag bağlayıcı verimli yalnızca gözlendi (POPC + POPS + Chol + beyin-PI (4,5) P2 [molar oran 4: 2: 3: 1] örnekte) (Şekil 4, A ve C) panel B ve D karşılaştırın. POPC + oluşan .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıda açıklandığı gibi GUV bağlama deneyi diğer protein-lipid etkileşim deneyleri kendi sınırlamaları vardır senaryolarda iyi bir alternatif sunuyor. Bu tahlil bize çift katlı lipid bağlamında yerli uzunlukta açil zincirleri ile miristoillenmiş tam uzunlukta Gag ve asidik lipidler arasındaki etkileşimi incelemek ve Gag-lipit yüksek yoğunluklu sakaroz geçişlerini veya diğer post-bağlayıcı işleme yoluyla uzun yüzdürme santrifüj olmadan bunu sağlar kompleksleri. Bir başka avantaj Gag davranışı kolaylıkla gibi yüzey plaz.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çatışan çıkarlarımız olmadığını beyan ederiz.
Teşekkürler
Biz yararlı tartışmalar için Mohammad Saleem, Jing Wu ve Krishnan Raghunathan teşekkür etmek istiyorum. Biz de çekimler sırasında yardım için Priya Begani teşekkür ederiz. Bu eser (AO) R01 AI071727 ve (SLV için) R01 GM110052 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dijital Multimetre | Meterman | 30XR | Direnç ve volt ölçebilen genel bir multimetre amaca hizmet edecektir. |
| Fonksiyon Üreteci | Instek | GFG-8216A | 10 Hz ve 1 V'ta sinüs dalgası üretebilen genel bir fonksiyon üreteci yeterlidir. |
| ITO kaplı cam kaydıraklar | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Kuluçka makinesi | Hoefer | Sıcaklığı doğru bir şekilde koruyabilen herhangi bir inkübatör yeterli olacaktır | |
| Vakum odası | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Şırınga | Hamilton | 80400 | Ölçer 22S, Şırınga numarası 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer taban kiti, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Buğday Ruşeymi CECF Kiti | BiotechRabbit, Berlin, Almanya | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipidler, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipidler | 840034C | |
| Kolesterol | Avanti Polar Lipidler | 700041P | |
| Beyin-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipidler | 840046X |
Kaynaklar
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
