Bozulmamış embriyonik ve doğum sonrası kalplerin derinliklerindeki floresan protein etiketli hücreleri hacimsel olarak görüntülemek için bir protokol tanımlıyoruz. Tüm montaj boyama ile birlikte doku temizleme yöntemlerini kullanarak, embriyonik veya doğum sonrası bir kalbin içindeki tek floresan protein etiketli hücreler net ve doğru bir şekilde görüntülenebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi
Bu makalede
Özet
Özet
Bütün kalp seviyesinde tek klonal izleme ve analiz kalp gelişimi sırasında kalp progenitör hücre davranışını ve farklılaşmasını belirlemek ve normal ve anormal kalp morfolojilerinden hücresel ve moleküler temeli çalışması için izin verebilirsiniz. retrospektif tek klonal analizler Son gelişen teknolojiler tek bir hücre çözünürlükte kalp morfolojilerinden çalışma mümkün olun. Ancak, doku donukluk ve görüntüleme derinliği gibi kalbin ışık saçılması tek bir hücre çözünürlükte hinder bütün kalp görüntüleme artar. Bu engelleri, geliştirilmesi gerekir aydınlatma ve tespiti hem son derece şeffaf kalbi işleyebilir bir bütün embriyo takas sistemini aşmak için. Neyse ki, son birkaç yıl içinde, bu tür CLARITY olarak tüm organizma temizleme sistemleri, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, Babb ve PACT için birçok yöntemler bildirilmiştir. Bu laboratuvar kartının hücresel ve moleküler mekanizmalar ilgileniyorIAC morphogenesis. Son zamanlarda, biz ROSA26-Cre ERT2 üzerinden izleme tek bir hücre soyu kurulmuş, seyrek etiket hücrelere ROSA26-Konfeti sistemini kalp gelişimi sırasında. Biz kalp içinde görüntü tek klonlar bütün montaj boyama ile birlikte embriyo temizlemek için Sca le ve CUBIC (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analizi) dahil olmak üzere birçok bütün embriyo-takas yöntemleri uyarladı. Kalp başarıyla tek bir hücre çözünürlükte görüntülendi. Biz CUBIC doğum sonrası kalbi temizlemek süre Sca le, embriyonik kalbi temizlemek, ancak etkili bir doğum sonrası kalbi temizlemek olamayacağını bulundu, ancak zarar dokuyu eriterek Embriyonik kalp. Burada açıklanan yöntemler sırayla, konjenital kalp defektleri hücresel ve moleküler temelini ortaya çıkarabilir, kalp morfolojilerinden sırasında tek bir klon çözünürlükte gen fonksiyonu çalışma izin verecektir.
Giriş
Kardiyak morphogenesis kalbin farklı sektörleri içine kalp progenitör hücrelerin dört farklı tipte zamanmekansal organizasyon gerektiren bir ardışık bir olay olduğunu ve aynı zamanda fonksiyonel kalp 1,2 oluşturmak için bu süreci düzenlemek için birden fazla genetik düzenleyici ağları gerektirir. Kardiyak şartname, farklılaşma, desenleme ve bölme olgunlaşma kardiyojenik transkripsiyon faktörleri 3 düzenlenir. Genetik mutasyon veya kardiyak progenitör hücrelerin bu faktörlerin posttranskripsiyonel sapmaları embriyonik öldürücülüğü veya konjenital kalp kusurları (KKH) 4 ya neden olabilir. Kalp morfolojilerinden çalışma kardiyak morfojen....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Bakımı NIH Kılavuzu'na ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı göre Albany Medical College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. solüsyon preparasyonlarda
NOT: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Konfeti 16, αMHC-Cre 17 ve Rosa26-mTmG (mTmG) 20 fare hatları ticari satın alındı cTnT-Cre 18 Alabama Üniversitesi'nden Dr. Jiao bir hediye oldu Nfatc1-Cre.. Tıp 19 Albert Einstein College of Dr. Bin Zhou bir hediye oldu. F....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
temizlenir embriyonik kalbin görüntülenmesi
Omurgalı kalp oluşumu spatiotemporally düzenlenmiş morfojenik süreçtir ve dört farklı kaynaklardan 1 organizasyon ve progenitör hücrelerin farklılaşması bağlıdır. Kalp hilalin ilk kalp alanından Hücreler doğrusal bir kalp tüp oluşturacak şekilde ventral orta hat doğru katlanır. Başlangıçta ilk kalp alanına dorsomedially ikamet eden ikinci kalp alanından hücreler, daha sonr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
embriyo izolasyonu çok kritik bir adımdır. E9.5 embriyolar bu yüzden ekstra bakım izolasyonu sırasında embriyo / kalp yapıları zarar vermemek için alınmalıdır, boyutu çok kırılgan ve küçük. Bütün embriyo görüntüleme sırasında embriyo / kalbi saran olmayan embriyonik ekstra katmanları dikkatlice özellikle çıkarılmalıdır. Bu embriyonik dokularda derinliklerine antikor ve takas karışımı penetrasyon sağlar ve aynı zamanda görüntüleme arka plan sinyali giderilmesinde yardımcı olur. PECAM karşı antikorlar, asetile α-tübülin v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bilimsel tartışma için M.W. laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, AHA [13SDG16920099] tarafından M.W.'ye ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibeleri [R01HL121700] tarafından M.W.'ye desteklenmektedir. Görüntüler, Albany Tıp Koleji'ndeki Görüntüleme Çekirdek Tesisinde çekildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2,2&asal;,2′ '-nitrilotrioetanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| Affymetrix | 19943 | Scientific'te %4 Paraformaldehit | |
| N, N, N ', N'-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin ve nbsp; | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Fosfat Tampon Tuzlu | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Üre | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sükroz | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Gliserol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoksifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Ayçiçeği tohumu yağı | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | ||
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nükleer leke | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37o< / sup>C İnkübatör | Termobilimsel Fischer | Heratherm, Kompakt Mikrobiyolojik İnkübatörler | |
| 48 kuyulu plakalar | Hücre Tedavisi | 229148 | |
| Analitik Terazi | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Konfokal mikroskop | Zeiss | Zeiss 510 konfokal mikroskop | |
| Disecting Mikroskop | Unitron | Z850 | |
| Floresan mikroskop | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Cam Boncuk Sterilizatörü | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Işık Kaynağı | SCHOTT | ACE I | |
| Bir Çift Makas | Güzel Bilim Araçları | 14084-08 | |
| Petri kabı 60 mm x15 mm | TPP Tekno Plastik Ürünler AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Parıldayan tüpler | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipeti | Samco Scientific | 202 | |
| Cımbız | Güzel Bilim Araçları | 11251-20 |
Kaynaklar
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
