Yöntem makalesi

ölçme İn Vitro ATPaz Aktivitesi

DOI:

10.3791/54305

⸱

23 Ağustos 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATP-hidrolize edici enzimler ya da ATPaz, hücresel fonksiyonların çeşitli bir dizi çok önemli bir rol oynar. Bu dinamik proteinler, protein kaçakçılığı ve yıkımı, madde geçişinde ve hücresel hareketler gibi mekanik çalışmaları için enerji üretebilir. Burada açıklanan protokol fonksiyonel karakterizasyon için saflaştınldı ATPazların in vitro aktivitesini ölçmek için basit bir testtir. Proteinler, inorganik fosfat serbest sonuçlanan bir reaksiyon ATP hidroliz ve serbest fosfat miktarının bir kolorimetrik tahlil kullanılarak hesaplanır. Bu son derece uyumlu bir protokol kinetik ve bitiş noktası deneylerinde ATPaz aktivitesini ölçmek için ayarlanabilir. Temsili bir protokol aktivitesi ve Epse gereklerine göre burada sağlanan, AAA + ATPaz bakterisinin Vibrio cholerae Tip II salgılanması yer. aktivitesini ölçmek için ihtiyaç duyulan pürifiye protein miktarı, tayinin uzunluğu ve SA zamanlaması ve sayısımpling aralıkları, tampon ve tuzlu bileşim olup, sıcaklık, ko-faktörler, uyarıcı (eğer varsa) gibi burada açıklanan farklı olabilir, ve bu nedenle bazı optimizasyon gerekli olabilir. Bu protokol karakterize ATPaz'ları için temel bir çerçeve sağlar ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilir ve kolay gerektiğinde ayarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATPazlar, yaşamın tüm krallıklarındaki birçok süreçte ayrılmaz enzimlerdir. ATPazlar, protein kaçakçılığı, açılması ve birleştirilmesi gibi çeşitli reaksiyonlara güç sağlamak için ATP hidrolizinin enerjisini kullanan moleküler motorlar olarak işlev görür; replikasyon ve transkripsiyon; hücresel metabolizma; kas hareketi; hücre motilitesi; ve iyon pompalama1-3. Bazı ATPazlar, çözünen maddelerin zarlar boyunca taşınmasında rol oynayan transmembran proteinlerdir, diğerleri sitoplazmiktir ve plazma zarı veya organellerinki gibi biyolojik bir zarla ilişkilendirilebilir.

AAA+ ATPazlar (çeşitli hücresel aktivitelerle ilişkili ATPazlar), bazı dizi ve yapısal korumayı paylaşan büyük bir ATPaz grubunu oluşturur. Bu proteinler, Walker-A ve -B kutuları gibi korunmuş nükleotid bağlayıcı motifler içerir ve aktif durumlarında oligomerler (genellikle heksamerler) oluşturur1. Nükleotid bağlanması üzerine bu proteinlerde büyük konformasyonel değişiklikler, AAA + ailesinin çeşitli üyeleri arasında karakterize edilmiştir. EpsE, bir AAA + ATPazdır ve NTPaz4-6'nın bakteriyel Tip II / IV sekresyon alt ailesinin bir üyesidir. EpsE, koleranın etken maddesi olan Vibrio cholerae'de Tip II Sekresyona (T2S) güç sağlar. T2S sistemi, V. cholerae insan ince bağırsağını kolonize ettiğinde bol sulu ishale neden olan virülans faktörü kolera toksini gibi çok çeşitli proteinlerin salgılanmasından sorumludur7.

İn vitro ATPaz aktivitesini ölçmek için teknikler çeşitlidir, ancak genellikle kolorimetrik, floresan veya radyoaktif substratlar8-11 kullanarak fosfat salınımını ölçer. Serbest bırakılmış inorganik fosfatı (Pi) ölçen, ticari olarak temin edilebilen malakit yeşili içeren bir substrata dayalı bir kolorimetrik test kullanarak saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesini belirlemek için temel bir yöntemi açıklıyoruz. Düşük pH'ta malakit yeşil molibdat, Pi ile bir kompleks oluşturur ve kompleks oluşum seviyesi 650 nm'de ölçülebilir. Bu basit ve hassas tahlil, yeni ATPazları işlevsel olarak karakterize etmek ve potansiyel aktivatörlerin veya inhibitörlerin rollerini değerlendirmek, alanların ve/veya spesifik kalıntıların önemini belirlemek veya belirli tedavilerin enzimatik aktivite üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Saflaştırılmış proteinin ATP hidroliz reaksiyonu gerçekleştirme

  1. Saf Protein Kuluçka İçin Gerekli Tüm Reaktifler stokları hazırlayın.
    1. 100 mM HEPES pH 8.5, 65 mM NaCl ve% 5 gliserol (veya başka bir deney tamponu gibi uygun olduğunda) içeren 5x HEPES / NaCl / gliserol (KŞÇ) tamponu hazırlayın.
    2. Su (ATPaz metal bağımlı olup olmadığını, ya da başka metal), 100 mM MgCl2 hazırlayın.
    3. yüksek saflıkta ATP kullanılarak (daha fazla pH ayarı yoktur) 200 mM Tris Base taze 100 mM ATP hazırlayın. Kısım ATP zamanla yıkmak gibi, birkaç hafta daha uzun süre -20 ° C'de ATP stok depolamak ve dondurma ve ATP stok çözdürme kaçınmalı ve.
    4. 1 at Premix MgCl2 ve ATP: 1 oranında sadece ATP hidroliz reaksiyonu kurmadan önce.
  2. Hazırlayın ve reaksiyonun boyunca düzenli aralıklarla numuneler toplanması için 1.5 ml tüpler etiket. 0 zamanında ve zaman 15, 30 numune toplamak için tüpler hazırlamak,45 ve 60 dakika.
    Not: Alternatif olarak, sadece 0 ve uç noktada numune toplayın.
    1. ATP hidroliz reaksiyonları 01:50 alınan numuneler seyreltmek için her bir tüpe 245 ul 1x KŞÇ tampon ekleyin.
  3. hızlı reaksiyonu durdurmak için numunelerin dondurma için kuru buz etanol banyo hazırlayın. Bir lastik buz kovası veya diğer kasa (plastik olmayan) bir kapta, kuru buz birkaç adet ekleyebilir ve dikkatle kuru buz karşılamak için yeterli% 70-100 etanol dökün.
  4. Uygun (genellikle 5-10 uM) olarak, 1x KŞÇ tamponunda saflaştırılmış protein sulandırmak ve buz üzerinde tutmak.
  5. ATP hidroliz reaksiyonları ayarlayın.
    1. Her bir örnek için ayrı 0.5 ml tüpler içinde (sırayla) aşağıdaki reaktifler ekleyin: 6 ul 5x hng veya başka bir tampon, 3 ul 100 mM MgCl2 -ATP karışımı (nihai 30 ul hacme kadar), H2O, ve 0.25-5 uM proteini.
    2. Resim proteini ilave edildiği bir tampon yalnızca negatif kontrol koşulu içerir.
  6. 0 zamanında reaksiyon 5 ul çıkarın 245 ul KŞÇ tampon içeren hazır 1.5 ml tüp içinde 1:50 seyreltilmiş ve hemen kuru buz / etanol banyosu içinde örnek dondurma.
  7. 37 ° C 'de reaksiyonlar ATP hidrolizi, 1 saat boyunca oluşmasına izin vermek için inkübe edin. Her bir aralık (15, 30, 45 ve 60 dakika), tepkime 5 ul alikotları çıkarın ve adım 1.6 olarak KŞÇ tampon içeren etiketli numune tüpleri ekle.
  8. ATP hidroliz reaksiyonunun sonunda, depolama için bir -80 ° C dondurucu seyreltilmiş numune hareket eder. tüm örnekler tamamen donmuş sağlamak için, devam etmeden önce en az 10 dakika bekleyin.

Algılama Reaktif Ücretsiz Pi İçeren 2. inkübe Örnekleri

  1. Her bir zaman noktasında ATP hidroliz reaksiyonu kısımlarını ihtiva eden çözülme seyreltilmiş numuneler, oda sıcaklığında (adım 1.6 ve 1.7 de elde edilmiş).
  2. örnekler ve fosfat standartları ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka kurulumu.
    1. 0.5 ml tu800 uM standart ul 104.5 ile KŞÇ tampon 5.5 ul ekleyerek 800 uM uM 40 ila (Pi algılama reaktifi ile sağlanır) fosfat standardını sulandırmak olmak. İyice karıştırın ve 96 oyuklu bir plaka de A1, bu 40 uM Pi standart 100 ul ilave edin.
    2. 1 için kuyuların B1-H1 50 ul KŞÇ tamponu ekleyin: Pi standardının 1 seri dilüsyonları.
    3. A1 kuyusunda 40 uM Pi 50 ul çıkarın ve iyi B1 50 ul deney tamponu eklemek karıştırın ve iyi B1 50 ul kaldırmak ve iyi G1 ile, iyi C1 devam dilüsyonları ekleyin. Her kuyu aynı hacme sahip olmak için karıştırmadan sonra kuyu G1 50 ul atın. Peki H1 40 0 ​​uM bir Pi standardı oluşturmak için tek tampon içermelidir.
      Not: bir diğer faktör (örneğin, bir önleyici olarak) numunelere ilave edilmişse, bu koşullar altında fosfat serbest ya absorbans değişiklikleri kontrol etmek için bu faktör içeren bir standart eğri oluşturmak.
    4. Her samp 50 ul ekleplaka yinelenen le. ve farklı zaman noktalarında yatay sütunlar aynı zaman noktasında dikey (Numune 2 kez 0 = B2, B3 örnek 1 kez 0 = A2, A3) numune ekleyin. Bu kadar 8 örnekleri ve plaka başına 5 kez puan için izin verir.
  3. Numuneler ve standartlar içeren oyuklara (reaktif gerekli (mi) = numune ve standartlar 0,1 x sayısı) her birine, 100 ul kadar malakit yeşili / molibdat Pi tespit reajanı kaldırmak için steril bir pipet kullanın ve kolay pipetleme için bir çanak ekle Çok kanallı bir pipet kullanılarak. Pi kirlenme olasılığı yüksektir olarak, çanak içine doğrudan algılama reaktifi dökmeyin.
  4. Bir çok kanallı pipet kullanarak, ilk kez noktalarına son kez noktalarından tercihen sırayla, tanıtan kabarcıkları olmadan dikkatlice yukarı pipetleme ve zaman tutarlı bir sayıya indirdi de her Pi algılama reaktif 100 ul ekleyin ve karıştırın.
  5. Oda sıcaklığında 25 dakika boyunca inkübasyona bırakılır, veya MA görenufacturer en tarifi.

Bir Mikroplaka Okuyucusu Kullanma 3. ölçmek Sonuçları

  1. absorbans mikro levha okuyucusu kullanarak 650 nm'de numunelerin emme okuyun.
  2. Bir Pi standart eğri olun. Bir grafik yazılımı kullanılarak, her bir örnek fosfat miktarı için çözmek için kullanılan denklem bulmak için konsantrasyonuna karşı Pi, standart numune için absorbans değerleri grafik.
  3. fosfat standart kalibrasyon her numune için ATPaz aktivitesinin hesaplanması. Fosfat yayınlandı = (OD 650 - Y kesişimi) / eğim.
    1. Her numunenin çiftleri toplam Pi ortalama. Bu numaradan tampon sadece denetimin absorbans okuma çıkartın. seyreltme faktörü ile (bizim örneğimizde 50) bu çarpın.
    2. ľmol protein başına salınan nmol Pi belirleyin. Kinetik deneyde, her bir zaman noktası için, bu değerleri grafik en az R = 0.99 (şekil 1) doğrusal uyan vermelidir; n iseOT, deney veya daha az protein ya da daha uzun veya daha kısa kuluçka süresi ile ayarlanabilir.
  4. Nmol Pi / umol protein / dak gibi sonuçları istenirse, ya da nmol Pi / mg protein / dak olarak (3 Şekil 2,) temsil eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T2S ATPaz EPSE in vitro aktivitesi sitoplazmik EpsL (EPSE-cytoEpsL) alanında ve asidik fosfolipid kardiyolipin 12 ilavesi ile EPSE bölgesinin copurification ile stimüle edilebilir. Deney kullanılarak protein varyant formlarının vahşi tip (WT) etkinliğinin kıyaslanmasıyla ATP hidroliz özellikle EPSE kalıntılarının rolü belirlemek için de mümkündür. Burada, EPSE, çinko bağlayıcı alan olarak iki lisin artığına ikame etkisi EPSE K417AK419A-cytoEpsL varyantına saflaştırıla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu biyokimyasal karakterizasyonu için saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesi ölçüm için genel bir protokoldür. Bu yöntem kolayca optimize edilmiştir; Örneğin protein, tampon ve tuzlu bileşimlerinde, sıcaklık ve deney uzunluğu ve değişken (aralıklarının toplam sayısını da dahil olmak üzere), aralıklarla miktarının ayarlanması aktivitesi kantitatif artırabilir. Ticari olarak temin edilebilen malakit yeşili bazlı reaktifler oldukça duyarlıdır, ve fosfat az miktarda tespit edilebilir (~ 100 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe RO1AI049294 (M. S.'ye) fon sağlamak istiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HEPES tamponuFisherBP310-500
Sodyum klorürFisherBP358-212
Magnezyum klorürFisherBP214-500
Adenozin trifosfat (ATP)FisherBP41325
96 oyuklu plakalar (şeffaf, düz tabanlı)VWR82050-760
BIOMOL GreenEnzo Life SciencesBML-AK111Tercih edilen fosfat tespit reaktifi. Dikkat: tahriş edici.
Mikroplaka okuyucuBioTek Synergy veya karşılaştırılabilir
Prism 5GraphPad Yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
  2. Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
  3. Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
  4. Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
  5. Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
  6. Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
  7. Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
  8. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  9. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  10. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
  11. Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
  12. Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
  13. McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
  14. Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
  15. Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
  16. Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
  17. Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
  18. Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
  19. Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
  20. Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Vitro AnalizFosfat TespitiMalakit Ye iliATP HidroliziProtein Safla t rmaKinetik AnalizU Nokta AnaliziKolorimetrik AnalizAbsorbans l m

İlgili makaleler