Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Özet

Bir proteine bir etiket eklemek, onun işlevi hakkında fikir edinmenin güçlü bir yoludur. Burada, yüzlerce Trypanosoma brucei proteinini paralel olarak endojen olarak etiketlemek için bir protokol açıklıyoruz, böylece genom ölçeği etiketlemesi elde edilebilir.

Özet

Kütle spektrometresi, dizileme ve biyoinformatikteki gelişmeler, potansiyel olarak ilginç genlerin büyük veri kümelerini oluşturmuştur. Bu proteinlerin etiketlenmesi, hücre içindeki lokalizasyonlarını belirleyerek ve etkileşim ortağı tanımlamasını sağlayarak işlevleri hakkında fikir verebilir. Kısa bir süre önce, endojen lokustan etiketli bir proteini eksprese eden Trypanosoma brucei hücre dizileri oluşturmak için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem yayınladık. Yöntem, uzun primer PCR ile birleştiğinde, her iki terminalde de etiketlenmiş bir proteini kodlamak için bir geni modifiye etmek için kullanılabilen, ürettiğimiz bir plazmide dayanıyordu. Bu, düzinelerce tripanozom proteininin paralel olarak etiketlenmesine izin vererek, ilgilenilen aday genlerin büyük ölçekli doğrulamasını kolaylaştırır. Bu sistem, proteinleri lokalizasyon (bir floresan proteini, epitop etiketi veya elektron mikroskobu etiketi kullanılarak) veya biyokimya (TAP (tandem afinite saflaştırması) etiketi gibi saflaştırma için etiketler kullanarak) etiketlemek için kullanılabilir. Burada, 24 oyuklu plakalarda meydana gelen transgenik tripanozomların geri kazanımı ve seçimi ile 96 oyuklu plakalarda uzun primer PCR ve elektroporasyonu gerçekleştirmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu iş akışı ile yüzlerce protein paralel olarak etiketlenebilir; Bu, önceki protokolümüze göre büyük bir iyileştirmedir ve genom ölçeğinde etiketleme artık mümkündür.

Giriş

Trypanosoma brucei sığır insan Afrika trypanosomasis ve nagana neden olan bir protozoon bir parazittir. T. brucei nedeniyle yüksek kaliteli genomu, çok sayıda proteomik ve transkriptomiks veri setleri ve iyi gelişmiş moleküler araçlar ^1-3 kombinasyonu protein fonksiyonunun analizi için ideal bir organizmadır. Proteomik ve sıralama gelişmeler potansiyel olarak ilginç genlerin ^4-6 vurgulamak büyük veri kümelerinde sonuçlandı; Ancak, pek çok gen mevcut veritabanlarında kendileriyle ilişkili çok az bilgi var. Protein fonksiyonel karakterizasyonu yardım etmek için yüksek verimli bir yönteme ihtiyaç duyulmaktadır.

etiketli bir proteinin ifade bir proteinin fonksiyonundan içine anlayışlar çokluğu verebilir. Örneğin, bir flüoresan protein veya epitopu ile etiketlenmiş bir proteini PROT hakkında bilgi verir floresan mikroskobu ile lokalize edilebilirEin biyolojik etkisini uygularken olabilir. Seçenek olarak ise, bir musluk ⁷ ile etiketlenmiş bir protein, HaloTag ⁸ veya His etiketi biyokimyasal tahlillerde ve etkileşimi ortaklarının tespiti için arıtılabilir.

Biz son zamanlarda T. için sağlam bir etiketleme yöntemi geliştirmiştir brucei ^9. Bu transfeksiyon için DNA oluşturmak için uzun astar PCR kullanılan ve paralel proteinlerin onlarca etiketleme izin - Mevcut protokollerine büyük bir gelişme. Biz şimdi bir büyüklük sırasına göre procyclic formlarda bu protokolün ölçeklenebilirlik düzeldi. Burada biz, 24 yuvalı plakalar içinde meydana gelen geri kazanım ve seçim ile 96 gözlü plakalara PCR ve transfeksiyon gerçekleştirmek eden bir yöntem sunulmaktadır. Proteinlerin yüzlerce artık paralel olarak etiketlenmiş üzere bu yöntem tüm tripanozom genomunu etiketleme için bir maliyet-etkin ve uygulanabilir bir yöntem sağlar.

Protokol

1. 96-kuyu Uzun Primer PCR

1. -80 ° C derin dondurucuda Öncesi donma 96-PCR soğutucu.
2. 10 ml'lik bir tüp içinde, ana karışım A hazırlanması: 2100 ul GKD ₂ O, 105 | il PCR sınıf DMSO, plaka başına 2.415 | il lik toplam hacim 105 ul 10 mM dNTP, 105 ul pPOT şablonu (25 ng / | il), ^9, .
3. Kısım 96 gözlü PCR plakanın her oyuğuna 23 ul.
4. Her bir P20 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak iyi yüklenmiş primerler toplanmış 100 mcM 2 ul ekleyin. Önceden soğutulmuş PCR soğutucu filmin, plaka ile kapatılır ve 80 ° C'de 20 dakika en az dondurmak için izin verir.
5. 10 ml'lik bir tüp içinde, ana karışım B hazırlanması: 2.048 ul GKD ₂ O, 525 ul 10x tampon, plaka başına 2.626 | il lik toplam hacim için 52.5 ul polimeraz.
6. -80 ° C dondurucu plaka ve PCR soğutucusunu çıkarın.
7. PCR soğutucusu hala plakalı, dondu üstünde 25 ul Master Mix B ekleyinn Ana Karışım 50 ul toplam reaksiyon hacmi için. Bu sefer kritik olduğunu ve Mix A çözülme önce tamamlanmalıdır. film ile plaka mühür.
8. aşağıdaki şekilde termal döngü ayarlayın: 10 dakika boyunca 94 ° C, daha sonra, 7 dakika boyunca 72 ° C'lik bir son uzatma süresi ardından 2 dakika 15 saniye, 30 saniye için 65 ° C, 72 ° C, 94 ° C'de 30 döngü .
9. Blok 94 ° C ulaştıktan sonra PCR plaka yükleyin.

96-kuyu Uzun Primer PCR 2. Doğrulama

1. Büyük bir% 1 döküm Tris asetat EDTA (TAE) 'de agaroz jel (w / v), 4 x 28 oyuklu tarakla çalışan tampon kuyu 4 satır ile bir jel elde edildi. 12 kanal çok kanallı pipet uçları ile tarak alternatif dişleri aynı hizaya getirin. şeritleri yüklendikten sonra dikkatli bir şekilde çalışan tampon TAE jel daldırın.
2. ^1. ve ^28. sıra her satır yükleyin 1 kb DNA merdiveni.
3. Bir P20 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak, PCR ürünü dir 2 ul transferiectly jel (Şekil 1A) her şeride. amplıkonları kirlenmesine neden olma olasılığını azaltmak için hızla yapın.
   1. (- Şerit 3, A2 - şerit 5 ...... A11 - şerit 23, A12 - şerit 25 A1) ve PCR ürünleri yüklemek jel 1 satır tek numaralı şerit içine PCR plaka satır A PCR ürünleri yüklemek jel ^1. satır bile sayılı şeride PCR plaka satır B (B1 - kulvar 4 A2 - şerit 6 ...... B11 - şerit 24, B12 - şerit 26).
   2. Çift sayılı şeride sayılı kulvarlar ve satır D tek olarak satır C, yukarıda tarif edildiği gibi, aynı kalıp kullanılarak PCR levhanın sıralı C ve D, PCR ürünleri yükleyin. PCR plaka her bir jel üzerine yüklenir kadar bu yükleme modeli devam edin. DNA, yükleme tamponu Bu jel yüklemek için gerekli değildir.
4. koşu tankına jel yerleştirin ve jel batık kadar tampon çalışan TAE ile deposunu doldurun. 30 dakika boyunca 100 V'ta tutuldu veUV transilluminator kullanarak görselleştirmek. Örnek jel Şekil 1B'ye bakınız.
   Not: PCR ürünleri birkaç hafta Transfeksiyondan önce -20 ° C'de muhafaza edilebilir

3. 96-çukurlu transfeksiyonu

1. T. kullanın brucei procyclic formu hücre hattı bu prosedür için SMOXP9 ¹⁰ ve FCS ^10% 10 içeren SDM-79 medya büyür.
2. Transfeksiyon başına 1 x 10 ⁷ hücre kullanın (1.1 x 10 ⁹ hücrelerinin toplam) N proteinin terminalinden ve transfeksiyon başına 2 x 10 ⁷ hücreleri üzerinde etiketleme (2.2 x 10 ⁹ hücrelerinin toplamı) C terminali üzerindeki etiketleme protein. Transfeksiyondan önce birkaç gün orta log (1.2 x 10 ⁶ -1 x 10 ⁷ hücre / ml), hücrelerin korumak ve 5-8 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir yoğunlukta hücreler transfeksiyon için hasat edilir.
3. Transfeksiyon için, dondurulmuş PCR ürünleri, oda sıcaklığında çözülmesine izin verir.
4. Bir haem kullanarak hücrelerin sayısıocytometer veya otomatik hücre sayacı.
5. 10 dakika boyunca 800 x g'de birden fazla 50 ml tüpler içinde, hücre topağından gerekli sayısı.
6. Santrifüj atmak yüzer sonra 10 ml hücrelerin tekrar süspansiyon modifiye cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCI, 0.15 mM _CaCl2, 10 mM potasyum fosfat tamponu pH 7.6, 25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 2.6 mM _MgCl2, % 0.5 (a / h) glukoz, tüp başına 100 ug / ml BSA, 1 mM hipoksantin, 144 mM sükroz). tek bir tüp bütün hücre çözüm aktarın ve 10 dakika boyunca 800 x g hızında tekrar döndürür.
7. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve 5 x 10 ⁷ hücre / ml'lik bir son konsantrasyon için modifiye cytomix 23 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
8. Hücreler eğirme iken, 4 x 24 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna SDM-79 ortam 1 ml. Plakalar AD Etiket ve plaka yönünü yardımcı olmak için kalıcı bir kalem her tabakta etrafında iyi A1 bir halka çizin.
9. Elektroporatör plaka işleyicisi bağlayın. electropora üzerindetor birimi 1500 V gerilim, 100 mikro-saniyeye darbe uzunluğu ve 12 darbe sayısını ve 500 msn darbe aralığını ayarlamak. plaka işleyicisi, bu o Electroporator elektroporasyon plakasının 12 sütun her tek bir darbe uygulamak olmasını sağlar 1'e darbe sayımı ayarlayın.
10. P200 12 kanalı çok kanallı pipet kullanarak, 96 oyuklu tek elektroporasyon plakaları, 4 mm bir boşluk PCR plakadan PCR reaksiyonları aktarın.
11. Hücreler, döndürülmüştür edilmiş ve 5 x 10 ⁷ hücre / ml (Aşama 3.7) nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edilir zaman, reaktif hazneye aktarılır. Pipet P200 12 kanalı çok kanallı pipet kullanılarak elektroporasyon plakanın her oyuğuna hücre çözeltisinin 200 ul, pipetleme PCR ürünü ile karıştırın.
12. doku kullanarak kısa devreyi önlemek için levhanın üstüne herhangi damlaların çıkarılması.
13. elektroporasyon plaka, pos üstüne plaka ambalajında ​​sunulan sızdırmazlık sürünBunu itioning her sütunun üst ve alt kısmında ortaya elektrotlar için delikler bırakmak üzere. filmi rehberlik etmek için kullanılan yükseltilmiş noktaları kapsayan kaçının.
14. Plaka işleyicisi içine elektroporasyon plakasını yükleyin ve kapağını kapatın. Electroporator ünitesindeki Basın 'Darbe'.
15. Elektroporasyondan sonra, hızlı bir şekilde 4 x 24 oyuklu doku kültür plakalarına 96 oyuklu elektroporasyon hücreleri plakadan aktarın. Hücreleri aktarmak için, her uç eksik olan bir P200 12 kanal çok kanallı pipet kullanın gibi kalan 6 ipuçları 24-iyi doku kültürü plakası üzerinde 6 satır ile hizaya söyledi. 24 oyuklu doku kültür plakaları (Şekil 2A) için önceden belirlenmiş bir modelde 96 oyuklu electroporations plakalarda Elektroporasyona tabi tutulan hücreler aktarın.
16. P200 pipet uçları hazırlayın - Her 96-kuyu transfeksiyon kaldırıldı her sütun ile 96 ipuçları 2 kutu hazırlamak için.
    1. 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde Transferi kuyuları A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 içinSatır B içine 24-iyi doku kültürü plakaları bir satır A, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 plaka, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 satır C içine ve D1 / D3 / D5 / D7 24 plaka 96 oyuklu plaka 6 kuyu her bir grubu transfer edildikten sonra satır D içine / D9 / D11, 96 oyuklu bir plaka içerisinde Kaynaklar akabinde de 24 karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır çukurlu plaka ve yıkama daha sonra 24 oyuklu plaka oyuklarına geri aktarılmaktadır.
    2. Satır B içine E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde 24 plaka B satır A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 transferi kuyuları, G1 / G3 / G5 / 96 satır C ve H1 / H3 / H5 / H7 / H9 24 plaka için 96-plaka 6 kuyu her set transfer edildikten sonra sıra D içine / H11, kuyu içine G7 / G9 / G11 eh plaka daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır.
    3. 24 plaka Cı satır A, B2 / B4 / B6 / B 96 oyuklu elektroporasyon plaka Aktarım kuyu A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12 sıra B içine, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 sıra C ve 96 6 kuyuların her set transfer edildikten sonra sıra D içine D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 içine 24 oyuklu plakaya eh levha, 96 oyuklu bir plaka içerisinde kuyular daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır.
    4. Aktarım kuyuları E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24-plaka D satır A 96-kuyu elektroporasyon plaka üzerinde, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / satır B içine F12, G2 / G4 / G6 / satır C içine G8 / G10 / G12 ve H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 satır D. içine 24 plaka için 96-plaka 6 kuyu her set transferinden sonra, 96 kuyu eh plaka daha sonra 24 oyuklu plaka karşılık gelen kuyu ortamı ile yıkanır ve yıkama, sonra 24-çukurlu plaka içindeki yuvalara geri aktarılmaktadır.
17. ters bir faz kontrast mikroskop kullanarak hücreleri kontrol etmek için her sütundan iyi 1 inceleyin. Bir canlı ve ölü hücreleri bir karışımı olacaktırHücre kalıntılarının önemli miktarda. Onlar faz kontrast mikroskobu altında parlak olacak ve hareket edilecektir çünkü canlı hücreler ölü hücrelerden ayırt edilebilir.
18. sıkı bir mühür oluşturan bir kapak ile bir temiz plastik bir kutu içinde, 24 kuyucuklu plaklar yerleştirin. 28 ° C inkübatör kutuyu koydu.
19. HR 6-8 arasında, daha sonra her bir oyuğa 2x seçici antibiyotiği içeren% 10 FCS ile SDM-79 1 ml. Deneyimlerimize göre, genler, N terminalinden etiketlendikten hücre çizgileri seçici ilacın daha yüksek konsantrasyonlarına karşı dirençlidir. Bu nedenle, N-terminaline etiketleme, örnek olarak Blasticidin kullanılarak mi ve C terminali üzerindeki etiketleme / ml Blasticidin 10 ug bir son konsantrasyon gerektiren blastisidin / 20 ug bir son konsantrasyon gerektirmektedir.
    Not: Transgenik hücre hatları transfeksiyondan sonra görünür 9-10 gün olacak.
20. En az iki kez, taze ilaç ve medya analizden önce geçit. Şekil 2B, tipik bir 96 oyuklu transfe sonuçlarını gösterirN ucundan 96 farklı proteini etiketlenmesi için ction. sağlıklı, ilaca dirençli hücreler içerip içermediğini belirlemek için faz kontrast mikroskobu ile de her değerlendirin. Sağlıklı bir kuyu faz sözleşme mikroskopi parlak ağırlıklı (<% 95) yüksek derecede aktif hücreleri içerir. Epifloresans mikroskobu veya western blot ile sonraki analiz proteini başarıyla etiketli olup olmadığını belirlemek için gereklidir.

Sonuçlar

Bu temsilci transfeksiyon, primerler TagIT Perl ⁹ kullanılarak tasarlanmış ve ticari sentezlendi. 96 gözlü PCR yapılmış ve tarif edildiği gibi (Şekil 1A) halinde doğrulandı; Bu örnekte, 95/96 PCR (Şekil 1B) başarılı olmuştur. Bizim tecrübelerimize göre, başarılı bir PCR yol açmaz orijinal astar veya yeniden sentezlenmiş primerler ile ya başarısız tepkileri tekrarı.

Amplikonlar elektroporasyon (Şekil 2A) için 96-çukurlu elektroporasyon plakalara aktarılmış ve daha sonra geri kazanımı ve seçim için 24 oyuklu bir kültür plakalarına aktarılmıştır. Seçim oluşmasına izin vermek için yeterli bir süre sonra, kaynaklar daha fazla analiz öncesinde hayatta kalmak için değerlendirildi. Bu örnekte, 88/96 kuyular (% 92) 15 gün sonra seçim pozitif.

Şekil 1:. PCR doğrulama için agaroz jel 96-PCR plaka PCR ürünleri aktarmak için uzun astar PCR (A) Pattern Doğrulama. (B), N terminalinden 95 genleri etiketleme için temsili bir 96 gözlü PCR doğrulama jeli ve transfeksiyon bir negatif kontrol olarak hareket etme 5 hedefleme homoloji ihtiva eden 1 amplikon. Numuneler% 1 üzerine yüklenmiş (w / v) agaroz jel ve 30 dakika boyunca 100 V çözümlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: 96 oyuklu elektroporasyon ve seçme 96 oyuklu elektroporasyon topraklarda gelen Elektroporasyona tabi tutulan hücreler aktarılması için (A) Modeli.24 oyuklu doku kültür plakalarına örn. (B) şematik bir 24-yuvalı plakalar içinde bir seçim 15 gün sonra, tipik bir ölü / canlı puanlama gösteriliyor. Yeşil gri sadece ölü hücreleri ile iyi bir temsil, başarılı bir transfeksiyon temsil eder. Bu örnekte, kuyuların 88/96 (% 92) başarılı bir şekilde transfekte parazitler içeriyordu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Son 5-10 yıl içinde proteomik ve transkriptomik yöntemlerinin duyarlılığı dramatik gelişmeler genler ve bunların ürünlerinin binlerce değerli veriler sağlamıştır. Ancak, araçlar bu proteinlerin fonksiyonu ayak uyduramadı adresi.

Bir protein etiketlenmesi işlevini belirlemek için çok sayıda deney kolaylaştırır. Örneğin, bir protein lokalizasyonu ve ko-lokalizasyon çalışmaları kolaylaştırmak için farklı renklerin çeşitli bir floresan protein kaynaştırılabilir. Etiketler Böyle APEX2 veya miniSOG ^11,12 olarak elektron mikroskobu, için geliştirilmiş, etiketli protein ultrastrüktürel lokalizasyonu izin verir. Böyle TAP etiketi ve ProtC-TEV-Prota (PTP) olarak biyokimya için Etiketler ^7,13 bağlayıcı ortakların belirlenmesi için ya da in vitro biyokimyasal tayinlerde protein ile ilişkili komplekslerin saflaştırma izin etiketleyin.

protoc başarısı için kritik olan belirli adımlarPCR Master Mix 1'e DMSO eklenmesi Master Mix 2 Master Mix 2 ticari polimeraz kullanımı ve cytomix elektroporasyon tamponu modifikasyon ilavesinden önce PCR Master Mix 1 dondurma: ol vardır. Deneyimlerimize göre, pozitif olan kaynaklar benzer bir oranını elde etmek için N-terminal etiketleme Transfeksiyonlar için de C ucu etiketleme Transfeksiyonlar için hücreleri iki kat kullanmak gereklidir. tarif edildiği gibi nedenle, tüm adımları yapılmalıdır.

Bu teknik böcek procyclic formu tripanosom transfecting zaman başarılı olmak için sadece muhtemeldir. Kan akımı formları ayrıca onlar yüzünden seçici ilaç ilgisi yoktur yoğunluk bağımlı toksisite seçimi sırasında ölme olasılığı, düşük transfeksiyon verimi ¹⁴ var. Bu nedenle, önceki protokol kan formu tripanozomlann ⁹ etiketleme için mevcut en iyi teknolojiyi temsil eder. Ayrıca, trans-olasıdırFection verimlilik belirli bir tripanosom izolatı bağlı olarak değişecektir. Diğer türler ek optimizasyon gerektirebilir - Bu protokol 927 SMOX procyclic formları kullanarak optimize edilmiştir. başarı olasılığını arttırabilir tedbirler şunlardır: PCR amplikonu miktarını artırarak transfeksiyon dahil edilen hücre sayısı artmaktadır.

Biz proteinlerin yüzlerce paralel olarak etiketlenmiş edilebilecek bir yöntem mevcut. Bu mevcut büyük veri setlerini tamamlayıcı ve topluma çok değerli bilgiler veren, yerelleştirme ve etkileşimi büyük ölçekli çalışmaları kolaylaştıracaktır. Primer şablonları istek ve plazmidler şablonlar listesinde üzerine mevcuttur edinilebilir: http://www.sdeanresearch.com/

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Oligonükleotid	Life teknolojileri	yalnızca	tuzdan arındırma (ek arıtma kullanmayın)
DMSO	Roche	Expand HiFi paketine dahildir	PCR sınıfı
dNTP	olmalıdır herhangi bir saygın
Expand HiFi polimeraz	Roche	11759078001
BTX ECM830	Harvard Aparat Elektroporatörü
HT-200 plaka işleyici	Harvard Aparatı	HT-200	96 oyuklu eletroplate'leri tutar
MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm	Harvard Aparatı	45-0452	96 oyuklu elektroporasyon için elektrolizle
Blasticidin S Hidroklorür	Melford	3513-03-9
Higromisin b Altın	İnvivojen	ant-hg-1
Fleomisin	Melford	P0187
225 cm TC Şişe, eğimli boyunlu, fenolik kapaklı	Appletonwoods	BC006
24 kuyulu kültür	plakaları Appletonwoods	BC017
Eppendorf® PCR Soğutucu, 96 kuyulu plakalar ve PCR tüpleri için buzsuz soğuk hava deposu sistemi	Sigma Aldrich	Z606634-1EA
96 kuyulu Multiply® Yan etekli PCR plakası	Sarstedt	72.1979.203