Yöntem makalesi

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

8.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54343

⸱

8 Ağustos 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Bu makalede

Özet

etkili bir tütün konakçı hücre proteinleri (HCp'ler) arasında% 90'dan daha fazla kaldırma çöktürme yöntemler sunulmuştur üç ısı başka saflaştırma aşamasından önce ayıklar. Bitki HCp'ler tersinmez 60 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda bir araya getirir.

Özet

Bitkiler insanlar için yiyecek, yem ve hammadde sağlamak değil, aynı zamanda bu antikorların, aşı adayları ve enzimler gibi biyofarmasötik proteinler, ekonomik bir üretim sistemi olarak geliştirilmiştir değil sadece. Bu bitki biyokütlesinin saflaştırılması gerekir, ancak kromatografi aşamaları, bitki ekstrelerinde konakçı hücre proteinleri (HCp'ler) yüksek konsantrasyonlarda girmesi engellenir. Bununla birlikte, çoğu HCp'ler geri dönüşü olmayan hedef proteinin daha sonraki saflaştırmayı kolaylaştıran 60 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda bir araya getirir. Burada, üç yöntem sağlam yapraklar ya da özleri ya tütün CYp'lerine ısı yağış elde etmek için sunulmuştur. bozulmamış yaprakların blanching kolayca mevcut süreçlere dahil edilebilir ancak sonraki filtrasyon adımlar üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. tersi gibi proses ekipman tasarımı büyük değişiklikler ile de olsa alt işlemleri performansını artırmak, karıştırılan kap içinde, yaprak ekstreleri ısı çökeltilmesi için de geçerlidirhomojenleştirici geometrisi. Son olarak, bir ısı değiştirici kurulumu iyi ısı transfer koşulları açısından karakterize ve ölçek kolay, ama temizlik zor olabilir ve filtre kapasitesi üzerinde olumsuz bir etki olabilir edilir. Tasarım-of-deneyler yaklaşımı HCP kaldırma ve ürün kurtarma etkileyen en uygun proses parametrelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu, diğer sentezleme platformlarda her yöntemi ve belirli bir saflaştırma stratejisi için en uygun yöntem tanımlanması uygulamayı kolaylaştırır.

Giriş

Modern sağlık sistemleri giderek biofarmasötik proteinler 1 bağlıdır. Bitkilerde bu proteinlerin üretilmesi bilinen ekspresyon sistemleri 2-4 ile karşılaştırıldığında, düşük patojen yükü ve ölçeklenebilirlik avantajlıdır. yıkıcı çıkarma prosedürleri bulanıklıkları 5000 nefelometrik bulanıklık üniteleri (NTU) aşan ve konak hücre proteini (HCP) konsantrasyonları genellikle 95 aşan, yüksek parçacık yükü neden Ancak, bitkisel kökenli ilaçların aşağı işleme (DSP) zor olabilir % [m / m] 5,6.

Ayrıntılı açıklama prosedürleri dağınık parçacıklar 7-9 kaldırmak için gerekli, ancak kromatografi cihazı CYp'lerine 10,11 verimli çıkarılması için önceki bir adım varsa, ilk ürün kurtarma sırasında bağlama-ve-uzaklaştırma modunda çalışmaya daha pahalıdır vardır. Bu floccul kullanılarak hedef protein çökeltme yoluyla elde edilebilirkarıncalar 12 ya da düşük pH 13,14 yanı sıra HCp'ler araya neden olarak. Ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilaz / oksijenaz (RUBISCO), tütün (Nicotiana tabacum), yeşil bitkilerde en bol HCP, seçici çekiş polietilen glikol 15 eklenmesi ile geliştirilebilir, ancak bu, pahalı ve geniş ile uyumsuz olabilir ölçeğindeki üretim. Isıl işlem örneğin Vax8 protein sıtma aşısı adayları çözelti 16-18 kararlı kalırken, denatüre ve tütün CYp'lerine fazla% 95 çökeltilmesi için gösterilmiştir.

Sıcaklık kontrollü bir kap karıştırılır (ii) (i) beyazlatma, örneğin, sıcak sıvı içinde sağlam yaprak daldırma, ve (iii) bir ısı eşanjörü (: Üç farklı yaklaşımlar, tütün CYp'lerine ısı kaynaklı çökelmesini elde etmek için kullanıldı Şekil 1) 16. sağlam yaprakları, CYp'lerine hızlı ve verimli yağış elde etti ve aynı zamanda kolay gerçekleştirilen ağartmabüyütmek ve bitki biyokütlesi 19 yıkamak için bir başlangıç ​​aşamasını içerir mevcut büyük ölçekli üretim süreçleri ile uyumlu için. Bunun aksine, sıcaklık kontrollü DAMARLARIN bazı proseslerde kullanılabilir ve tank yüzey-hacim oranı, giderek azalır, çünkü bitkinin ısıl işlem 20 özler, ancak ölçeklenebilirlik ve enerji transferi hızı sınırlıdır için kullanılabilir ve süreç ölçeğinde uygun hale gelir. Bir ısı değiştirici de karıştırma kazanları ısıtıldı için teknik olarak iyi tanımlanmış bir alternatiftir ancak ısıtma ve soğutma ortamı, örn, buhar ve soğuk su bol miktarda bir kaynağı gibi ısı değiştirici geometrisine adapte edilmiş bir sıkı bir şekilde kontrol hacimsel akış hızı gerektirir medya özellikleri, örneğin., özgül ısı kapasitesi. Bu makalede, tüm üç yöntem, genel olarak, tütün CYp'lerine ve bitki CYp'lerine ısı kaynaklı çökeltme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. kurulması ve EAC operasyonbir laboratuvar ortamında H yöntemi büyük ölçekli işlemler için uygunluklarını değerlendirmek için de kullanılabilir. büyük bir sorun süreci ölçekli üretim sırasında kullanılan cihazlar ve şartları andırır her işlem için yeterli ölçek aşağı modelleri ve çalışan koşullarını tespit etmektir. Burada sunulan veriler DsRed 16 sıtma aşısı adayı Vax8 floresan proteini ifade eden transgenik tütün bitkileri ile yapılan deneyler bakınız, ancak yöntem de başarılı N'ye uygulanmış benthamiana bitkiler geçici diğer biofarmasötik proteinleri 21 dile getirdi.

Bir tasarım-of-deneyler (DoE) işlem gelişimini kolaylaştırabilir 22 yaklaşım ve daha önce 8 açıklandığı gibi 23 de bu bağlamda yararlı olabilir flokülantlar. , Haşlama ısıtmalı kap ve eşanjör arasındaki temel fark bu beyazlaşma ot ise sürecin başlarında sağlam yapraklara uygulanan bironun bitki ekstreleri (Şekil 1) uygulanır.

figure-introduction-1
Şekil 1:. Tütün HCP Isı Yağış Üç Farklı Yöntemlerle uygulanmasını gösteren Süreç Akış Şeması bitki materyali yıkanmış ve açıklama ve arıtma önce homojenize edilir. ağartma adımı (kırmızı) için donatım kolayca mevcut makinelerin eklenebilir. Buna karşılık, bir karıştırılan gemi (turuncu) ve özellikle eşanjör (mavi) kullanarak bir veya birden fazla ek aygıtlar ve boru gerektirir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Tütün bitkileri yetiştirmek

  1. 0.1 [% ağırlık / hacim] gübre çözeltisi 1 I 1 L deiyonize su 2'ye ve daha sonra her bir mineral yün blok yıkayın. Bir tütün her mineral yün bloğunda tohum ve tohum 16 yıkayarak olmadan gübre çözeltisi 0.25 L nazikçe yıkayın yerleştirin.
  2. % 70 nispi nemde bir serada, 16 saat fotoperiyot 7 hafta içinde tütün bitkileri yetiştirmek (1 - m - 180 umol sn 2; λ = 400-700 nm) ve 25/22 ° C açık / koyu sıcaklık rejimi.
  3. Bitki kök dibinde bulunan dört kotiledon yaprakları hariç tüm yaprakları hasat.

2. İsteğe bağlı: Isı Yağış Ağartma tarafından

NOT: beyazlaşma tütün Onör puanı çöktürmek için 2.12 adımlarla 2.1 açıklanan adımları uygulayın. CYp'ler çöktürülmüş olması durumunda, tüm bölüm 2 atlaısıtılmış kaba (bölüm 4) ya da bir ısı eşanjörü (bölüm 5) kullanarak.

  1. bitki materyali kenara 50 g Set ve (bölüm 3) beyazlaşma olmadan çıkarma yürütmek. sonraki analiz (bölüm 7) sırasında iç kontrol olarak bu özü bir örnek almak.
  2. Bir ısı yalıtımlı polistren köpük kova veya benzer bir 8-L çalışma hacimli su banyosu, örneğin, 50 x 40 x 40 cm, ayarlayın. sonraki sıcaklık kontrolü (adım 2.7) için su banyosu üzerinde ayarlanabilir termostat monte edin.
  3. Manyetik bir karıştırma plakası üzerine tüm düzeneği transferi ve bir su banyosunda, bir manyetik karıştırma çubuğu ile yerleştirin. manyetik alan karıştırma çubuğu döndürmek için yeterince güçlü olduğundan emin olun.
  4. polipropilen sepet (adım 2.6) haşlama işlemi sırasında daha sonra alınacaktır bunun üzerine en az dört destek çinileri ile karıştırma çubuğu çevreleyin. Destek karoları manyetik olmayan bir malzemeden (örneğin, paslanmaz çelik alaşımlı içeren nikel) yapılmış olduğundan emin olun ve onlarkarıştırma çubuğu (Şekil 2) daha yüksektir.
  5. su banyosu iyondan arındırılmış su, 8 ilave edin.
    Not:., Düşük pH değerinde presipitasyon sorunu ise, bir tampon kullanılarak, örneğin, 50 mM sodyum fosfat (pH 7,5), hedef protein verimlerini arttırabilir.
  6. destek karoların üzerinde bir 23 x 23 x 23 cm polipropilen sepet koyun ve sepet karıştırma çubuğu rotasyon ile karışmaz emin olun ve tam sıvıya emin olun. Gerekirse, sepet tamamen batık kadar sonra tekrar sepeti kaldırmak ilave su / tampon ekleyin.
    DİKKAT: 2.12 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. ısıl yalıtımlı eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
  7. 70 ° C (veya deneyler için gerekli olan sıcaklık) su banyosu getirmek için ayarlanabilir termostat kullanın. İstenilen sıcaklık Therma ulaşmıştır tüm montaj sağlamak için ulaşıldıktan sonra en az 15 dakika bekleyinl denge.
  8. hasat tütün yapraklarından 150 gr alikotları hazırlayın. Yırtarak, örneğin geri dönüşümsüz sıkıştırma ve yaprakları zarar, kaçınarak sepet içinde bir kısım koyun. Bitki materyalinin veya ikinci bir yoğun ambalaj ile sepet fazla doldurmaktan kaçının.
  9. Dikkatli ama hızlı bir şekilde sıcak sıvı içinde sepeti batığın ve destek fayans üzerine yerleştirin. flotasyon önlemek için sepetin tepesinde paslanmaz çelik blok yerleştirin.
  10. beyazlatma sıvısı içinde 5 dakika boyunca yaprakları inkübe ya da bir zaman deney tasarımı çalışmalardaki seçin. Tüm inkübasyon dönemi sırasında sıvı sıcaklığını izlemek.
  11. Dikkatle haşlama sıvıdan sepeti çıkarınız ve 30 saniye süreyle yapraklardan kalan sıvı drenaj sağlar. Sonra bitki sepetin dışında bırakır almak, blender aktarmak ve hemen ekstraksiyon (Bölüm 3) başlatın.
    NOT: Bitkiler haşlama sonra ve inci başlamadan önce uzun süre saklanabilire ekstraksiyon, örneğin, 30'dan fazla buz üzerinde dakika veya birkaç hafta içinde -20 ° C'de dondurulmuştur başarıyla test edilmiştir. Ancak, ürün istikrar depolama sürelerini artırarak ve böylece acil işlem tavsiye edilmektedir düşebilir.
  12. Tüm hasat biyokütle işlenir yineleyerek taze yaprak malzemesi ile 2.11 2.8 adımları tekrarlayın.

Tütün Yapraklar 3. Protein Ekstraksiyonu

DİKKAT: Sonraki adımlar dönen bıçaklar ile bir blender içerir. o blender motora monte ederken blender kova işe yaramaz.

  1. Hasat (adım 1.3) ya da kabuksuz (aşama 2.11) 150 g (ıslak kütle) blender bırakır ve ekstraksiyon tamponu (50 mM sodyum fosfat, 500 mM sodyum klorid, 10 mM sodyum disülfit, pH 8.0) 450 ml ekle.
    Not: ekstraksiyon tamponu bileşimi ekstre edilecek protein bağlıdır ve bu nedenle bir pH, örneğin ayarlı, kullanımını gerektiren ya da TR olarak bileşeni arabellekolduğunu.
  2. 30 sn sonları serpiştirilmiş ile 3 x 30 saniye bakliyat için yaprakları homojenize. Yaprakları homojenize edilir ve blender kova yapışmasına neden yoktur emin olun. blender durdurmak ve gerekirse tıkanma önlemek için yaprakları kaldırın ve ardından homojenizasyon devam edin.
  3. Sonraki analiz (bölüm 7) için üretilir her ekstrenin 1 ml örneği alın. bitki materyali beyazlatılmış ise, Aksi seçilen deneysel yaklaşımına bağlı olarak, bir kap içinde ısı yağış (bölüm 4) veya ısı değiştirici (bölüm 5) devam bölüm 6. devam ediyor.

4. İsteğe bağlı: Isı Yağış karıştırılan kap içinde,

NOT: Bir karıştırma kabına tütün Onör puanı çökeltmek için 4.11, Bölüm 4.2 de tarif adımları yürütün. CYp'ler (bölüm 2) beyazlaşma ile çöktürülmüş edilmiş veya eşanjör (bölüm 5) kullanılarak çöktürülmüş edilecektir, tüm bölüm 4 atlayın.

  1. İki 8-L çalışma hacmi suyu kurmakbanyolar, örneğin, ısıl yalıtımlı polistiren köpük veya benzeri 50 x 40 x 40 cm. İlk banyosunda sonraki sıcaklık kontrolü (adım 4.6) için ayarlanabilir termostat monte edin. İkinci olarak, iyonu giderilmiş suyun 5 L ve daha sonraki soğutma (basamak 4.9) buz 2 kg ekleyin.
  2. Manyetik bir karıştırma plakası üzerine ilk su banyosu transferi ve teknenin merkez karıştırıcı plakasının merkezine hizalandığını su banyosu içine 2-litrelik bir paslanmaz çelik kap yerleştirmek.
  3. paslanmaz çelik bir kapta manyetik bir karıştırma çubuğu ile yerleştirin. manyetik alan karıştırma çubuğu döndürmek için yeterince güçlü olduğundan emin olun.
  4. Paslanmaz çelik kabın üst kenarının altına 5 cm kadar deiyonize su ile su banyosunda doldurun. Daha sonra ekstre tamponu ile kap doldurun. gemide bir polistiren köpük kapağı yerleştirin.
    DİKKAT: 4.9 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. termal ins dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanınolup, bun- eldivenler.
  5. Polistiren köpük kapaktaki bir takım elbise delikten paslanmaz çelik bir kaba, bir termometre takın. 78 ° C su banyosu sıcaklığında ayarlamak ve termal dengeye ulaşmak için 15 dakika boyunca tüm montaj inkübe edin. teknedeki sıcaklık 70 ° C, bir su banyosu içinde ayar noktasının altında, yaklaşık olarak 8 ° C olduğundan emin olun.
  6. paslanmaz çelik bir kapta sıcaklığı 70 ° C ila farklıysa, bir su banyosu içinde sıcaklığı buna göre ayarlamak ve sistem 15 dakika daha dengelenmesi sağlar. kap içinde sıcaklığı 70 ° C kadar ya da deney için gerekli olan bu adımı yineleyin ve paslanmaz çelik gemi boşaltın.
  7. Bu su banyosu içinde iken bu paslanmaz çelik bir kaba ekstrakt (aşama 3.2) 300 ml dökün ve zaman ölçeri başlat. 150 rpm'de özü ilave edin ve 5 dakika boyunca inkübe edin. Ekstre Bu inkübasyon süresi boyunca en az 2 dakika süreyle 70 ° C'lik bir sıcaklığa ulaşır emin olun.
  8. , Manyetik karıştırıcı sıcak su banyosu çıkarın paslanmaz çelik gemi çıkar ve buz gibi soğuk kova yerleştirin. Manyetik karıştırıcı üzerine ikinci yerleştirin ve polistren köpük kapağını kaldırın.
  9. Bitki homojenat de 150 rpm'de çalkalandı olduğundan emin olun özü termometre koyun ve 20 ° C bir sıcaklığa ya da deneysel tasarım ile belirtilen sıcaklığa ulaşana kadar inkübe edilir.
  10. Tekrarlayın 4.7 tüm alikotları 4.9 için yineleyin. Her ısı 1 ml örneği almak daha sonra bölüm 6 ile devam, son sıcaklığa ulaştığında özü çöktürülmüş.

5. İsteğe bağlı: Bir Eşanjör Isı Yağış

Not: bir ısı dönüştürücü kullanarak, tütün Onör puanı çökeltmek için 5,2 5.12 kısımlarda açıklanan adımları yürütün. CYp'ler (bölüm 2) beyazlaşma veya ısıtılmış kapta (bölüm 4) çöktürülür olması halinde, bütün bölüm 5 atlayın.

  1. İki 8-L çalışma hacmi kurmaksu banyoları, örneğin, ısı yalıtımlı polistren köpük kova veya benzeri 50 x 40 x 40 cm. İlk banyosunda sonraki sıcaklık kontrolü (adım 5.3) için ayarlanabilir termostat monte edin. İkinci olarak, iyonu giderilmiş suyun 5 L ve daha sonraki soğutma (basamak 5.10) buz 2 kg ekleyin.
    DİKKAT: 5.9 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. ısıl yalıtımlı eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
  2. 8 L deiyonize su ile ilk su banyosu doldurun. termostat kullanılarak 74.5 ° C'ye sıcaklığı ayarlayın. Termal dengeye ulaşmak için 15 dakika için montaj inkübe edin.
  3. 1-L plastik geniş şişenin içine 0,5-L plastik kabı yerleştirerek yalıtımlı bir depolama kabı hazırlamak ve pamukla boşlukları doldurmak. Seçenek olarak ise, bir 0,5-L çalışma hacimli bir özel ısıl yalıtımlı kaplarından faydalanır.
  4. bir ucunda ve diğerleri bir çıkış hortumuna peristaltik pompa, ısı eşanjörünü iletişimer L / S 24 tüp kullanarak biter. Her iki boru yalıtımlı bir depolama kabı içinde bir termometre ile sonlandığı ve 300 ml ekstraksiyon tamponu (Şekil 2) ile doldurun.
  5. Sıcak su banyosu içine ısı eşanjöründen yerleştirin ve 300 ml dak-1 hızında peristaltik pompayı çalıştırın. kabında ortaya çıkan sıcaklık 3 dakika sonra, 70 ° C su banyosu ayar noktasının altında, yaklaşık 4.5 ° C olduğundan emin olun.
  6. izolasyonlu-kabı içinde sıcaklığı 70 ° C farklıysa, buna bağlı olarak, su banyosunun sıcaklığı ayarlamak ve sistem 15 dakika daha dengelenmesi sağlar. en az 3 dakika içinde 70 ° C'ye kadar ortam sıcaklığı ile ekstraksiyon tamponu artar sıcaklığına kadar yineleyin veya deney için gerekli olana eşittir ve paslanmaz çelik kap boşaltın.
  7. yalıtılmış tekneden ekstraksiyon tamponu atın ve bitki ekstresinin 300 ml'lik numuneler hazırlayın. bir bölümüyle izole gemi doldurun.
  8. 5 dakika boyunca dk -1 300 ml eşanjör sayesinde bitki özü (bölüm 3.3) pompa. Ekstre sıcaklığı 3 dakika sonra 70 ° C, ya da deney tasarımında belirlenen sıcaklık eşit olduğundan emin olun.
  9. Ekstre de pompalanır edilirken 5 dakika sonra, buz soğukluğunda su banyosu içine ısı eşanjöründen yerleştirin. Sıcaklık tam ulaşır 20 ° C, ya da deneysel tasarım tanımlanan sıcaklık kadar bu ortamda kuluçkaya yatmaktadır.
  10. yalıtımlı tekneden peristaltik pompaya bağlı giriş hortumunu sökün ve ısı değiştirici içinde kalan ısı çöktürülmüş bitki özü toplamak için pompalama devam edin. Sonra pompayı durdurun.
  11. Tekrarlayın 5.7 tüm alikotları için 5.10 için yineleyin. daha sonra torba filtreleme (bölüm 6) için özler geçmek, son sıcaklığına ulaştığında, her bir ısı-çöktürülmüş ekstresi 1 ml örnek almak.
    NOT: birinci aşama boyunca 5.10 5.7 adımları sonra hiçbir ekstraksiyon tamponu olacakAdım 5.7 atın.

Bitki Özü 6. Torba Filtrasyon

  1. filtre gövdesine monte ve esnek filtre malzemesi için mekanik destek sağlar karşılık gelen destek sepet içine bir torba filtre monte edin. Sepetin altında bir 1-L kap yerleştirin ve 150 ml dak-1 hızında torbaya (seçilen ısıl işleme bağlı olarak bölüm 3.3, 4.10 ya da 5.11) ekstre alikotları uygulanır.
  2. Süzüldükten sonra Bulanıklık kullanarak ekstraksiyon tamponu içinde filtre 1:10 seyreltme bulanıklık ölçer.
  3. Örneğin, derin filtrasyon ve kromatografi 7,10 1 ml örneği alın ve deney tasarımı tanımlanan torba süzüntü işlem.

7. Numune Analizi

  1. Bradford yöntemi 24,25 ile toplam çözünür protein (TSP) miktarını ölçün.
    1. üç kopya olarak, tek kuyu içine her numunenin 2.5 ul pipet96 oyuklu plaka. 2.000 ug ml -1 - aralığı 0 kapsayan üç nüsha olarak sekiz sığır serum albümin (BSA) standartları içerir.
    2. kabarcıkları oluşturan önlemek için yavaşça yeterince iyi her 200 ul Bradford reaktif ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme iyice karıştırın ama.
    3. 22 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin ve bir spektrofotometre ile 595 nm'de absorbans ölçümü. BSA referans noktaları yoluyla bir standart eğriye dayanarak örneklerde TSP konsantrasyonu hesaplanır.
  2. Yüzey plazmon rezonans spektroskopi 26 tarafından Vax8 niceliğini.
    1. Ayar 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) çalışan tamponu yüzey plasmon rezonans cihazı (10 mM HEPES, 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1.500 mM sodyum klorür,% 0.05 h / h polisorbat 20, pH 7.4) ve cihaza bir karboksimetilatlı dekstran yüzeyine çip monte edilir. sistemi temizlemek için asal işlevini kullanın ve 30 bir akış oranı ile manuel çalışma başlatmakul dk -1 akış hücreleri 1 ve 25 mM sodyum hidroksit, 60 sn serpiştirilmiş enjeksiyon ile iki kez 60 saniye boyunca 2 enjekte 30 mM hidrojen klorür üzerinde.
    2. 500 ug ml 200 ul -1 mAb 5.2, 10 mM sodyum asetat (pH 4.0) çözelti hazırlayın. Çözülme 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisukinimid (NHS) şişeler ve 1 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüj. NHS 70 ul EDC 70 ul karıştırın ve 7 mm plastik bir şişeye aktarın.
    3. 10 ul dak-1 bir akış hızı ile 10 dakika için EDC / NHS akış hücreleri 1 üzerine karışımı ve 2 enjekte karboksimetilatlı dekstran yüzeyine yonga yüzeyi etkinleştirir.
    4. hücre 2 sadece akmasına akış yolunu ayarlayın. 10 ul dak-1 hızında, 15 dakika boyunca enjekte ederek çift mAb 5.2.
    5. Hücreler, 1 ve 2 akım ve min -1 yüzeyi devre dışı bırakmak için, 5 ul bir oranda, 7 dakika için etanolamin enjekte akış yolunu geçin. TTavuk 25 mM sodyum hidroksit, 60 sn serpiştirilmiş enjeksiyonu ile 60 saniye boyunca iki kez, 30 mM hidrojen klorid enjekte edilir.
    6. 30 ul dk'lık bir hızda 19 standart -1 180 saniye - örnekleri ve MSP1 enjekte edilir. 1000 ng ml -1 - Vax8 konsantrasyonu 50 olduğundan emin olun. HEPES önceden dilüe gerektiğinde EDTA ve polisorbat 20 (HBSEP) ihtiva eden tamponlu tuz.
    7. Akış hücresinin 2 bu akış hücresinin 1 pik sinyali çıkart ve MSP 1 sinyaline dayalı örneklerinde Vax8 konsantrasyonunu hesaplamak için fark kullanmak - 500 ng ml -1 bilinen bir protein konsantrasyonu ile 19 enjeksiyon.
    8. 30 ul dk'lık bir akış oranında 60 saniye boyunca 30 mM hidrojen klorüre maruz bırakılarak 19 enjeksiyon -1 - her numune ya da MSP sonra 1 yonga yüzeyi yeniden.
  3. floresan spektrometresi ile DsRed ölçmek
    1. üç kopya olarak, siyah yarı ar, tekli oyuklar her bir numunenin pipet 50 ulEA 96 oyuklu plaka. 225 ug ml -1 - aralığı 0 kapsayan altı DsRed standartları içerir.
    2. 530 ± 30 nm eksitasyon filtresi ve bir spektrofotometre içinde 590 ± 35 nm emisyon filtre kullanılarak iki kez floresan ölçülür. DsRed referans noktaları yoluyla bir standart eğriye dayanarak örneklerde DsRed konsantrasyonu hesaplanır.
  4. parçacık boyutu dağılımlarının belirlenmesi
    1. 1 ml izopropanol ile bir küvet yıkanır ve daha sonra deiyonize su ve 2 ml Toz parçacıkları çıkarmak için. küvet içinde örnek 850 ul pipet.
    2. zeta potansiyeli ve parçacık büyüklüğü analizörü içine küvet yerleştirin. "Yazılım" açın ve malzeme olarak "Protein" ve dağıtıcı olarak "PBS" ile manuel ölçümü başlatın. 25 ° C'lik bir sıcaklık ve 180 saniyelik bir dengeleme süresi seçin.
    3. 173 ° backscatter de "DTS0012" hücre ve ölçü seçin. "Auto" fonksiyonu kontrolÖlçüm süresi boyunca iyon ve hiçbir serpiştirilmiş bir gecikme ile üç ölçüm seçin.
    4. Ölçüm deney görünümünde numunenin üç ölçüm seçerek tamamlandıktan sonra tanecik boyut dağılımı zirve profilini incelemek. "Cilt PSD" sekmesini seçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Beyazlaşma tütün konak hücre proteinlerinin ısı yağış
Bölüm 2'de açıklanan beyazlatma işlemi başarılı bir şekilde, tütün 96 ±% 1 TSP azaltarak 70 ° C ile yapraklardan Onör puanı çökeltmek için kullanılabilir (n = 3) bu şekilde, Vax8 hedef proteinin% 51 kadar geri kazanılması artan ise kromatografik ayırma 16 önce% 0.1% 1.2 ila saflık. 64.1% 3.3 den% saflığı artan floresan proteini DsRed 83 ± 1% (n = 3) kurtarmak da mümkün oldu. Beyazlatma işlemi kolay biyok...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıda açıklanan ısı yağış için üç yöntem etkili bir şekilde kromatografik saflaştırma adımı 16,17 önce tütün Onör puanı kaldırabilirsiniz. Bunlar, örneğin, ilk ürün saflığı, damlama 29 salgılanmış proteinler ile sınırlıdır hepsi rhizosecretion 30 ya da santrifüjlü ekstraksiyon 31,32 artırılmasını amaçlayan diğer metodlar tamamlar. hedef protein fazla 1 dakika boyunca ~ 60 ° C'de en az çökelme sıcaklığı dayanabilir arıtılacak Bununla birlikte, ısı dayal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çıkar çatışmaları var.

Teşekkürler

Transgenik tütün tohumlarını sağladıkları için Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes ve Veronique Beiß'e ve tütün bitkilerini yetiştirdikleri için Ibrahim Al Amedi'ye teşekkür ederiz. Yazarlar, editoryal yardım için Dr. Richard M. Twyman'a ve MSP1-19 referansını sağladığı için Güven Edgü'ye teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Avrupa Araştırma Konseyi İleri Hibe ''Future-Pharma'', 269110 teklif numarası, Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) ve Fraunhofer-Gesellschaft İç Programları tarafından Hibe No'su kapsamında finanse edilmiştir. 125-600164 çekin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2100P Taşınabilir TürbidimetreHach4650000Türbidimetre
Amin Kaplin KitiGE SağlıkBR100050 SPR çip birleştirme kiti
Otoklav sepetiNalgene6917-0230Yaprak haşlama sepeti
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01SPR cihazı
Biyo Hücre Analizörü BCA 003 R& 3D ORMSequipn.a.Partikülboyutu analiz cihazı
BlenderWaring800EGBlender
BP-410Furh2632410001Torba filtre
Santrifüj 5415DEppendorf5424 000.410Santrifüj
Santrifüj tüpü 15 mlLabomedik2017106Reaksiyon tüpü
Santrifüj tüpü 50 ml kendi kendine ayaktaLabomedik1110504Reaksiyon tüpü
CM5 çipGE SağlıkBR100012 SPR ölçümleri için çip
Küvet 10 x 10 x 45Sarsted67.754Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc. için Küvetn.a.DoEyazılımı
Disodyum fosfatCarl Roth GmbH  4984.3 Medya bileşeni
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Gübre
Forma -86C ULT dondurucuThermoFisher88400Dondurucu
Serayetiştiriciliği için
Grodan Taşyünü Küpleri 10 x 10 cmGrodan102446Taşyünü blok
Yirmi-döngülü ısı eşanjörü (4,8 m uzunluk)n.a. (özel tasarım)n.a.Heat eşanjör
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Medya bileşeni
K200P 60DPall5302303Derinlik filtre tabakası
KS50P 60DPallB12486Derinlik filtre tabakası
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Su banyosu termostatı
L/S 24MasterflexSN-06508-24Boru
mAb 5.2Amerikan Tipi Kültür KoleksiyonuHB-9148Vax8 spesifik antikor
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Peristaltik pompa
MiraclothLabomedic475855-1R Filtrebezi
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH metre / iletkenlik ölçer
Osram soğuk beyaz 36 WOsram4930440Işık kaynağı
PhytotronIlka Zelln.a.Bitkiyetiştiriciliği için
Sodyum disülfitCarl Roth GmbH8554.1Ortam bileşeni
Sodyum klorürCarl Roth GmbHP029.2Ortam bileşeni
Paslanmaz çelik kap; 0,7 kg 2,0 L; yükseklik 180 mm; çap 120 mmn.a. (özel tasarım)n.a.Isıçökeltme kabı
Synergy HTBioTekSIAFRTFloresan ve spektrometrik plaka okuyucu
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Filtre muhafazası
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS partikül boyutu dağılım ölçümü
Zetasizer Yazılımı v7.11Malvernn.a.ZetasizerNano ZS cihazını çalıştırmak için yazılım
ile D n.a.n.a.Bitki

Kaynaklar

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940(2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T t n Bitkisi A artmaIs l lem EkstraktlarKar t rmal Kap kt rmeIs De i tirici KurulumuDeney Tasar mKromatografik Safla t rmaAlt Ak FiltrasyonuProtein Safl k AnaliziS re Optimizasyonu

İlgili makaleler