Yöntem makalesi

Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar Drosophila Dört kadranda olfactometer içinde

DOI:

10.3791/54346

⸱

20 Ağustos 2016

 ,  , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, 100'e kadar sirke sineğinin (Drosophila melanogaster) koku alma tepkilerini test etmek için bir davranış kurulumu ve veri analizi yöntemini açıklıyoruz. Bu sistem, tek veya çoklu koku uyaranlarıyla kullanılabilir ve nöronal alt kümelerin optogenetik aktivasyonu veya susturulması için uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörobiyoloji önemli bir zorluk nedeniyle karmaşık davranışları, güçlü genetik teknikler ve kompakt sinir sisteminde uygun hayvan davranışları yönlendirecek. Drosophila melanogaster tür soruşturmaların için mükemmel bir model sistem işlev nasıl sinir devreleri anlamaktır. Laboratuvar davranış testleri uzun (örneğin Phototaxis, kemotaksis, duyusal öğrenme ve bellek) 1-3 karşılık gelen davranışları altında yatan nöral mekanizmalar doğal çevrenin özelliklerini taklit ve incelemek için Drosophila ile kullanılmıştır. Belirli sinir alt kümelerini etiket transgenik Drosophila hatları büyük koleksiyonları son durumu ile, davranış testleri davranışları 4-11 ile nöronların bağlamak için önemli bir rol almış. Birlikte veri analizi için altta yatan hesaplama rutinleri ile çok yönlü ve tekrarlanabilir paradigmalar, çeşitli genotyp ile aday sinek hatları hızlı testler için vazgeçilmezdires. Özellikle yararlı test edilen hayvanların, deney süresi ve sunulan uyarıcı niteliği sayısında esnek kurulumları vardır. seçim tahlil de kazanmak ve analiz etmek kolay tekrarlanabilir veri oluşturmak gerekir. Burada, Drosophila davranışsal tepkileri tahlil edilmesi için bir sistem ve bir protokol ayrıntılı bir tarifi büyük dört alan alanda uçan sunulmuştur. Kur, tek bir koku uyarana sinek tepkilerini tahlil için kullanılmaktadır; Bununla birlikte, aynı kurulum çok koku, görsel veya Optogenetic uyaranlara, ya da bunların bir kombinasyonu test etmek için modifiye edilebilir. olfactometer kurulum kokuları yanıt sinek popülasyonlarının faaliyet kayıtları ve hesaplamalı analitik yöntemler sinek davranışlarını ölçmek için uygulanır. Toplanan veriler verimli veri toplama ve deneysel koşullar optimizasyonu için gereklidir deneysel çalışma, hızlı okuma-out almak için analiz edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dış ortama uyum ve cevap verme yeteneği bütün hayvanların hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Bir hayvan, tehlikeleri önlemek yiyecek ararlar ve arkadaşları bulmak ve önceki deneyimlerinden öğrenmek gerekiyor. Duyu sistemleri, görsel, kimyasal ve mechanosensory olarak uyaranlara, çeşitli almak ve yorumlanır ve çözülecek merkezi sinir sistemine bu sinyalleri göndermek için çalışır. Beyin daha sonra yemek için kazarak ya da yırtıcı kaçan olarak algılanan ortama göre uygun motor davranışları, yönlendirir. duyu sistemleri dış dünyayı algılar ve beyin çözer ve kararları yönlendirir nasıl nörobiyoloji önemli bir sorundur nasıl anlamak.

Drosophila melanogaster nasıl nöral devreleri kılavuz davranışları araştırmak için güçlü bir model sistem. Bakımı basit ve ucuz olmasının yanı sıra, Drosophila çok çeşitli ve karmaşık sisteme ait davranışları gösteren, henüz COMPAC ile bunuyaklaşık 100.000 nöron sinir sistemini t. Güçlü genetik teknikler Drosophila genomu işlenmesi için mevcuttur ve transjenik soylarda binlerce selektif ve tekrarlanabilir nöronların 10-13 aynı alt kümelerini etiket olduğu oluşturulmuştur. Bu transgenik çizgiler, seçici olarak etiketli nöronların (aktive veya inhibe) aktivitesini değiştirmek için kullanılabilir ve bu manipülasyonlar kadar sinir işlevleri kılavuz davranışları araştırmak için kullanılabilir.

Çoklu davranış testleri çeşitli Drosophila davranışlarını incelemek için geliştirilmiştir. Drosophila birçok hayvanlar gibi, böyle, yiyecek bulma arkadaşları bulma ve tehlikelerin önlenmesi gibi birçok davranış seçenek, rehberlik için koku alma duygusu kullanın. Koku alma, bu nedenle dış uyaranlara algılanır ve uygun seçimler rehberlik edecek bir hayvanın sinir sistemi tarafından nasıl yorumlandığı araştırmak için iyi bir duyu sistemidir. Bu nedenle, bir çok deney araştırılmak geliştirilmiştirting larva ve yetişkin koku davranışlar. Geleneksel, Drosophila koku davranışlar doğuştan tahlil için kullanılan ve koku davranışları 3 öğrenilebilir iki seçenek T-labirent paradigması ile analiz edilmiştir. Bu testte, yaklaşık 50 sinek iki boru arasında bir seçenek sunulur: bir boru, söz konusu koku içeren ve bir kontrol Deodorantını (genellikle koku çözücü) içerir. Sinekler bir seçim yapmak için zaman belirli bir süre verilir ve daha sonra farklı odacıklarda olan sineklerin sayısı sayılır. T-labirent sayıda deney için basit bir deney de, bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, koku davranışlar yalnızca bir zaman noktasında ölçülür ve bu zaman noktasında önce yapılan farklı seçenek atılır. Benzer şekilde, nüfus içindeki sinekler bireysel davranışları ihmal edilmiştir. Buna ek olarak, T-labirent hataları tanıtmak olabilir sineklerin manuel sayım gerektirir. Son olarak, sadece iki ölçülen seçenek için, bugenellikle ince davranış değişiklikleri tespit etmek için gerekli istatistiki gücünü azaltır. İki seçenek T-labirent bir alternatif dört kadran (dört alanı) olfactometer 14-18 olduğunu. Bu deneyde, hayvanlara arena dört köşesinin her kokulandınlmış hava potansiyel kaynağı ile dolu olan bir ring araştırmak. arena dört deneysel olarak tanımlanmış koku kadranın oluşumunu maksimize etmek bir puckered yıldız şekli vardır. Koku sonra köşelerinden birinde verilirse yalnızca bu tek kadranda yer alıyor. Hayvanların davranışları üç kontrol kadranlarda davranışları karşılaştırıldığında kolaylıkla girdikleri ve koku kadranı terk izlenir ve edilebilir. Dört bölgeli olfactometer tahlil böylece kayıtları büyük bir deneysel arenada üzerinde koku uyaranlara zamansal ve mekansal davranış tepkisi.

Dört bölgeli olfactometer ilk Pettersson ve ark., 15 ve Vet ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. 17 ol araştırmak içinBireysel parazitik Hymenoptera fabrika davranışsal tepkileri. Faucher ve ark., 18 ve Semmelhack ve Wang 16 bireysel Drosophila koku yanıtları izlemek için kurulum uyarladı. Dört bölgeli olfactometer testi koku ve koşulları geniş bir yelpazede için izin, çekici ve itici tepkiler aynı ölçüde hassastır. Özel olarak yazılmış sinek izleme yazılımı, Alex Katsov 19 tarafından geliştirilen ve şu anda (Malzeme ayrıntılı) Julian Brown tarafından yapılmaktadır, dört bölgeli olfactometer 14,20-23 daha yeni uygulamalarına ek avantajlar getirmiştir. Yüksek mekansal aynı anda 100 sinekler (27.5 piksel / cm) ve herhangi bir zaman noktasında pozisyon, hız ve sinekler ivme gibi çeşitli parametreler, ayıklanması sağlar çözünürlük, zamansal (sn 30 kare) kadar tahlil etmek artık mümkün. Bu kokuları 20 sineklerin davranışsal tepkilerin dinamikleri soruşturma sağlar Yukarı. Tüm izleme süresi boyunca nüfus içindeki tek tek sinekler tipi muhafaza değildir, ancak, dikkat edilmelidir. Bunun yerine, her sinek parça kesmeyen sürece iki olarak sinek parça için kaydedilir. sinekler sapmak sonra hangi noktada, yeni parçalar atanır. (Malzeme Tablo ayrıntılı) diğer video yakalama yazılımı birleşmeyle, aynı yapılandırma esnek izleme sürelerini tanır ve daha düşük bir kare hızında görüntü alarak en fazla 24 saat boyunca sinekler izlemek için kullanılabilir. Bu seçenek, sineklerin yumurtlama davranışları incelemek ve ovipositional tercihleri ​​14 ile vücut pozisyonlarını karşılaştırmak için kullanıldı. Dört alan olfaktometrenin da çok modlu yanıtları çalışma (örneğin, koku ve görsel) uyaranlara kullanılabilir, ya da duyusal uyaranların sunum Optogenetic 9 veya thermogenetic 21 uyarımı birleştirmek. Ayrıca, yüksek zamansal çözünürlük yörüngeleri çıkarma fo izin verirtopluluk veri kümesinde r her sinek. Bu nedenle, yöntem koku güdümlü nüfus davranışları ve aynı zamanda bireysel sosyal etkileşimler hakkında soruşturma sağlar. Bu testte elde edilen veriler, davranışsal ekranlar için dört alan olfaktometrenin kullanılmasına imkan verir, sağlam ve yüksek oranda tekrarlanabilir.

Biz dört kadran olfactometer için buraya kurulum düzeneğini açıklar. Biz daha çok konsantre etil propiyonat cevaben elma sirkesi ve itme cevaben koku cazibe tahlil kullanımını göstermektedir. Son olarak, biz tarif ve kaydedilen sinek izleme verilerinin analizi için örnek kod sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kurulum Montaj

  1. sağlanan çizim (Ek Malzemeler, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) 'e göre politetrafloroetilen (PTFE) dışarı yıldız şekilli arena (0.7 cm 19.5 cm 19.5 cm) imalatı. Arena ticari ya da özel bir tesis ile imal edilebilir.
  2. İki cam plakalar (2 mm kalınlığında 20.25 cm 20.25 cm) Edinme ve hassas bir elmaslı matkap ucu kullanarak cam plakaların birinin merkezinde (~ çapı 0.7 cm) bir delik açın.
  3. davranışsal arena için bir ışık geçirmez davranış kutusunu imalatı. Ayrıca sağlanan çizimler (Yardımcı Malzeme, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf) göre kızıl ötesi CCD video kamera için bir ışık geçirmez kamera kutusu imalatı. kutu ticari ya da özel bir tesis ile imal edilebilir.
  4. arka duvarı ve davranış kutunun yan duvarlarına LED diziler klima monte edin. sıcaklık probu yerleştirinGerçek zamanlı sıcaklık geri beslemesi ve ayarlanması için bir yan delikten davranış kutusunda (Şekil 1 ve ayrıntılar için 2 bakınız).
  5. Kameranın IR filtresi ve dairesel polarize takın ve kamera kutusu içine aksamını monte edin. Davranış kutusu ve kamera kutusu davranış kutusunun daha iyi sıcaklık kontrolü (detaylar için Şekil 1 ve 2'ye bakınız) için bir cam pencere ile ayrılır.
  6. Bir kamera adaptörü Kızılötesi CCD kamera bağlayın. USB dönüştürücü kamera adaptörünü bağlayın. veri toplama için bilgisayardaki USB bağlantı noktasına USB dönüştürücü bağlayın.
  7. üreticinin talimatlarına göre bilgisayardaki video dönüştürücü sürücüyü yükleyin. İsteğe bağlı olarak, kamera ayarları ve satın alma parametreleri geniş bir yelpazede erişmek için USB video dönüştürücü üreticisi tarafından sağlanan görüntü işleme yazılımı yükleyin.
  8. çıkışı "ile klima ünitesi (bağlayınsıcaklık kontrol sıcaklık kontrolörü arkasında) üzerine termokupl "" aracılığıyla sıcaklık kontrol arkasında) ve sıcaklık probu (üzerinde ". davranış kutusu içine probu yerleştirin.
    Not: Yerleşimimizin sıcaklık kontrol sistemi 18 ° C ve 30 ° C arasında kutu sıcaklık muhafaza edebilir. Daha yüksek ya da daha düşük ortam sıcaklıkları nöronal aktivitenin işlemek veya sinaptik iletim inhibe deneyler thermogenetic (dTrpA1, TrpM8 ya shibire ts) için yararlı olabilir. En deneyler için, sıcaklık 25 ° C'de muhafaza edilir.
  9. (Detaylı şemaları ve bağlantı parçaları için Şekil 1B bakınız) aşağıdaki adımlarda koku dağıtım sistemi monte:
    1. merkezi klima sistemi, hava girişini kontrol etmek için hava basıncı regülatörü kullanın. Merkezi A havanın temizlenmesi için basınç regülatörü (odun kömürü ile dolu) karbon hava filtresi iletişimeir sistemi.
    2. yüksek çözünürlüklü debimetre tüpler tarafından düzenlenen çoklu kanallardan oluşan akış kontrol sistemi monte edin.
    3. Şekil 1B ve 2F gösterildiği gibi bir manifoldu yoluyla debimetre tüpleri karbon hava filtresinden çıkışını bağlayın. Debimetreler bırakarak temiz hava odasına ihraç veya ısmarlama koku odalarına 24 içine girilirse düzenleyen elektronik kontrollü 3-yollu selenoid valfler aracılığıyla debimetre tüplerin çıkışını yönlendirin.
    4. üreticinin kılavuzuna göre selenoid vana denetleyicisi takın.
  10. bir veri toplama cihazı (DAQ) ve üreticinin kılavuzuna göre bir güç kaynağına bağlayarak elektronik hava debimetre monte edin. Her deneyden önce arenada her kadranda eşit debileri doğrulamak için DAQ arayüzü yazılımı yükleyin.

2. Olfaktor Uyaranlar Hazırlık

  1. 5 koku hazırlayınbir plastik dış kap meydana karınca odalar 24, orta kısmında cam iç kap, ısmarlama bir PTFE kapak parçası, orijinal saklama kabı kapağı çıkarıldı ve iki tek-yönlü vana.
    Not: PTFE kapağın çevresinde bir O-halka koku perfüzyon sırasında koku haznesinden hava kaçağı önlemek için kullanılabilir. Şematik ve odaların fotoğraflar için Şekil 2 Şekil 1'e bakınız.
  2. Solvent kontroller için dört Odorant odaları ve bir test odorant için bir bölmeyi kullanın. (Iyice deneyler önce karıştırın test Koku moleküllerini + uygun çözücüler) solvent veya odorant seyreltme 1000 ul cam kapları doldurun ilgili plastik hazne içerisindeki cam kap yerleştirin (plastik odasına sıvı dışarı dökmek değil) ve kapağı sıkın . her zaman test odorant ve solvent kontrolleri için temiz odasını kullandığınızdan emin olun.
    Not: Koku cazibe w elma sirkesi (% 5 asitlik) ve 1/16 seyreltme ile tetiklenebilirater. Bunun aksine, koku itme davranışı mineral yağ içinde, etil propionat% 10 seyreltme kullanılarak incelenebilir. Bu durumlarda, kontrol uyaranlar saf mineral yağ ile koku odaları bulunmaktadır.

3. Fly Hazırlık

  1. Arka standart mısır unu ortamında uçar. 30 erkek ve bir standart şişede 30 kadın ebeveyn sineklerin yerleştirin ve onları 25 ° C veya oda sıcaklığında 5 gün boyunca yumurtalarını edelim.
  2. Her deney için, yeni eclosed toplamak (<1 gün eski) 25 erkek ve 25 kadın kısa CO 2 anestezi altında uçuyor.
  3. 2-4 gün standart bir uçucu madde ile bir şişe içinde sinekler tutun.
  4. 40-42 saat deneyden önce, CO olmadan 2 anestezi sinekler transferi   ~ 10 mi,% 1 agaroz jeli ile flakon. Bu onların lokomotor aktiviteyi artırmak için yardımcı olur gıda olmadan nemlendirilmelidir sinekler devam edecektir.
    Not: Sinekler% 90'ından fazlası açlık hayatta gerekir. Bazı genotipleri iyileşmek azsenin ve 40 saat açlık boyunca bunu yapmak olmayabilir. Bu gibi durumlarda, örneğin 24-28 saat gibi daha kısa süreler kabul edilebilir ama hepsi deneysel koşullar ve tekrarlar için aynı tutulmalıdır.

Çekici ve Kovucu Parfüm katkılar 4. Davranışsal Tepkiler

  1. Sıcaklık kontrolörü açın ve 25 ° C olarak ayarlayın.
  2. Odorant odasının çıkışına hortumu takarak ve odorant odaları (kontrol ve test koku) bağlayın push-to-connect davranış kutusunda uydurma.
  3. kontrolü ve Odorant Airstreams / dk 100 ml eşit olduğundan emin olmak için hava akımı ölçer kullanılarak her kadranda akış hızını kontrol edin.
  4. Tamamen kuru hava (~ 3-4 dk) PTFE sinek arena ve% 70 etanol 2-3 kez ile cam plakalar temizleyin ve onlara izin verir.
  5. kelepçeler ile arenaya cam plakalar yapıştırın.
  6. Transferi 2 anestezi cam plakalar birinde delikten arenaya CO olmadan uçar. kıçtaer transferi, kaçmasını önlemek için sinek delik dairesel örgü yerleştirin.
    Not: CO2 anestezi Drosophila davranışı 25 etkilediği gösterilmiştir ve davranışsal deney, 24 saat içinde kullanılmamalıdır.
  7. ışık geçirmez odasına sinekler arena yerleştirin arena köşelerine davranış kutusuna montaj-connect push-to bağlı boru bağlayarak dört kontrol hava akımları bağlamak, odasının kapısını kapatın ve 10- bekleyin 15 dk sinekler yeni ortama alışmak izin vermek. Mümkünse, önyargı deneysel sonucu olabilir olası minimum ışık sızıntısını önlemek için, deneyler yapılmaktadır odasında ışıkları kapatın.
  8. sinekler 4 kontrol hava akımlarına maruz edildiği bir 5-10 dk kontrol deneyini, çalıştırın.
  9. , Sinekler arenada düzgün yayılı emin olmak için (aşağıda Veri analizi bölümüne bakınız) hemen verileri analiz ve Gözde mekan Endeksi yakıno arena içinde tercih ya da kaçınma hiçbir kontrolsüz kaynakları (örn dışarıdan, düzensiz ısı dağılımı, düzensiz arena, koku kirliliği, vb sızan ışık) olduğunu doğrular olarak 0'a Bu adım, esastır. Sinekler eşitsiz dağıtıldığı ya da lokomotor aktivite düşükse, sinekler atmak tekrar arena temizleyin (4.4 Adım) ve deney tekrar sineklerin yeni bir toplu kullanın.
  10. 3-yollu vana veya konnektör tüpleri yeniden takarak açarak kurulum, test odorant odasına bağlayın.
  11. 5-10 dakika test deneme çalıştırın ve aşağıdaki 5. bölümde tartışıldığı gibi verileri analiz (ayrıca Referans 14 ve Şekil 3). 20 dakika daha uzun Kayıtlar hesaplama işlemi zor olabilir veri dosyaları neden olabilir. artık deneysel kayıtlar istenirse, hızla durdurmak ve izleme programı yeniden başlatın. Bu deneysel kayıtlar arasında bir ~ 10 sn boşluğu sonuçlanır.
  12. Discard sinekler.
  13. Temiz arena ve cam% 70 etanol ile plakaları (4.4 Adım) ve ışık geçirmez muhafaza içinde bağlayıcı tüpleri değiştirin. deneyler hızlandırmak için yeni bir temiz arenada kullanılabilir ve deneysel çalışır yaparken kirli arena temizlenmelidir.
  14. Gerekirse, sineklerin yeni bir parti ile başka bir deneme çalıştırın. Birkaç deneyler aynı gün çalıştırmak ise, hiçbir odorant bir önceki test vadede sistemin bırakılır sağlamak için aşırı özen gösterin. Bu normalde CO 2 koku maddesi veya düşük konsantrasyonlarda ile ilgili bir sorun değil, deneysel çalışmalar arasında 24 saat boşluğu kadar için son derece konsantre uyaranlara ihtiyaç duyulabilir. Odorant kirlenme kontrol deneyleri sırasında şüphesi varsa ek olarak, akış boruları sonra tüm boru değiştirilebilir. Her zaman sürekli sistemi temizlemek için deneyler arasında kuru havayı bırakın

5. Veri Analizi

Not: Önerilen sinek izleme edinme Softwar(Malzeme ayrıntılı, e) satın alma sırasında gerçek zamanlı olarak sinekleri izler ve zaman damgası ve * dat formatında algılanan tüm sinekler koordinatlarını kaydeder. Biz ısmarlama bir Matlab rutin Matlab biçime verileri dönüştürmek için ve verileri analiz etmek için geliştirdik. Kod örnekleri Yardımcı Malzeme verilmiştir, ancak uygulama ayrıntıları veri toplama için kullanılan yazılıma bağlı olacaktır.

  1. ham verileri yükleyin. Arena hatlarını takip mekansal maske oluşturun ve gürültü (Şekil 4A, Ek Kod MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask temsil olarak arena dışında kalan tüm veri noktalarını kaldırmak için ham verilere maske uygulayın. m).
  2. Bu veriler, ses veya hareketsiz sinekler (Şekil 4B, Ek kod TemporalFiltering.m) tarafından üretilen olması muhtemeldir olarak 3 saniye daha uzun süre için 0.163 cm / s altında bir hızda hareket tüm veri noktaları çıkarın.
  3. Kalan verileri görselleştirmekTek yörüngeleri tek seferde onları çizerek ya da noktalar (Şekil 3, Ek Kod SingleTrajectoryViewer.m).
    Not: dört alan koku sınırlarının yeri muhtemelen kullanılan gibi herbir koku verici madenin özellikleri ve hava akımı oranları gibi faktörlere bağlıdır. Örneğin, çok uçucu koku muhtemelen daha az uçucu koku daha tam olarak koku kadranı dolduracaktır. Bu nedenle, her bir odorant biraz farklı bir koku sınırları sergileyebilir olasıdır. Bu, belirli bir noktadan hava örnek için bir vakum kullanılır, ve böylece bu noktada odorant konsantrasyonu bozan olarak koku sınırları ölçmek için bir fotoiyonizasyon detektörün kullanımı sorunlu olabilir. Bununla birlikte, koku sınırları hızla sinek davranışsal verilere dayanarak tahmin edilebilir. Örneğin, farklı koku yanıt olarak biriken uçucu parçalar göre bir koku sınır açık Şekil 3C ve 3D gözlemlenebilir.
  4. CalKontrol deneyleri hiçbir tercih yanıtı oluşturmak olmadığını belirlemek için, ve aynı zamanda bir odorant (veya optogenetic 9) uyarana tepki erişmek için bir cazibe endeksi hesaplanmalıdır. Bir Yere İndeksi (AI) hesaplamak için, bir kontrol veya test kayıt son 5 dakika kullanın. +1 (Mutlak cazibe) ve -1 (mutlak itme) arasında kalan cazibe bir ölçü elde etmek için, aşağıdaki formül AI hesaplamak için kullanılır:
    figure-protocol-1
    N test test kadranda veri noktalarının sayısı olduğu, N kontrol üç kontrol kadranda veri noktalarının ortalama sayısıdır. Hiçbir tercih sıfıra yakın değerlere belirtilir gibi Bu tedbir sezgisel. Bununla birlikte, doğru odorant kadranında yer almaktadır sinek sayısına oranını göstermez. Bu ölçü elde etmek için, yüzde indeksi (PI) kullanılabilir:
    figure-protocol-2 N test test kadranda veri noktalarının sayısı ve N toplam dört kadranda veri noktalarının toplam sayısıdır. Bu formül 0.25 davranışsal tercihi (Şekil 3E ve 4C, Yardımcı Kod AttractionIndex.m) karşılık gelen, 0 ve 1 arasında düşen bir ölçü sağlar.
  5. Her tekrarı için sineklerin yeni bir grup kullanarak, her deneysel koşul 5-10 tekrarlar çalıştırın. Kolmogorov-Smirnov parametrik olmayan bir test (Şekil 3F, Matlab kstest2 fonksiyonu) kullanarak denetimleri koşulları arasında ya da karşı çekim dizinleri karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dört bölgeli olfactometer tahlil kayıtları ve büyük bir davranış alan üzerinde birçok sinekler yürüme faaliyetlerini analiz eder. Parfüm bir, iki, üç ya da dört kadran butonu hava akışları içine sokulabilir. kokuların yokluğunda, sinekler serbestçe tüm dört çeyrek arasında hareket edecektir. un-kasıtlı önyargıları tahlil girmiş değil olduğunu gösterir gibi bu davranış gözlemlemek için çok önemlidir. Bu önyargıları ışık, sıcaklık dalgalanmaları, hava akımı farklılıkları, ya da koku kirlet...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan dört alan olfactometer yabani tip ve mutant Drosophila uçar büyük popülasyonlarının koku yanıtları incelemek için çok yönlü bir davranış sistemdir. Her deney (kurulum, deneysel çalışır ve temizlik dahil) ~ 1 saat sürer ve 4-6 deneyler rutin olarak her gün yapılabilir. 5 dakika boyunca 40-50 sinekler kullanan tipik bir deney yaklaşık 450.000 analiz için veri noktaları paletli oluşturur. tarif edilen konfigürasyon, min gün arasında değişen bir zaman dönemi boyunca koku tepki ya da diğer duyusal u...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinek arenasını ve ışık geçirmez muhafazayı ürettiği için Terry Shelley'e, sinek stoğu bakımında yardım için Liz Marr'a ve veri analizi için kullanılan Matlab koduna yardım ettiği için Xiaojing Gao ve Junjie Luo'ya teşekkür ederiz. Monell Chemical Senses Center'dan Johan Lundström'e koku dağıtım kurulumunu gösterdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Whitehall Vakfı (CJP) ve NIH NIDCD (R01DC013070, CJP) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Hava dağıtım sistemi & nbsp; < / güçlü >< güçlü > (Gerekli miktar) < / güçlü >
< güçlü >< > Boru ve konektörler< / güçlü >< / em >
Termoplastik NPT (F) ManifoldlarıCole-Parmer, IL, ABDR-31522-311
Altıgen azaltıcı ve nbsp; nipel (1 / 4MNPT-> 1 / 8MNPT)McMaster-Carr, IL, ABD5232T3141
Boru ( ID:1/8)McMaster-Carr, IL, ABD5108K4350 Ft
Boru (ID:1/16)McMaster-Carr, IL, ABD52355K41100 Ft
Dikenli boru bağlantı parçalarıMcMaster-Carr, IL, ABD5117K711 paket
Bas-bağla boru bağlantı parçalarıMcMaster-Carr, IL, ABD5779K1024
Dikenli Boru Ek Parçaları (1/4MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, ABD5463K4391 paket (10)
Dikenli Boru Ek Parçaları (1/8MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, ABD5463K4382 paket (10) 
Dikenli Boru Ek Parçaları (1 / 8MNPT-> 1 / 16BF)McMaster-Carr, IL, ABD5463K42 paket (10) 
Dikenli Boru Ek Parçaları (1 / 4MNPT-> / 4BF)McMaster-Carr, IL, ABD&nbsp; 5670K841
Altıgen başlı fişMcMaster-Carr, IL, ABD48335K1521
< güçlü > Hava basıncı regülatörü, hava filtresi ve debimetreler< / güçlü >< >< güçlü > (Gerekli miktar) < / güçlü >
laboratuvar gaz kurutma ünitesiW A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, ABDModel: L68-NP-303; stok #268401
150 mm akış tüpleri için çok tüplü çerçevelerCole-Parmer, IL, ABDR03215-301
150 mm akış tüpleri için çok tüplü çerçevelerCole-Parmer, IL, ABDR03215-761
150 mm akış tüpleriCole-Parmer, IL, ABDR-03217-159
Valf KartuşuCole-Parmer, IL, ABDR-03218-729
Hassas Hava regülatörüMcMaster-Carr, IL, ABD6162K131
Soleniod valfleriAutomate Scientific, Berkeley, CA02-10i4
Solenoid valf kontrolörüValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA01-181
Elektronik akış ölçerHoneywellAWM3100V1
DAQ (NI USB-6009, Ulusal Aletler) ve a Ulusal AletlerNI USB-60091
Güç kaynağıExtech Instruments3822001
Koku odaları
Polipropilen Geniş Ağızlı kavanoz 2 oz; 60 mlNalgene562118-0002Deney başına en az 5 tane gereklidir, ancak her koku maddesinin her dilüsyonu için ayrı bir oda gereklidir. Container Store'da mevcuttur, parça #635114)
Cam koku odası, 0.25 ozSunburst ŞişeLB4BDeney başına en az 5 tane gereklidir 
Koku odası için "Giriş" valfiSmart Products, Inc., CA, ABD214224PB-0011S000-4074Bu parçalardan 1 tanesi koku odası başına kullanılır, ancak sık sık değiştirilmeleri gerekir
Koku odası için "Çıkış" valfiSmart Products, Inc., CA, ABD224214PB-0011S000-4074Bu parçalardan 1 tanesi koku odası başına kullanılır, ancak sık sık değiştirilmeleri gerekir
O ringRT Dygert International, MN, ABDAS568-029 Buna-N O-R1 paket (100)
Fly arena, kamera ve davranış kutuları(Gerekli miktar)
Davranış ve kamera kutusu malzemesiInterstate plastikler, CA, ABDABS siyah ekstrüde (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 inç kare
Sinek arenası ve koku odası ekleri için teflon, 3/8 "kalınlık, 12" x 12 "McMaster-Carr, IL, ABD8545K27 1
Cam plakalar, 1/8" Kalın, 9" x 9"McMaster-Carr, IL, ABD8476K191 2
Çift etkili termoelektrik kontrolörWAtronix Inc, CA, ABDDA12V-K-01
IR LED dizisiGelişmiş Aydınlatma, Rochester, VT, ABDAL4554-88024, PS24-TL2 LED dizisi ve bir güç kaynağı
Klima ÜnitesiMelcor Store  MAA280T-121
< güçlü > Görüntüleme sistemi< / güçlü>< em >< güçlü> (Gerekli miktar) < / güçlü >
Cosmicar / Pentax C21211TH (12,5 mm F / 1.4) C yuvalı LensB VE H FOTOĞRAF VE ELEKTRONİK A.Ş., NY, ABDKP1
CCXC-12P05N Ara Bağlantı KablosuB VE H FOTOĞRAF VE ELEKTRONİK A.Ş., NY, ABDSOCCXC12P05N1
DC-700 Kamera AdaptörüB VE H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, ABDSODC700 1
S+B 40,5 093 IR filtresiB VE H FOTOĞRAF VE ELEKTRONIK A.Ş., NY, ABD65-0724421
TiFFEN 40,5 mm Dairesel polarizörAmazon1
IR Video kameraEndüstriyel Görüş Kaynağı, FL, ABDSony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
USB video dönüştürücüGörüntüleme kaynağı, NC, ABDDFG / USB2-It1
iFlySpy2 (sinek izleme yazılımı)Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
IC Capture 2.2 yazılımıGörüntüleme kaynağı, NC, ABD (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Çeşitli(Gerekli miktar)
Dremel döner aletDremel, Racine, WI, ABDDremel 8000-03 1
Cam kesimi için elmas kaplı matkap uçlarıÇeşitli tedarikçilerden temin edilebilir; MSC Endüstriyel Tedarik A.Ş., Melville, NY906063281
PEC21211

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580(2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986(2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361(2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Olfactory Behavior AssayDrosophila TrackingFour quadrant OlfactometerOdorant Chamber SetupFly Population AnalysisAirflow Rate VerificationData Analysis ScriptAttraction Index CalculationOlfactory Stimulus ResponseBehavioral Data Quantification

İlgili makaleler