Laktaz enzim etkinliğin ölçülmesi öğretim laboratuarında

Özet

Laktaz enzim aktivitesinin disaccharide laktoz katabolik işleme için gereklidir. Burada, diyet takviyeleri bulunan laktaz aktivitesi kolorimetrik bir tahlil kullanılarak denenecektir. Bu deneysel bir platformla laktaz ve enzim kinetiği etkinliğini anlamak için öğrencilere sağlar.

Özet

Enzimlerin çalışma şeklini anlamak ve bu gerçek hayattan örnekler için ilgili biyolojik ve Biyomedikal Bilimleri lisans dereceleri geniş bir yelpazesi için önemlidir. Bu takip edilmesi kolay iletişim kuralı ilk yıl lisans eczane öğrenciler için geliştirilmiş ve enzim analizi için enzim reaksiyonları ve analitik işlemleri giriş seviyesi bir giriş sağlar. Bu piyasada bulunan enzim insan hastalık/ilaç uygulama için ilgili bir örnek gösterir gibi seçim laktaz, enzimdir. Laktaz besin takviyesi tabletler ayıklanır ve laktaz için yapay bir substrat hidroliz dayanan kolorimetrik bir tahlil kullanarak değerlendirildi (ortho-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Orto-nitrophenol ONPG hydrolytic bölünme laktaz tarafından takip sürümü değişiklik 420 absorbans ile ölçülen nm ve sıcaklık etkisi enzimatik reaksiyon reaksiyon buz, oda sıcaklığında ve 37 gerçekleştirerek değerlendirilir ° C. Daha gelişmiş analiz enzim etkinliği farklı koşullar altında değerlendirilmesi ve farklı reaktifler kullanarak bu protokolü kullanarak uygulanabilir.

Giriş

Özel bir tür yaşam vücudunda kimyasal reaksiyonlar için biyolojik katalizör görevi protein enzimlerdir organizmalar¹. Enzimler, kaybı atılması ve organizmaların çalışması izin enerji sağlayan hayat için önemli bir eylemdir. Anlayış enzimler önemlidir, bu nedenle, hayat tam bir anlayış. Böyle bir bilgiye Tıp Bilimleri biyoloji Üniversitesi seviye derecesi programları, geniş bir yelpazesi için esastır. Kataliz ilkeleri enzim aktivitesinin teorik modeller arasında değişen ayrıntılı bir arka plan için öğrencilerin ders kullanarak ve malzeme okuma sağlanabilir iken, enzim reaksiyonları özelliklerini en iyi pratik deneyimi üzerinde eller tarafından anlaşılan enzimler eylem daha önce²gösterdi. Bu iletişim kuralı Laktaz enzim ile insan beslenme ve sağlık ile ilgili etkinlik örneği olarak kullanarak laboratuvar koşullarında enzim etkinliği ölçmek için deneysel paradigma izleyin kolay sağlar.

Glycosidic hidrolaz laktaz (AK 3.2.1.23/26) memeliler³için merkezi beslenme önemli bir enzimdir. Laktaz aktivitesi evrim son derece korunmuş ve enzimler beta galaktozidaz aileden gelen türetir — bir aile Homo sapiens (1 rakam, PDB 1JZ8)⁴' e Escherichia coli gelen mevcut. Daha sonra vücutta enerji üretmek için kullanılabilir kurucu yaşam bileşenlerinden içine laktoz dökümü izin rolüne laktaz bir insan beslenme ortamda kritik önemini kaynaklanmaktadır. Laktaz tromboksan hidroliz galaktoz ve glikoz (Şekil 2) serbest disaccharide laktoz glycosidic Bond⁵. Bu bol daha sonra öncelikle nesil adenozin trifosfat (ATP) üzerinden sitrik asit döngüsü ve Oksidatif fosforilasyon⁶için kullanılır. Yenidoğan ve bebek gelişimi sırasında laktaz son derece insan sindirim sistemi, anne sütü hangi laktoz birincil karbonhidrat bileşeni ve beslenme en önemli kaynaklarından biridir ilk yıllarında ^{alınan laktoz aşağı kırma olarak ifade edilir 7}. konjenital laktaz eksikliği (CID), nadir otozomal resesif koşulu laktaz gen (LCT) için Laktaz enzim⁸kodlama mutasyonlar neden laktaz tıbbi önemi vurgulanır. Yeni doğmuş bebekler suç araştırma departmanı ile çok az laktaz aktivitesi sergi, böylece onlar meme süt, süt ya da laktoz içeren formül başka tür beslenen olamaz.

Çocukluk çağında laktaz ifade normalde azalır; Ancak, bu azaltma sütten kesme takip coğrafi olarak, yaklaşık yetişkin enzim⁹ifade etmek dünya çapında devam eden % 35 ile değişir. Laktaz kalıcı bilinen laktaz, sürekli ifade bireyler süt ve süt ürünleri kaynakları bir dizi sindirmek devam etmek izin verir. Diğer taraftan, laktaz ifade kaybı laktoz intoleransı, olarak da bilinen yetişkin tipi hypolactasia (ATH), laktoz gut yıkmak için bir yetersizlik nedeniyle yol açabilir. ATH bir yapı tarafından yukarı laktoz laktoz gıda ürünleri içeren sindirim takip kolon ile karakterizedir. Kolon, bağırsak mikrobiyal fauna hidrojen, metan ve karbon dioksit gibi gazlar serbest tarafından birikmiş laktoz fermente. Laktaz enzim eksiklikleri ile bireylerde bu gazların üretimi teşvik abdominal şişkinlik, artan şişkinlik, ağrı, bulantı ve borborygmi (karın guruldama)⁷. Laktoz sindirim sistemi içinde daha yüksek düzeyde de gevşek dışkı neden olabilir.

LCT gen ekspresyonu kontrolünü yakındaki MCM6 gen intron içinde bulunan polimorfizmleri tarafından modüle. Laktaz sürekli ifade olan bireyler böylece normal sütten kesme sırasında LCT transkripsiyon aşağı karşılayan güçlü distal arttırıcılar LCT gen ifade olarak işlev polimorfizmleri taşımak ve sonuç olarak yetişkinlik³ifadede laktaz sürdürülmesi. Olumlu evcilleştirme, sığır ve deve Orta Doğu'daki aşağıdaki beş bin yıl önce seçilmiştir için önerilen artırıcı polimorfizmleri^9,10.

ATH--dan kaynaklanan belirtiler laktoz alımı, örneğin diyet süt ürünleri kaldırarak azaltarak yönetilebilir. ATH için alternatif bir yaklaşım ve CID için tercih edilen yaklaşım laktaz takviyeleri, eczanelerden yaygın olarak kullanılan kullanmaktır. Bu takviyeleri laktaz kaynakları, mantar ve bakteri, ile çekilen veya gıda içeren laktoz eklenen bir sıvı veya hap tabanlı form dahil olmak üzere çeşitli izole sağlar. Ek laktoz mevcut gıda glikoz ve galaktoz ürünleri, böylece kendi emilimi erişimine izin verme ve sindirilmemiş laktoz substrat gut birikimi engelleyen bir kısmı hidrolize.

Laktaz takviyeleri diyet bir yardım olarak kullanmak dayanarak, biz ilk yıl Biyomedikal Bilim veya eczane öğrenciler için uygun bir basit Enzimologiya laboratuvar deneyi geliştirdik. Bu laboratuvar deneyi, piyasada bulunan laktaz takviyeleri ve kullanımları ortho yararlanır-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) ( laktaz tarafından bölünme glycosidic tahvil ölçmek için kolorimetrik bir bitiş noktası sağlamak için Şekil 3)¹¹. ONPG davranır laktaz için yapay bir substrat olan bu enzim tarafından hidroliz tabi D-galaktoz ve Orto-nitrophenol üretir. İkinci ürün bir dalga boyu 420, ışık emici sarı bir renge sahiptir nm. 420 nm şu absorbans herhangi bir değişiklik miktarının tarafından ONPG maruz kalma laktaz, bu enzim aktivitesini tahmin etmek mümkündür. Bu laboratuvar deneyi enzimatik hidrolaz etkinlik gösterimini sağlar. Ek çoğaltır bina ve farklı koşullarda deneyleri yürüten, enzim kinetiği, değerli bir gerçek hayattan örnek eylem insan sağlığı için ilgili enzimlerin sağlayan daha gelişmiş analiz dahil etmek mümkündür.

Protokol

Not: Aşağıdaki protokol iki saat (Tamamlanma sınıfının çalışma sayfalarının dahil) boyunca yapılacak bir amaca öğretim laboratuvarda geliştirilmiştir. Kasıtlı olarak deneysel merdiven were yerine birlikte enzim kinetiği (model verileri kullanarak bu ders kapsamında yürütülen); daha ayrıntılı bir analiz dışlamak için Ancak — tartışmada belirtildiği gibi — protokol zaman, imkanları ve öğrenci ilerilik düzeye bağlı olarak daha gelişmiş analizler için bir şablonu sağlar.

Güvenlik: Bu pratik iyi kimyasal laboratuvar uygulama (GCLP) kurallarına göre yapılmalıdır — sıkıya laboratuvar ceket, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman aşınmış her zaman laboratuvarda .

1. enzim ayıklanıyor

1. Bir laktaz enziminin bir harç ve havaneli kullanarak bir hatta toz için 200 mg içeren tablet, ezmek.
2. Elde edilen toz "askıya alma" etiketli bir 15 mL tüp içine yerleştirin ve 10 mL 100 mM fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspend.
3. Enzim ayıklama en üst düzeye çıkarmak için 1 dakika için girdap.
4. 1 mL süspansiyon tortu katı parçacıklar bir 1,5 mL santrifüj tüpü ve 10.000 x g , 1 dk santrifüj içine aktarın.
5. 500 µL süpernatant, "Laktaz özü" etiketli bir temiz 1.5 mL tüp aktarın.

2. gözlem kolorimetrik reaksiyon

1. Yer 390 µL 100 mm PBS 1,5 mL tüp içine "A tepki" etiketli.
2. 5 mM ONPG çözüm ve mix 100 µL de vortexing tarafından ekleyin.
   Dikkat: Bu pratik ortho kullanır-Nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) laktoz için bir yedek olarak. Bu yana ONPG fenolik bileşiktir, dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. ONPG ile cilde temas durumunda maruz kalan deri hemen yıkanmalıdır. Herhangi bir sıvı sıçraması hemen uygun atık akımına bertaraf edilecek kağıt havlu ile sildi.
3. Tepki A tüp ve karışımı içine ekstresinin 10 µL de vortexing tarafından ekleyin.
4. Reaksiyon karışımı 5 dakika boyunca gözlemlemek ve çözüme Renkölçer değişiklikleri not edin.

3. ölçme enzim aktivitesi

1. İki 1,5 mL tüpler ayarla: bir "Tepki B", bir etiketli "Denetim" etiketli.
2. 100 mm PBS 390 µL tepki B tüp, 100 mm PBS denetim tüp için 400 µL ekleyin ve 5 mm ONPG 100 µL her tüp için ekleyin.
3. İçeriği tarafından vortexing karıştırın.
4. Laktaz ekstresinin 10 µL tepki B tüp eklemek, vortexing tarafından mix ve oda sıcaklığında 1 dk. için devam etmek tepki sağlar.
5. 1 dk. geçtikten sonra 1 M sodyum karbonat 500 µL böylece tepki sonlandırma pH artırarak Laktaz enzim inhibe her iki tüpler ekleyin.
6. 500 µL her tüpünden temiz spektrofotometre cuvettes aktarmak ve 420 absorbans ölçmek spektrofotometre kullanarak nm.
7. Absorbans tepki B ve kontrol örnekleri için Not ve denetim değeri ONPG hidroliz etkin enzim huzurunda nedeniyle absorbans değişimi türetmek için tepki değerinden çıkarın.

4. sıcaklık üzerindeki etkisi enzim aktivitesi

1. Üç kontrol tüpleri ve üç tepki tüpler madde 3 te açıklandığı gibi ayarlayın ve bunlar etiket "4 ° C", "Oda sıcaklığında" ve "37 ° C".
2. Enzim ilavesi ayıklamak, buz, oda sıcaklığında, diğeri (önceden ısıtılmış su banyosunda) 37 ° C'de bir tüp kuluçkaya.
3. Reaksiyonlar için 1 dk sürdürmek ve her tüp için 500 µL 1 M sodyum karbonat ekleyerek reaksiyon sona erdirmek izin.
4. 420 absorbans ölçmek için madde 3 te açıklandığı gibi her tüpün nm. Denetim değeri her durumda tepki değerinden çıkarılarak değerlerini kaydedin.

Sonuçlar

İletişim kuralı Bölüm 2 için temsilcisi sonuçları Şekil 4Aiçinde gösterilir. Serbest ONPG hidrolize olarak laktaz tablet özü içeren tepki çözüm sarı döner iken Laktaz enzim, yokluğunda denetim tepki açık kalır Orto- nitrophenol. Şekil 4B rasgele birimleri iletişim kuralı, aşağıdaki analiz spektrofotometre kullanarak örnekleri bölüm 4'ten kullanarak miktar gösterir. Reaksiyon 37 ° C'de yürütülürken Orto-nitrophenol reaksiyon buza inkübe zaman en düşük ve en yüksek yapımıdır

Resim 1 : E. coli beta galaktozidaz. (A)beta-galaktozidaz aktif tetrameric yapısı karmaşık gösterilen Escherichia coli, gelen kristal yapısı. (B) Allolactose (kırmızı ile gösterilen) beta galaktozidaz aktif sitesine bağlanır. PDB 1JZ8⁴oluşturulan görüntüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Laktaz enzim eylem. Laktoz laktaz beta-D-galaktoz ve beta-D-glukoz üretmek tarafından hidroliz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Hidroliz, Orto-nitrophenol - Beta -D-galactopyranoside. ONPG hidroliz beta-D-galaktoz ve Ortopedi-(sarı renkte olan) 420 absorbans ölçümü tarafından tahmin laktaz faaliyet izin nitrophenol, üretmeye laktaz tarafından nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Şekil 4 : ONPG hidroliz. Denetim ve tepki tüpler(a)ve Bölüm 4 Protokolü'nün temsilcisi verileri gösteren ONPG hidroliz temsilcisi sonuçlarını, kaydedilen ham absorbans 420 rasgele daxilində gösteren sınıfındaki sayfalarındaki nm, arka plan için düzeltilmiş ve üç farklı sıcaklıklarda (B). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Deneysel durumu	Deneysel değişkenleri
Sıcaklık	0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C
Substrat konsantrasyonu	0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Rekabetçi inhibisyon	5 mM ONPG artı 0 mM, 1 mM, 5 mM veya 10 mM laktoz
Zaman bağımlılığı	0 s, 15 s, 30 s, 1 dk, 5 dk, 10 min, 20 dk
Isı denatürasyon	Laktaz özü ile 100 ° C arasında 10 dk önceden tahlil için ısıtmalı

Tablo 1: deneysel durumu genişletilmiş potansiyel. Laktaz biyoloji belirli yönlerini araştırıyor nüsha gerçekleştirilebilmesi için genişletilmiş deneyler önerdi.

Tartışma

Detaylı bilgi ve anlayış enzim, Enzimatik reaksiyonları ve enzim kinetiği biyoloji, biyomedikal ve farmakoloji kapsayan konular geniş bir yelpazesi için gerekli. Yukarıda açıklanan protokol Laktaz enzim insan sağlığı için ilgili bir örnek olarak daha gelişmiş laboratuar tabanlı deneylerde kullanılan anahtar becerileri sağlayarak enzimatik reaksiyonlar gösteren için kullanır.

Bu iletişim kuralı kasıtlı olarak yorumlanabilir sonuçları kısa bir alanda üretmek için az veya hiç ıslak laboratuvar deneyimi mümkün, izin öğrenciler olarak sağlam olması için dizayn edilmiştir. Reading Üniversitesi School of eczane 2014/2015 öğretim yılında toplam 144 öğrenci 3, gruplar halinde düzenlenmiş, tüm grupları belli bir düzeyde laktaz tabletten enzimatik aktivite tespit etmek mümkün ile "laktaz ölçme" deneme yürüttü ayıklar.

Bu protokol önemli adımlar vardır. İlk olarak, ilk çıkarma verimli, daha sonraki analizler için yeterince etkin enzim solubilization izin önemlidir. Deneyim, ilk yıl lisans öğrencileri bu özetlenen iletişim kuralı takip ederek elde edebilirsiniz; Ancak bazı rehberlik laboratuvar göstericiler gelen bu noktada gerekli oldu. Bu çok aşikar bir nokta gibi görünüyor olsa da, bu protokol başarısında önemli bir faktör dikkatle birimleri ölçmek, doğru tüpler etiket ve yönergeleri izleyin yeteneğidir. Yeterlilik belirli bir düzeyde çok sayıda öğrenci, dikkatli izleme ve öğrencilerin onlar değilseniz durumunda yardım için sormak açık bir istek için kabul edilebilir ne yapacağımı sonraki en büyük başarılı bir tahlil olasılığını sağlar.

Öğrenci değerlendirme deneyler, yorum onların sonuçları ve arka plan bilgi/okuma bağlantı ders malzemesinden verilerden dikkat edilmesi gereken öğrenciler soran sınıfının çalışma sayfası (ek malzeme olarak kullanılabilir), veya daha fazla tarafından yürütülen olabilir ayrıntılı sınıf değerlendirmesi ile sağlanan modeli veri kinetik analizler için çalıştı ve değerlendirilmesi için izin dışarı.

Burada sunulan protokolü bir laktaz aktivitesi tahlil öğretim laboratuvar koşulları altında basit bir örneğidir ve bol bol fırsat daha gelişmiş analizler izin için deney karmaşıklığını artırmak için. Özellikle, sunulan Protokolü enzim kinetiği kavramı bir giriş sağlar ancak deneysel veriler kinetik analizi için izin vermez. Bu nedenle, biz açıklanan protokolü ile ilgilenen özel amaçları ve deneyler taahhüt öğrenci kohort yeteneklerini uygun şekilde adapte kesin detayları ile sınıflar için ilk bir şablon olarak tavsiye ederim. Genişletilmiş deneyler örnekler: tekrarlanan ölçümleri istatistiksel analizi, ile başlayan kinetik, veri çözümlemesi (Biyokimya öğrenciler/majors için uygun) izin vermek için farklı substrat konsantrasyonu kullanarak farklı sıcaklıklarda birkaç farklı tablet ve farklı her (kontrol tabletler, adli tıp öğrencileri/majors için uygun eklenmesiyle) enzim aktivitesinin değerlendirmek öğrenciler, ısı denatürasyon etki değerlendirme veya rekabeti taşıyan laktoz eklenmesi veya laktaz (Tablo 1) inhibitörleri deneyler. Detaylı bir protokol laktaz kinetik analizi için daha önce yayımlanmış¹²oldu.

Bu protokol önemli bir gücü bu Enzimologiya tıpta bir gerçek vaka çalışması ile Enzimologiya ve enzim kinetiği temel bir giriş birleştirir kaldı. Bu bu laboratuvar yapar deneme ilaç, eczane, biyomedikal Bilimler ve ilgili konuları öğrencilere belirli konu ile ilgili. Önemlisi, ciddi bir tıbbi durumun ve daha yaygın bir diyet sorunu laktoz katabolizma ile ilişkili olduğu gerçeğini çok çeşitli tıbbi ve etik sorunları ile öğrenciler yetiştirmek için fırsat sağlar. Bu gen terapisi ve genetik danışmanlık, hem de kullanımı ve Satılık tıbbi ilave için ilgili tartışmalar ilgili ve tıbbi durumlar için genetik test çevre sorunları içerebilir. Bir büyük protokolü çıkarma için kullanılan başlangıç malzeme nedeniyle enzim konsantrasyon kesin tahmini için izin değil kısıtlamadır. Bunun için hesap için bir değişiklik ancak, reaktif sınıf enzim tayini için kullanmak olacaktır. Önemlisi, bu da kinetik Laktaz enzim için daha kesin hesaplanması için sağlayacak.

Sonuç olarak, etkinliğin raporlaması laktaz bir öğretim laboratuvarda, ortamı bir sağlam, ilgi çekici ve ilginç giriş alanı enzim Biyoloji erken evre için üniversite öğrencileri niteliğindedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Laktaz tableti	Lamberts	8511-60
Fosfat tamponlu salin (toz halinde)	Sigma	P3813	Deiyonize suda 100 mM'lik nihai konsantrasyona kadar çözülür
ONPG	Sigma	N1127	Deiyonize suda 5 mM'lik nihai konsantrasyona kadar çözülür
Sodyum Karbonat	Sigma	451614	Deiyonize suda 1 M'lik nihai konsantrasyona kadar çözülür
Deiyonize su	NA	NA
Havaneli ve havan tokmağı	VWR
Spektrofotometre	Jenway 6315
Pipetler	Gilson
15 mL tüpler	VWR
1.5 mL tüpler	Eppendorf
Spektrofotometre küvetleri	Jenway
Girdap	Vorteks cin 2
Santrifüj	Beckman
Buz kovası	VWR
Su banyosu	Termo-Bilimsel
Tartı terazileri	Termo-Bilimsel