Yöntem makalesi

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

DOI:

10.3791/54391

⸱

16 Ocak 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribonükleoprotein parçacıkları, RNA bağlayıcı proteinlerin farklı kombinasyonları yoluyla tüm mRNA'ların biyogenezini ve transkripsiyon sonrası regülasyonunu yönlendirir. Pozisyona bağlı, cis-etkili RNA elementlerinden ve RNA bağlayıcı proteinlerin benzersiz kombinasyonlarından oluşurlar. Spesifik bir RNP'nin bileşimini tanımlamak, gen regülasyonunun temel bir anlayışını elde etmek için esastır. Seçilmiş bir RNP'nin izolasyonu, samanlıkta iğne bulmaya benzer. Burada, asenkron, transfekte edilmiş hücrelerde seçilmiş bir mRNA'nın 5' çevrilmemiş bölgesinde ilişkili RNP'leri izole etmek için bir yaklaşım gösteriyoruz. Bu akraba RNP'nin, seçilmiş virüslerin ve hücresel stres-tepki genlerinin translasyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir.

Gösterilen RNA-protein ko-çökeltme protokolü, proteomik analizler, immünoblotlar veya uygun biyokimyasal tanımlama testleri yoluyla protein bileşenlerinin aşağı akış analizi için uygundur. Bu deneysel protokol, DHX9/RNA helikaz A'nın, aynı kökenli retroviral RNA'nın 5' terminalinde zenginleştirildiğini ve hücre stresi ile ilişkili huR ve junD aynı kökenli mRNA'lar ile ilişkisinin tanımlanması için ön bilgi sağladığını göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon sonrası gen tam olarak çekirdeğin DNA transkripsiyonu ile başlayan, düzenlenir. RNA proteinleri (RBPS) bağlayıcı tarafından kontrol mRNA biogenesis ve metabolizma RNA metabolizması 1-3 ilerlemesi sırasında bir alt tabaka öncüsü mRNA ile ayırmak doçent ve son derece dinamik Ribonükleoprotein parçacıklar (RNP), ortaya çıkar. RNP bileşenleri dinamik değişiklikler mRNA transkripsiyon sonrası kaderini etkileyen ve primer transkript, nükleer kaçakçılığı ve lokalizasyonu, çeviri için mRNA şablon olarak kendi faaliyet ve olgun mRNA nihai ciro işlenmesi sırasında kalite güvence sağlamak.

Çok sayıda protein RNA tanıma motifinin (RRM) dahil olmak üzere korunmuş amino asit etki, sayesinde RBPS olarak tanımlanır, çift kollu bir RNA bağlama alanı (RDB) ve temel artıklarının kısımlarının (örneğin, arginin, lizin, glisin) 4. RBPS rutin vardırimmünopresipitasyon stratejileri ile izole ve soydaş RNA'lar belirlemek için taranmaktadır. Bazı RBPS RNA regulonlarının 5-8 olarak tanımlanan fonksiyonel ilişkili olan önceden mRNA eş düzenler. Bu RBPS kendi aynı kökenli mRNA'lar, ve bazen de kodlayıcı olmayan RNA bileşim içinde değişebilir katalitik RNP oluşturur; kendi benzersiz bağlı ilişkili faktörler, çeşitli kombinasyonları, aynı zamanda bunların etkileşimleri 9 zamansal dizisi, yer ve süresi için.

RNA immünopresipitasyon (RIP) hücrelerden RNP izole etmek ve sekans analizi 10-13 kullanarak ilişkili transkript tanımlamak için güçlü bir tekniktir. Aday hareketle genom çapında için tarama bir mikro-dizi analizi 14 ya da yüksek verimlilik sıralaması (RNAseq) 15 ile kombine RIP ile mümkündür. Bunlar, birlikte-çökeltme antikor 16 yeterince zengindirler ve ayrılabilir Aynı şekilde, birlikte-çökeltme proteinler, kütle spektrometresi ile tespit edilebilir,17. yaklaşım, bitki hücreleri, mantar, virüs ve bakteri çözünebilir lizatları olarak değişebilir, ancak Burada, kültürlenmiş insan hücrelerinden belirli bir aynı kökenli RNA RNP bileşenlerini izole etmek için bir yöntem arayabilir. Şekil 1 'de özetlendiği gibi, malzemenin aşağı akış analiz, aday belirlenmesi ve kabul immunoblotting, kütle spektrometrisi, biyokimyasal enzimatik tahlil, RT-qPCR, mikrodizi ve RNAseq bulunmaktadır.

Transkripsiyon sonrası seviyede gene ekspresyonunu kontrol etmede RNP temel rolü göz önüne alındığında, bileşen RBPS veya erişilebilirlik ekspresyonunda değişiklikler RNA'lar hücre için zararlı olabilir ve nörolojik hastalıkları 18 de dahil olmak üzere hastalıkların çeşitli türleri ile ilişkilidir, aynı soydan gelen. DHX9 / RNA helikaz A (RHA), hücresel ve retroviral kökenli 6 seçilmiş mRNA'ların çevrilmesinin için gereklidir. Bu aynı kökenli RNA'lar olan yapısal olarak ilgili, cis etkili elemanlar sergileyen kendiTranskripsiyon sonrası kontrol elemanının (PCE) 19 olarak belirlenmiş 5 'UTR,. RHA-PCE aktivitesi, HIV-1 de dahil olmak üzere pek çok retrovirüsler, etkin kap bağımlı çeviri için gerekli olan ve JUND 6,20,21, büyüme düzenleyici genlerin. Önemli bir gen (dhx9) tarafından kodlanır, RHA hücre çoğalması ve düşük-regülasyona karşı gerekli hücre canlılığı 22 ortadan kaldırır. RHA-PCE RNP moleküler analiz RHA-PCE etkinliği hücre çoğalmasını kontrol etmek için neden gerekli olduğunu anlamak için önemli bir adımdır.

Kararlı durumda ya da hücrenin fizyolojik pertürbasyon üzerine RHA-PCE RNP bileşenlerinin hassas karakterizasyonu aşağı analiz için yeterli bolluk içinde RHA-PCE RNP seçici zenginleştirme ve yakalama gerektirir. Burada, retroviral PCEgag RNA açık okuma çerçevesinde MS2 kaplama proteininin (CP) için sis etkili RNA bağlanma sitenin 6 kopya ile etiketlenmiş. MS2 kılıf proteini ekzo edildigenously birlikte ifade plazmid transfeksiyon ile PCEgag RNA ile büyüyen hücrelerde RNP Montajı kolaylaştırmak için. Aynı kökenli MS2-etiketli PCEgag RNA MS2 kaplama proteini içeren RNP hücre özütü immunoprecipitatesi manyetik boncuk (Şekil 2a) üzerinde alınmıştır. seçici PCE bağlı RNP bileşenleri elde etmek için, immobilize RNP RNase H aktivitesi için alt-tabaka olan bir RNA-DNA melezi oluşturan PCE distal dizilerine tamamlayıcı olan bir oligonükleotid ile inkübe edildi. PCE çevrilmemiş bölge 5 '5' ucu 'konumlandırılmış olduğundan, oligonükleotid retroviral başlangıç ​​sitesine (gag start kodonu) bitişik RNA dizilerine tamamlayıcı. yıkama sıvısı olarak toplandı immobilize RNP, serbest 5 'UTR kompleksi kodon gag başlangıcına yakın RNaz H bölünme. Daha sonra, örnek captu onaylamak için PCEgag ve SDS PAGE ve immunoblot yakalamayı teyit etmek için RT-PCR ile değerlendirildiHedef MS2 kılıf proteini yeniden. PCE ilişkili RNA bağlayıcı proteinin doğrulama DHX9 / RNA helikaz A, sonra gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
tampon kompozisyonlar
Yıkama Tamponu:
50 mM Tris-HCI, pH 7.4
150 mM NaCI
3 mM MgCI2
Düşük tuz tamponu:
20 mM Tris-HCI, pH 7.5
10 mM NaCI
3 mM MgCI2
2 mM DTT
1x proteaz inhibitör kokteyli EDTA'sız
RNaz dışarı 5 ul / ml (RNaz inhibitörü)
Sitoplazmik Lizis Tampon:
0.2 M sukroz
% 1.2 Triton X-100
NETn-150 Yıkama Tamponu:
20 mM Tris-HCI, pH 7.4
150 mMNaCI
% 0.5 NP-40
3 mM MgCI2
% 10 Gliserol
Bağlama Tamponu:
10 mM HEPES pH 7.6
40 mM KCI
3 mM MgCI2
2 mM DTT
% 5 gliserol

Tablo 2: Tampon kompozisyonlar.

Hücreler ve bağlanma matrisinin hazırlanması 1.

  1. Kültür, 10 cm'lik tabak alt izdiham (% 80) ile ilgi konusu bir hücre çizgisi. bir FLAG-etiketli NLS-MS2 kaplama proteininin bağımsız İmmüno için (PPI) 10 cm tabak kullanın. FLAG-epitop etiketi antiserumlar kullanılarak IP gerçekleştirin. FLAG-etiketli MS2 kılıf proteini plazmid ifade edilirken, hasat 20 peşin hücreler 24-48 saat transferinde.
    NOT: Belirli bir RNP nükleer veya sitoplazmadan zenginleştirilmiş olabilirBöyle bir sukroz degrade kesirleri olarak ic lizatları veya biyokimyasal-fraksiyone hazırlık. Ek bir negatif kontrol tesis paralel olmayan transfekte edilmiş hücrelerin lizatı hasat önerilir.
  2. Transfer 1.7 ml mikrosantrifüj tüp protein G manyetik boncuk çamurunun IP başına 60 ul.
  3. mikrosantrifüj tüpleri depolama çözümünden boncuk ayırmak için bir mıknatıs rafa yerleştirilir.
  4. dikkatli bir mikropipet ile o kadar çizerek depolama çözümü çıkarın.
  5. mıknatıs raftan borusunu sökün.
  6. Yıkama ve 1 x yıkama tamponu 600 ul boncuk (boncuk 10 kez kullanılan hacim) dengelenmesi (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 3 mM MgCl2 ve 150 mM NaCI) ile 3 ve uç üzerinde uç döndürme Oda sıcaklığında dak.
  7. mıknatıs rafa yerleştirilir ve yıkama tamponu çıkarın.
  8. dengelenmiş pr 1x yıkama tamponu ve imüno FLAG antikoru 10 hacimleri (600 ul) ekleyinimmüno-çökeltilmesinin antikor konjügatı için en az 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında ve döndürme ucu-üzerinde-uç (bir immünopresipitasyon üreticiler tarafından miktarına göre) otein G manyetik boncukları. Uygun bir antikor negatif kontrol olarak, ilgili izotip IgG kullanın.
  9. boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için mıknatıs rafa yerleştirilir.
  10. Mıknatıs raf tüpü alınır ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1 x yıkama tamponu ve dönme, 10 hacim (600 ul) ile antikor-eşlenik boncuklar yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin.
  11. mıknatıs rafa yerleştirilir ve yıkama tamponu çıkarın.

2. Hasat RNP

NOT: Aşama 1.8 sonrasında inkübasyon süresi boyunca RNP hazırlayın.

  1. Aspirasyon ile hücrelerin kültür ortamı çıkarın ve buz soğukluğunda 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde 1-5 ml (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri. Islak çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın,4 ° C'de 4 dakika boyunca 226 x g'de santrifüj ile toplanmadan önce yapışmayan hücreler.
  2. 3 mM MgCI2, 10 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 x proteaz inhibitör kokteyli, EDTA-içermeyen ve 5 ul / ml buz gibi soğuk, düşük tuzlu tampon (20 mM Tris-HCI, pH 7.5 içinde 375 ul ekle RNaz hücre pelletine inhibitörü) ve 5 dakika buz üzerine yerleştirerek şişme sağlar.
    NOT: Hücre pelet büyüklüğüne göre düşük tuz tamponu hacmi Terzi. 10 cm plaka 1,2 x 10 6 hücre için tampon 375 ul yeterlidir.
  3. Sitoplazmik hücre lizatı toplama, buz sıcaklığında lizis tamponu 125 ul (0.2 M sukroz /% 1.2 Triton X-100), ve daha sonra bir buz kovası önceden soğutulmuş bir Dounce homojenleştirici ile 10 vuruş yapar.
    NOT: Toplam hücre özü toplamak için, standart RIPA liziz tamponu nükleoplazmanın / kromatin çözündürülmesi için tavsiye edilir.
  4. 1 dakika boyunca en yüksek hız (16.000 xg) bir mikrofüj Spin; Bu enkaz a süpernatant silecektirnd çekirdekler.
  5. buz üzerinde olmuştur, yeni bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın. Böyle Bradford Tahlil 23 olarak standart laboratuvar tercih edilen metot ile toplam protein konsantrasyonunu belirlemek. Bir Western blot analizi için, en azından% 10 bir kısım rezerve bir giriş kontrol olarak kullanılır. immüno-çökeltme için hemen hasat hücre lizatı kullanarak veya gelecekteki analiz için -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Bizim tecrübelerimize göre, bu örnekler saklanabilir ve bütünlüğü ödün vermeden immünopresipitasyon analizi için birkaç ay sonra kullanılır.

3. Immunoprecipitation

  1. Hedef antikor eşlenik boncuklar adım 2.5 belirlenen protein konsantrasyonu dayalı Hasat edilen hücre lizatının istenen hacmi, ekleyin. 1x yıkama tamponu kullanılarak, 600 ul kadar toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca son aşırı ucunu döndürün.
    NOT: Bu süre oluşturmak için yeterlidirSpesifik-olmayan bağlanma en aza indirirken, yüksek afiniteli RNP kompleksleri sağlam bir izolasyon. Yukarıda da belirtildiği gibi, daha önce hazırlanmış boncuk-antikor kompleksleri ile inkübe ardından 1 x yıkama tamponu ile 1 ve: bir sükroz gradyanı kesirleri, en az 1 gibi alternatif RNP kaynaklarını seyreltilir.
  2. inkübasyon 90 dakika sonra, boncuklar toplamak için mıknatıs raf IP tüp yerleştirin. flow-through olarak süpernatant saklıdır.
    NOT: Bu ilk akış yoluyla IP etkinliğini ölçmek için önemli bir kontrol örneğidir. Bir bağışıklık deneyi, bir IP verimliliğinin bir göstergesi, aynı zamanda incelenen etkileşimlerin spesifitesi sağlayacaktır. Aşağı analiz için bu süpernatant tutmak için tavsiye edilir.
  3. 150 mM NaCI,, 3 mM MgCl2,% 0.5 NP40, buzla soğutulmuş NETn-150, yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 hacim (600 ul) ile RNP bağlı antikor-eşlenik boncuklar yıkayın Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca dönme altında,% 10 gliserol). adımı 3 kez tekrarlayın.
    NOT: Bu tampon lizis tamponu farklıdır ve etkili zayıf ya da spesifik olmayan dernekler azaltır.
  4. Ve yedek% 10 Nihai yıkamayı takiben, buz soğukluğunda 1 x bağlayıcı tampon (40 mM KCI, 3 mM MgCl2,% 5 gliserol, 2 mM DTT, 10 mM HEPES, pH 7.6), 60 ul immobilize RNP kompleksleri tekrar süspansiyon Western blot ve RNA izolasyonu için% 20 immobilize karmaşık boncuk.

4. Elüsyon

  1. buz soğukluğunda 1 x bağlayıcı tampon ile 100 ul'ye geri kalan hacim ayarlama ve 3 dakika boyunca 70 ° C'de tüp ısıtın.
  2. aynı kökenli RNA-protein kompleksleri ayırmak için, ilgi konusu RNA'nın 3 'sekansı, sınır tamamlayıcı olan bir ~ 30 nt DNA oligonükleotid ekleyebilir ve hafif sallanan, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir (oligonükleotidin 100 nM yeterlidir).
    Not: oligonükleotid çalıştırma sitesi, bir exampl olarak kullanılan PCE yapının çeviri bitişik nükleotit kalıntısı elde etmek, anti-duyarlı olanBu protokol e. Uygun sekansı tamamlayıcı ~% 40 GC içeriğine tarafından sağlanır. hedef RNA'nın asgari tamamlayıcı bölgeye verimli hibridizasyon için antisens oligonükleotidi tasarlayın.
  3. tüpe RNaz H 5-10 adet ekleyin ve RNA RNA'ya yapışacak şekilde 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe: DNA hibritidir. steril 1.7 ml mikrosantrifüj tüp süpernatantı aktarın; Bu örnek ilgi yakalanan RNP kompleksleri içerir.
    Not: aynı kökenli RNA erişilebilirlik bağlı olarak, Rnaz H tedavi iki veya daha fazla devre alt analizler için örnek zenginliğini artırmak için yararlı olabilir.
  4. bilinen ilişkili proteinler ve RT qPCR ardından RNA izolasyonu için eluat% 20 bir Western blotta eluat% 20 kullanın. Geri kalan% 60 kütle spektrometresi için kullanılabilir ya da protein bileşenlerini tanımlamak için.
  5. Buna paralel olarak, RNA izolasyonu ve RT-PCR analizi ile ayrılmış hücre lizatının bir kısım tabi. bu assessment bir RNP kompleksi içinde RNA zenginleşme bir gösterge sağlar.
    Not: RNase H ile bölünmesini immunuoprecipitated karmaşık RNP serbest etkili olduğunu tespit etmek için bir kontrol Western blot izole edilmiş bir protein preparatı kullanılması.

5. Protein elektroforezi ve Western Blot Analizi

  1. Standart laboratuar protokolüne göre SDS-PAGE ve bağışıklık beneklenme analizi, toplam numune konusu yaklaşık% 10-20.
    Not: Bu adım aşağı RNA analizinden önce, IP verimlilik ve özgüllüğü doğrulamak için hizmet vermektedir. Aynı zamanda, izole edilmiş RNP kompleksinin protein bileşiminin değerlendirilmesi için de kullanılabilir.

Immünopresipitasyon RNA 6. Koleksiyonu

Not: RNA izolasyonu tarif edilen protokol izlenerek Trizol yöntemi veya yapılabilir.

  1. oda t yeniden süspanse asit guanidinyum tiyosiyanat reaktif 750 ul toplam örnek yarısı ve inkübe5 dakika boyunca önceden yakalanan PCE-RNP komplekslerinden RNA ayıklanması için emperature.
  2. tüpe kloroform 200 ul ekle, 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve 3 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjden sonra, yeniden bir tüp içine, sulu fazı toplayın ve izopropanol eşit hacimde ekleyin. İyice karıştırın ve en azından 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. örnek glikol mavi 1 ul ekleyin ve gelecekteki bir tarihte etkili yağış veya işlenmek üzere dondurucuda -20 ° C'de saklayın.
  4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Dikkatle toplamak ve RNA pelet rahatsız etmeyecek şekilde süpernatant atın; Bir P-200 mikro pipet kullanımı, bu işlemi kolaylaştırmak için tavsiye edilir.
  5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,000 x g'de, her tüp, girdap ve santrifüj tüpleri% 75 etanol içinde 500 ul ekle. Dikkatle toplamak ve adım 6.4 olarak süpernatant atın. Hava-RNaz içermeyen su, 100 ul 2-3 dakika ve tekrar süspansiyon pelet kurutulur.
    NOT: tabanda bir sorunu önlemek için zamanı pelet hava kurur uzatmak etmeyin.
  6. bir RNA temizleme kolona RNA örnek 100 ul uygulayın. Üreticinin protokolü kullanarak işleyin. 3 aya kadar -80 ° C 'de RNaz içermeyen su ve mağaza 30 ul RNA Zehir.
    Not: Bu izole edilmiş RNA, RT-PCR, gerçek zamanlı (qPCR), mikrodizi ve RNA sıralaması ile alt baş analizi için de uygundur. RNP ve ilgi RNP izole edildiği verim bolluğu bağlı olarak, aynı lizat alt analizler için uygun yeterli bir RNA üretmek için IP iki veya daha fazla devre tabi tutulabilir.

PCR ile cDNA 7. RNA ters transkripsiyon ve amplifikasyon

  1. manufa göre, yüksek kaliteli, ters transkriptaz (RT) ile rastgele bir primer tarafından ters transkripsiyon için, izole RNA Konucturer talimatları.
  2. ilgi RNA yükseltmek için, RNase H ile bölünmesini dizisi içinde bir gen-spesifik antisens primer tasarımı. Antisens oligonükleotit, rasgele bir primer veya bir oligo-dT primeri benzer miktarlarda kullanarak (Malzeme tabloya bakınız).
    Not: Oligo-dT primeri ve poli-adenylated mRNA'nın RT-PCR reaksiyonları için pozitif kontrol reaksiyonları sağlar.
  3. Yedek cutoff tanımlar ve standart bir eğri oluşturmak için negatif kontrol lizat IP ve pozitif kontrol DNA numuneleri ile paralel olarak yapılan hazırlayıcı qPCR RT reaksiyonu (1 ul),% 5. hazırlayıcı qPCR BT değeri standart eğri aralığının dışında ise, üst üste 1 RT reaksiyonu sulandırmak: 5 dilüsyon ve adım 7.2 tekrarlayın.
    NOT: Bir RNA sıralanması ve kütle spektrometresi tekniği için, Ek Yöntem dosyasına bakın. T tıklayınızo Bu Ek Yöntem dosyasını görüntülemek. (Indirmek için sağ tıklatın.)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki RIP sonuçları retroviral gag RNA'lar tespit ve co-çökelti hücresel RNA'lar DHX9 / RHA ile, HIV-1 6, JUND 6 ve Hur (Fritz ve Boris-Lawrie, yayınlanmamış) de dahil olmak üzere seçildi. Retroviral 5 'UTR çekirdekte DHX9 / RHA ile birlikte çökeltmek için ve poliribozomların ilgili sitoplazmada bir arada izole etmek için ortaya konmuştur. Bu benzersiz BDT -Oyunculuk transkripsiyon sonrası kontrol elemanının (PCE) 6 olarak tanımlanır. çoğalan hü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan RNP izolasyon ve aynı kökenli RNA tespiti stratejisi belirli bir RNA-protein etkileşimini inceleyen ve eş düzenleyen aday proteinleri keşfetmek hücreler belirli bir RNP seçici bir araçtır.

RNP izole yapmak için oligonükleotid yönlendirilmiş RNase H ile bölünmesini kullanmanın avantajı yakalamak ve özellikle ilgi cis-hareket eden RNA elemanına aşağı bağlanmış heterojen RNP fazla RNP cis-hareket eden RNA eleman analizi yeteneğidir. Belirli bir RNP bir soydaş RNA bolluğu RNaz H...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar minnetle NIH P50GM103297, P30CA100730 ve Kapsamlı Kanser P01CA16058 tarafından destek için minnettarım.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dynabeads Protein AInvitrogen10002D
Dynabeads Protein GInvitrogen10004D
Anti-FLAG antikoruSigmaF3165
Anti-FLAG antikoruSigmaF7425
Anti-RHA antikoruVaxronPA-001
TRizol LS reaktifiYaşam teknolojisi10296-028
RNase HAmbionAM2292
KloroformFisher ScientificBP1145-1
İzopropanolFisher ScientificBP26184
RNaeasy temizleme sütunuQiagen74204
Omniscript ters transkriptazQiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
Proteaz inhibitörü kokteyliRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
GliserolFisher Scientific17904
Rastgele heksamer primerleriInvitrogenN8080127
Oligo-dT primerleriInvitrogen
PCR primerleriIDTGenine özgü primerler 
RNase H aracılı bölünmeIDTHedef RNA Tripsin için anti-sens astar
Gibco Life teknolojisi25300-054
DMEM doku kültürü ortamıGibco Life teknolojisi11965-092
Fetal sığır serumuGibco Life teknolojisi10082-147
Tris tabanıFisher ScientificBP152-5
Sodyum klorürFisher ScientificS642-212
Magnezyum klorürFisher ScientificBP214
DTTFisher ScientificR0862
SükrozFisher ScientificBP220-212
Nitroselüloz membranBio-Rad1620112
Manyetik stand1.7 ml mikro santrifüj tüpü tutma
Laminer başlıkHayvan doku kültürü için
CO2< / sub> inkübatörüHayvan doku kültürü için
Protein jel aparatıProtein numunesi ayırma
Protein transfer aparatıProtein numune transferi
Kullanıma hazır protein jelleri (%4-15)Protein numunesi ayırma Masa
üstü santrifüjNumuneyi aşağı doğru pelet Masa
üstü döndürücüNumuneyi uçtan uca karıştırın
VorteksNumuneleri karıştırın
AM5730G için PCR amplifikasyonu Oligonükleotid

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18(2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA ImmunoprecipitationRNP IsolationFLAG tagged ProteinMagnetic Bead ConjugationCytoplasmic Lysate PreparationRNase H TreatmentRNA ExtractionWestern Blot AnalysisRT PCR Validation

İlgili makaleler