Method Article

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

DOI:

10.3791/54401

⸱

August 4th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1The School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 2Neuroscience Research Australia, 3Biomedical Imaging Facility, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cildimiz yaşam için esastır. Dış epidermal tabaka, saç folikülleri ve ter bezleri gibi vücudumuzda ve epidermal uzantıları en kapsayan bir çok katlı yassı epitel olan interfolliküler epidermis oluşur. Epidermis ömrü boyunca ve yaralanmaya yanıt olarak rejenerasyon uğrar. Bu sıkı epidermis içinde ve epidermis ve dermis arasındaki birden çok etkin düzenleyici mekanizmalar tarafından düzenlenir bazal epidermal kök / progenitör hücre popülasyonlarının K14-ifade ederek etkindir. Bu makale tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve K14 protein ekspresyonu görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanır, Ki67 hücrelerin hızla çoğalan etiketli, Nil Kırmızı Sebositler etiketli ve 3D tek hücre çözünürlükte DAPI nükleer etiketleme. Bu yöntem, doğru bir değerlendirme ve cilt anatomi ve patoloji ölçümü ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri sağlar. KÜBİK protokol thtek bir hücre çözünürlükte tam kalınlıkta deri biyopsilerinde moleküler ve hücresel etkileşimleri araştırmak için bugüne kadar mevcut e en iyi yöntem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cildimiz yaşam için esastır. Bu üç ana tabaka, dış epidermis, dermiş ve deri altı oluşur. epidermis oldukça rejeneratif dokudur. Çoğunlukla keratinositlerde oluşan bir skuamöz tabakalı epitel olduğunu. Keratinositler bazal tabakada doğmuş ve ayırt ederken bazal üstü katmanları üzerinden yukarı doğru hareket, ve sonunda onların doğumdan sonra yaklaşık bir ay dış boynuzlaşan katmanda dökülür vardır. Epidermis, saç foliküllerinin ve yağ bezleri içeren uzantıları bir dizi geliştirir. Saç köklerinin de hayat 1 boyunca döngüsel bir şekilde yeniden. Epidermisin rejeneratif kapasitesinin interfolliküler epidermis ve saç folikülü 2 bazal tabakasında bulu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Tüm prosedürler onaylı ACEC protokolü 13 / 64B altında UNSW Avustralya'da Hayvan Bakım ve Etik Komitesi (ACEC) yönergeleri izleyin.

Şeffaf Fare Cilt Doku 1. Hazırlık

Not: Bu çalışmada kullanılan tüm fareler, bir C57BL / 6 genetik geçmişi vardı

  1. Fare cilt dokusunun toplanması.
    1. Insanca servikal dislokasyon ile fareler euthanize.
    2. Dikkatle cildi yara değil düzeltici alarak özenle ilgili cilt alanından tüyleri.
    3. Yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 70 etanol ile dezenfekte edilmesi için.
    4. forseps ile dorsal boyun cildi kaldırın ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin vahşi tipli fare tam kalınlıkta dorsal deri biyopsileri, bazal keratinosit markör Keratin14 (K14) bağlanan bir antikor ile boyandı, netleştirildi ve çekirdekleri DAPI boyama çözeltisi (Şekil 2 ve Film 1) ile zıt.

DAPI-pozitif çekirdekler numune (Şekil 2A, C) boyunca görünür ve K14 boyama sadece interfolliküler epidermisin tek hücreli kalın bazal katmanında görünür oldu, ve yağ bezleri (siyah yıldız), dış kök kılıflar özetleyen saç f.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cilt gelişimini ve homeostazisini kontrol eden düzenleyici mekanizmalar en yaygın cilt morfolojisi, hücre popülasyonlarının veya protein ifadesi sadece sınırlı bir takdir sağlayan antikorlar ile doku bölümlendirilmeleri ve histolojik boyama veya etiketleme kullanarak 2D çalışılmıştır. Bir dizi yöntem epidermal bütün bağlar 10-13 3 boyutlu tek hücre çözünürlükte hücre ve proteinlerin mekansal organizasyon görselleştirme artırmak için geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları ancak özellikle saçlı deri kullanılarak .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz hayvan deney ile destek için Avustralya Bio-Kaynaklar (Garvan Enstitüsü, Avustralya), Biyolojik Kaynaklar Merkezi (UNSW Avustralya) ve Hayvan Bakım ve Etik Komitesi teşekkür ederim. Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Proje Hibe APP1062720) tarafından desteklenmiştir. Dr. Cesar P. Canales bir CONICYT-Becas Şili bursu (# 72101076) alıcıları olduğunu. Sayın Bassem Akladios UNSW Avustralya tarafından Üniversitesi Uluslararası Lisansüstü Ödülü bir alıcı.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ParaformaldehitSigma-Aldrich P6418
Etanol %96 (pişmemiş)Kimyasal tedarikUN1170
Nil KırmızıSigma-Aldrich 72485-100MG
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Roche10236276001
N, N, N ', N' -tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiaminMerck Millipore821940
Polietilen glikol mono-p-izooktilfenil eterMerck Millipore648462
Triton X-100Merck Millipore 648462
SükrozSigma-Aldrich S0389
Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) BileşikDoku-Tek4583
anti-Keratin14 antikoruCovancePRB-155P
anti-Ki67 antikoru Abcamab16667
Eşek anti-tavşan Alexa 594Yaşam TeknolojileriA21207
DimetilsülfoksitSigma-Aldrich D2650
ÜreMerck Millipore66612
2,2 & prime;, 2 & prime; '-nitrilotrioetanolMerck Millipore137002
Konfokal MikroskopNikon Instruments IncNikon A1 - Konfokal Mikroskop
cruZer6 Yüz DüzelticiBraunBraun cruZer6 Yüz
Sodyum azidSigma-Aldrich 
438456

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
  2. Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
  3. Hardy, M. H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CUBIC ProtocolSkin Biopsy PreparationProtein Expression VisualizationSingle Cell ResolutionConfocal Microscopy ImagingK14 Protein ExpressionKi67 Proliferating CellsNile Red SebocytesDAPI Nuclear LabelingEpidermal Anatomy Analysis

Related Articles