KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

Özet

Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.

Özet

Cildimiz yaşam için esastır. Dış epidermal tabaka, saç folikülleri ve ter bezleri gibi vücudumuzda ve epidermal uzantıları en kapsayan bir çok katlı yassı epitel olan interfolliküler epidermis oluşur. Epidermis ömrü boyunca ve yaralanmaya yanıt olarak rejenerasyon uğrar. Bu sıkı epidermis içinde ve epidermis ve dermis arasındaki birden çok etkin düzenleyici mekanizmalar tarafından düzenlenir bazal epidermal kök / progenitör hücre popülasyonlarının K14-ifade ederek etkindir. Bu makale tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve K14 protein ekspresyonu görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanır, Ki67 hücrelerin hızla çoğalan etiketli, Nil Kırmızı Sebositler etiketli ve 3D tek hücre çözünürlükte DAPI nükleer etiketleme. Bu yöntem, doğru bir değerlendirme ve cilt anatomi ve patoloji ölçümü ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri sağlar. KÜBİK protokol thtek bir hücre çözünürlükte tam kalınlıkta deri biyopsilerinde moleküler ve hücresel etkileşimleri araştırmak için bugüne kadar mevcut e en iyi yöntem.

Giriş

Cildimiz yaşam için esastır. Bu üç ana tabaka, dış epidermis, dermiş ve deri altı oluşur. epidermis oldukça rejeneratif dokudur. Çoğunlukla keratinositlerde oluşan bir skuamöz tabakalı epitel olduğunu. Keratinositler bazal tabakada doğmuş ve ayırt ederken bazal üstü katmanları üzerinden yukarı doğru hareket, ve sonunda onların doğumdan sonra yaklaşık bir ay dış boynuzlaşan katmanda dökülür vardır. Epidermis, saç foliküllerinin ve yağ bezleri içeren uzantıları bir dizi geliştirir. Saç köklerinin de hayat ¹ boyunca döngüsel bir şekilde yeniden. Epidermisin rejeneratif kapasitesinin interfolliküler epidermis ve saç folikülü ² bazal tabakasında bulunan kök ve projenitör hücrelerinin varlığı ile sağlanır.

Birçok sinyalleme hatları, epidermal gelişim ve yenilenme implike edilmiştir. Bunlardan bazıları içinde meydanaörneğin kirpi yolunun sadece epidermis. Diğer sinyal olayları dermis ve epidermis ³ arasında gerçekleşecek. Örneğin, dermis Wnt sinyal saç folikülü gelişimi için önemli olduğu düşünülmektedir ve bunlar etkinleştirmek için anajen başlangıcında dermal papilla tarafından salgılanan saç folikülü çıkıntı kök / progenitör hücre çoğalması ve saç folikülü büyüme ^4.. Daha iyi böyle cilt kanseri gibi rejeneratif cilt hastalığında tedirgin olabilir nasıl anlamak için epidermal gelişim ve yenilenme kontrol hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir.

Bu makalede, bir C uzuv açıklanır U tüm montaj cilt hazırlıklarını açıklık ve konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte 3 boyutlu protein ekspresyonu görselleştirmek için B yağmur ben maging kokteyller ve C omputational analiz (CUBIC) protokolünü ^5-7 nobstructed. Kübik yöntemi cilt daldırma içerirİki aminoalkol bazlı kimyasal kokteyller doku. Bu çözümler tek bir hücre çözünürlükte immunodeteksiyon izin şeffaf ve proteinler sağlam dokuyu bırakarak, cilt numunede kırılma indeksleri ayarlayın.

interfolliküler epidermis ve saç folikülü keratinosit popülasyonları Böylece kübik protokolü, bazal kullanarak ve prolifere olan, anti-Keratin14 (K14) ve anti-Ki 67 antikorları kullanılarak vahşi tip farelerde tam kalınlıkta deri biyopsi görüntülenmiştir. wild tip cilt biyopsilerinde yağ bezleri de Nil Kırmızı boyama kullanılarak görüntülendi. Son olarak, vahşi tip ve hiperplastik YAP2-5SA-ΔC cilt biyopsilerinde bazal keratinosit popülasyonları ⁸ karşılaştırıldı.

Bu KÜBİK protokol tek hücre çözünürlükte tam kalınlıkta deri biyopsi protein ifadesinin görsel değerlendirmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş deride epidermal anatomi ve morfolojik kusurları takdir önemli bir araçtırfareler ve epidermal geliştirme ve yenilenme altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Tüm prosedürler onaylı ACEC protokolü 13 / 64B altında UNSW Avustralya'da Hayvan Bakım ve Etik Komitesi (ACEC) yönergeleri izleyin.

Şeffaf Fare Cilt Doku 1. Hazırlık

Not: Bu çalışmada kullanılan tüm fareler, bir C57BL / 6 genetik geçmişi vardı

1. Fare cilt dokusunun toplanması.
   1. Insanca servikal dislokasyon ile fareler euthanize.
   2. Dikkatle cildi yara değil düzeltici alarak özenle ilgili cilt alanından tüyleri.
   3. Yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 70 etanol ile dezenfekte edilmesi için.
   4. forseps ile dorsal boyun cildi kaldırın ve makas ile kesi yapmak.
   5. Dorsal sıçan derisine (yaklaşık 1.5 x 4 cm) büyük bir alanını parçalara ayır.
   6. Bir filtre kağıdı üzerinde deri dermis tarafı aşağı düzleştirmek ve numunenin ön-arka yönde not edin.
   7. triPBS içinde taze hazırlanmış% 4'lük paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile doldurulmuş bir 15 ml tüp içinde m filtresi parçalara deri çevresinde kağıt ve bir yer.
   8. 4 ° C sıcaklıkta buzdolabında bir gece boyunca oda sıcaklığında, 1 saat boyunca saptamak veya.
   9. 15 ml'lik bir tüp içinde, PBS içinde yıkayın 2 x 5 dak.
      Not: aşağıdaki (1.1.10 - 1.1.12) doku uzun süreli depolama için isteğe bağlı adımlardır.
   10. Oda sıcaklığında 1 saatlik yıkama adımları sırasında 15 ml tüp içinde etanol (% 25,% 50% 70) artan konsantrasyonu ile PBS içinde parçalara cilt kurutmak.
   11. sonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta 15 ml'lik bir tüp içinde, PBS içinde% 70 etanol içinde dehidre edilmiş deri saklayın.
   12. 4 saat temizlemeden önce oda sıcaklığında 1 saatlik yıkama adımları sırasında 15 ml tüp içinde etanol (% 70,% 50,% 25,% 0) konsantrasyonu ise PBS içinde deri dokusu rehidrate.
2. Fare cilt biyopsileri Takas
   1. 3.85 gr üre ve 3.85 g N, N, N çözülmesiyle CUBIC1 temizleme çözeltisi hazırlayın, N '70 ° C - 60 ayarlanmış bir ısıtıcı üzerinde damıtılmış su 5.38 ml -tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin karışımları bulunur. Sıcak bir karıştırıcı kullanın.
   2. açık ve oda sıcaklığına kadar soğuduktan sonra çözeltiye 2.31 g polietilen glikol mono-p-isooctylphenyl eter / Triton X-100 ilave edin.
   3. yaklaşık boyutları 0.2 x 0.5 cm biyopsi bir jiletle farenin deri kesin ve 15 ml'lik bir tüp içinde CUBIC1 temizleme çözeltisi 5 ml daldırın. saç köklerinin görselleştirme optimize etmek için, biyopsi uzun kenarı örneğinin anteroposterior yönde kesilir emin olun.
   4. 37 ° C 'de, bir hibridizasyon etüvü içinde dönen bir platform üzerine yerleştirin.
   5. 7 gün sonra takas çözümü değiştirin. kullanımdan önce taze CUBIC1 çözeltisi hazırlayın.
   6. 7 gün sonra doku şeffaflık kontrol edin. Gerekirse doku tamamen şeffaf kadar CUBIC1 takas çözeltide biyopsi bırakın.
   7. deri biyopsisi şeffaf sonra,CUBIC1 çözeltisini çıkarın ve bunu, 37 ° C'de 6 saat için doku 4 kez yıkayın 1 x PBS 4 ml.
   8. 37 ° C'de 4 saat süreyle, 15 ml bir tüp içinde, PBS içinde hacim sükroz / ağ% 20 cilt dokusunun yıkayın.
   9. -80 ° C dondurucu içinde bir gece boyunca 15 ml'lik bir tüp içinde, orta optimal kesme ısısı (OCT), Bileşik montaj doku dondurun.
      Not: Bu adım sonraki adımlarda antikor penetrasyon için biyopsisi en geçirgenliğini artırır.

2. İmmünofloresan Boyama

1. 3 saat - 2, oda sıcaklığına kadar 1.2.9 doku) çözülme.
2. Oda sıcaklığında 8 saat boyunca 5 ml PBS, 15 ml bir tüp içinde yıkayın dokusu OCT bileşiği kaldırın.
3. 37 bir karıştırıcı üzerinde, 3 gün boyunca PBST (PBS +% 0.1 Triton-X100): 100 2 ml tüp aktarın biyopsileri, ve her ikisi de 1 seyreltilmiş 1 ml tavşan anti-Keratin14 ya tavşan anti-Ki 67 antikoru doku inkübe C fırında °.
4. 15 ml tüp, transfer biyopsileriND 37 ° C fırın içinde bir çalkalayıcı üzerinde PBST 5 ml 6 saat için doku 4 kez yıkayın.
5. 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde 3 gün PBST içinde 100 ile inkübe: 2 ml tüp aktarın biyopsileri, 1 seyreltilmiş sekonder antikor Alexa594 1 ml anti-tavşan ekleyin.
6. 15 ml tüp aktarın biyopsileri ve 37 ° C fırın içinde bir çalkalayıcı üzerinde PBST 5 ml 6 saat boyunca doku 4 kez yıkayın.
7. 2 ml tüp aktarın biyopsileri, ilave 1 mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) Nükleer karşıt-çözeltisi (1: 1000) PBST içinde ve 37 ° C fırın içinde bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edilir.
8. DAPI counterstaining çözeltisini çıkarın ve 37 ° C fırın içinde bir çalkalama Doku 6 saat 4 kez yıkayın 2 ml tüp PBST 1 ml.
   Not: İsteğe bağlı adım: biyopsiler, en az 3 hafta boyunca% 0.02 sodyum azid ile 1x PBS içinde karanlıkta saklanabilir.

3. Nil Kırmızı Boyama

1. 1 m'lik bir nihai konsantrasyona kadar dimetilsülfoksit (DMSO) Nile Red tozu çözmekug / ml
2. 1 ug / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar, 1 ml PBS 1 ul Nile Red solüsyonu eklenir.
3. Çözülme 2 boyunca oda sıcaklığına 1.2.9 doku) - 3 saat ve oda sıcaklığında 8 saat süre ile 5 ml PBS ile yıkayın.
4. 2 ml tüp biyopsiler aktarın ve oda sıcaklığında 2.5 saat süre ile, 1 ml Nile Red boyama çözeltisi doku daldırın.
5. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 1 ml PBST ile 4 kez 2 ml tüp içinde deri biyopsileri yıkayın.
6. , 2 mi tüpten PBST solüsyonu kaldırma DAPI çekirdek counterstaining çözeltisi (1: 1000) 1 ml ilave PBST içinde ve oda sıcaklığında, gece boyunca inkübe edilir.
7. DAPI counterstaining çözeltisini çıkarın ve oda sıcaklığında 6 saat süre ile deri dokusu 4 kez yıkayın 2 ml tüp içinde PBST 1ml ekleyin.
   Not: İsteğe bağlı adım: biyopsiler, en az 3 hafta boyunca% 0.02 sodyum azid ile 1x PBS içinde karanlıkta saklanabilir.

4. Görüntüleme

1. 50 içeren CUBIC2 temizleme solüsyonu, hazırlayın% Sukroz,% 25 (ağırlık / hacim) üre,% 10 (ağ / hac) (ağ / hac) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol ve% 0.1 (h / h) Triton X-100.
2. 37 ° C bir fırında 24 saat süre ile bir çalkalama 2 ml'lik bir tüp içinde 1 mi CUBIC2 çözelti içinde deri dokusu inkübe edin. Bu adım dokusunun kırılma indeksi eşitlemek olacaktır.
3. doku netlik kontrol edin. açıktır sonra, bir cam lamel üzerine onun daha uzun tarafında tüm deri biyopsisi (0.2 x 0.5 cm) yerleştirin saç köklerinin uzunluğu yönü lamel yüzeyine paralel böyle olduğunu (1. 24 x 60 mm)
   Not: İsteğe bağlı adım: antikor lekeli biyopsiler yaklaşık 7 gün CUBIC2 çözelti içinde saklanabilir. Nil kırmızısı boyanmış biyopsiler olduğunda, en fazla 1 gün için CUBIC2 çözelti içinde saklanabilir ve kısa sürede görüntülü olmalıdır.
4. Görüntüleme odası hazırlayın (Şekil 1)
   (F, mavi tack hamur veya benzeri oynamak, ve 2 lamelleri (24 x 50 mm): görüntüleme odasının hazırlanması için gerekli Sarf şunlardır: NotŞEKIL 1 A).
   1. Mavi yapışma iki ince şeritler (çap yaklaşık 1 mm x 2 cm), ve iki lamelleri (Şekil 1B) hazırlayın.
   2. Cilt biyopsisi (Şekil 1C) için yeterli alan sağlayan bir kapak kayma mavi tack şeritler yerleştirin. 4.4.3)
   3. CUBIC2 çözeltisinin bir damlası (Şekil 1c) lamel şeritler arasındaki deri biyopsisi yerleştirin.
   4. İkinci lamel (Şekil 1D) ile deri biyopsisi örtün.
5. konfokal mikroskop aşamasında üzerine monte deri biyopsisi ile görüntüleme odasına yerleştirin ve hafif yolun içine doku taşıyın.
6. Ilgi floresan lekeli bölgeleri tanımlamak için bir cıva veya halojen ışık kaynağına ve standart Epifloresans filtreleri (örneğin, DAPI / GFP / CY3 / CY5) kullanarak örnek tarayın.
7. (10X ve 20X objektif (NA 0.75) ve standart konfokal floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak, örneğin., DA ile ilgi görüntü bölgeleriPI lekeli örnekleri 405 nm lazer ile aydınlatmak ve 425 arasındaki floresan sinyali toplamak - 475 nm ve Alexa Fluor 594 veya Nil Kırmızı lekeli örnekleri ile bir 561 nm lazer ile aydınlatmak ve 570 arasındaki floresan sinyali toplamak -) 620 nm.
8. Mikroskop Z-yığın görüntü elde etme yazılımı kullanarak ilgi her bölgenin görüntü Z-yığınlarının oluşturun (örneğin., Aşağıda tarif edildiği gibi yazılım 4.13 görüntüleme NIS elemanları kullanılarak).
   1. en uygun lazer gücü ve PMT HV sağlamak / Ofset ayarlar örnek floresan toplamak için seçilmiştir.
   2. "Toplama Controls" dan "ND Toplama" araç çubuğunu açın.
   3. (Diğer tüm sekmeleri seçilmemiş olmasını sağlamak) "Z serisi Setup" sekmesini seçin.
   4. Canlı Tarama yapılırken, numunenin üstüne odaklanmak ve "En İyi" düğmesine basın.
   5. numunenin altına Odak ve "Alt" tuşuna basınız.
   6. Giriş akımı adım boyutu (ya da basın optimize adım boyutu düğmesi).
   7. önss butonuna "Şimdi çalıştır".
   8. Bireysel Tiff görüntü yığınlarının olarak sonuçtaki Z-yığınlarının (görüntü Z-yığını başına 1 florokrom) kaydedin.
9. 3B analiz yazılımı kullanılarak ilgi 3 boyutlu hacim bölgelerinin yeniden görüntü Z yığınlarının kullanarak (örn., Aşağıda tarif edildiği gibi Imaris x64 7.2.3 kullanarak).
   1. analiz yazılımı başlatın.
   2. Seçin 3D ses üretimi için araç çubuğundaki düğmesini "aşmak".
   3. Açık İlk renkli görüntü Z-yığını (örneğin., DAPI).
   4. ek renk kanalları, florokrom başına bir kanal eklemek için 'kanal eklemek' aracını kullanın. Böylece DAPI ve Alexa Fluor 594 fluorochromes ikisini de içeren bir numune iki kanalı gerektirir.
   5. Yukarıdaki 4,7 saptandığı gibi, (XYZ) doğru piksel (voksel) boyutlarını ayarlamak için "Görüntü Özellikleri" aracını kullanın.
   6. Gerektiği gibi kanal renklerini değiştirmek için "Ekran Ayarı" aracını kullanın (örneğin, mavi için DAPI kanalı ayarlamak Alexa Fluor kırmızı 594 kanal).
   7. po içinGörüntü penceresinde 3D hacim lan de, gerektiği gibi tıklayın ve sürükle hacmi bilgisayar fareyi kullanın.
   8. 3D görüntü ekran görüntüleri oluşturmak için araç çubuğundaki "Snapshot" aracını kullanın.
   9. 3D örnek rotasyon film oluşturmak için araç çubuğundaki "Animasyon" aracını kullanın.

Sonuçlar

Yetişkin vahşi tipli fare tam kalınlıkta dorsal deri biyopsileri, bazal keratinosit markör Keratin14 (K14) bağlanan bir antikor ile boyandı, netleştirildi ve çekirdekleri DAPI boyama çözeltisi (Şekil 2 ve Film 1) ile zıt.

DAPI-pozitif çekirdekler numune (Şekil 2A, C) boyunca görünür ve K14 boyama sadece interfolliküler epidermisin tek hücreli kalın bazal katmanında görünür oldu, ve yağ bezleri (siyah yıldız), dış kök kılıflar özetleyen saç f...

Tartışma

cilt gelişimini ve homeostazisini kontrol eden düzenleyici mekanizmalar en yaygın cilt morfolojisi, hücre popülasyonlarının veya protein ifadesi sadece sınırlı bir takdir sağlayan antikorlar ile doku bölümlendirilmeleri ve histolojik boyama veya etiketleme kullanarak 2D çalışılmıştır. Bir dizi yöntem epidermal bütün bağlar ^10-13 3 boyutlu tek hücre çözünürlükte hücre ve proteinlerin mekansal organizasyon görselleştirme artırmak için geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları ancak özellikle saçlı deri kullanılarak ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6418
Etanol %96 (pişmemiş)	Kimyasal tedarik	UN1170
Nil Kırmızı	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Roche	10236276001
N, N, N ', N' -tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin	Merck Millipore	821940
Polietilen glikol mono-p-izooktilfenil eter	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore 648462
Sükroz	Sigma-Aldrich	S0389
Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) Bileşik	Doku-Tek	4583
anti-Keratin14 antikoru	Covance	PRB-155P
anti-Ki67 antikoru	Abcam	ab16667
Eşek anti-tavşan Alexa 594	Yaşam Teknolojileri	A21207
Dimetilsülfoksit	Sigma-Aldrich	D2650
Üre	Merck Millipore	66612
2,2 & prime;, 2 & prime; '-nitrilotrioetanol	Merck Millipore	137002
Konfokal Mikroskop	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Konfokal Mikroskop
cruZer6 Yüz Düzeltici	Braun	Braun cruZer6 Yüz
Sodyum azid	Sigma-Aldrich

438456