Yöntem makalesi

Üzüm Berry metabolomik ve transkriptomik aracılığıyla yorumlanır Terroir Kavramı

9.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54410

⸱

5 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, yani terroir kavramının, içgörü kazanmak için üzüm berry transkript ve metabolitleri hedefsiz metabolomik, transkriptomik ve çok değişkenli istatistiksel analiz uygulamasını açıklar, dut kalite özellikleri çevrenin etkisi.

Özet

Terroir özellikle habitatlar ve yönetim uygulamalarına göre bu tür asma (Vitis vinifera) gibi ürünlerin özelliklerini etkileyen çevresel faktörlerin kombinasyonu ifade eder. Bu makale belli terroir imzalar çok değişkenli istatistiksel analiz kullanılarak asma çeşidi corvina'nın berry metabolome ve transcriptome tespit edilebilir gösterir. yöntemi ilk uygun bir örnekleme planı gerektirir. Bu olgu sunumunda, Corvina çeşidinde belirli bir klon genetik farklılıkları en aza indirmek için seçildi ve numuneler üç farklı yetiştirme mevsimi boyunca üç farklı makro bölgeleri temsil eden yedi üzüm bağları toplanmıştır. Bir hedefsiz LC-MS metabolomik yaklaşımı MZmine yazılım ve parçalanma ağaç analizine dayalı bir metaboliti kimlik strateji kullanarak verimli veri işleme eşliğinde yüksek duyarlılığı nedeniyle tavsiye edilmektedir. Kapsamlı transcriptome analizi mikrodizileri kullanılarak elde edilebiliriçeren probları farklı terroirs bağlamında tüm farklı ifade genlerin aynı anda analizini sağlayan, ~ tüm tahmin asma genlerinin% 99 kapsayan. Son olarak, projeksiyon yöntemlerine dayalı çok değişkenli veri analizi metabolomik ve transkriptomiks verileri entegre ve bilgilendirici korelasyon tespit ayrıntılı olarak analiz edilecek izin, güçlü bağ bozumu-spesifik etkisini aşmak için kullanılabilir.

Giriş

Bitkilerin genomları, transcriptomes, proteomlarda ve metabolomes dayalı büyük ölçekli veri analizi gibi asma bitkileri ve çevreleri arasındaki etkileşimleri yansıtan şarap terroir özellikleri gibi karmaşık sistemlerin, davranış içine görülmemiş fikir verir. aynı asma klonlar farklı bağlarında yetiştirilen bile bir şarap terroir farklı olabilir çünkü klonal genomları aynıdır, çünkü genomik analiz edilmesi bir fayda sağlamaz. Bunun yerine gen ifadesinin ve şarap kalitesi özelliklerini belirlemek çilek, metabolik özellikler arasındaki ilişkilere bakmak gerekir. mikrodiziler üzerinde immobilize problara hibridizasyon gibi olduğu genel özelliklerini kullanmak kantitatif analiz kolaylaştıran her transkript, benzer kimyasal özelliklere gelen transcriptome yararları seviyesinde gen ekspresyonunun analizi. proteomik A aksine, genel analitik yöntemlernd metabolomik nedeniyle bireysel protein ve metabolitleri büyük fiziksel ve kimyasal çeşitliliğin daha zordur. metabolomik durumunda bireysel metabolitleri boyutu, polarite, bolluk ve volatilitenin çok farklı olduğundan bu çeşitlilik daha aşırı, bu yüzden tek bir ekstraksiyon işlemi ya da analitik yöntem bütünsel bir yaklaşım sunuyor.

uçucu olmayan metabolitler için uygun bir analitik platformlar arasında, yüksek performanslı sıvı kromatografisi dayananlar kütle spektrometrisi bağlanmış (HPLC-MS) çok daha hassas ultraviyole veya diyot dizi dedektörü ile HPLC (HPLC-UV, HPLC-DAD olarak alternatiflere göre ) ya da HPLC-MS ile nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ancak kantitatif analiz, matris etki ve iyon bastırma / iyileştirme 1-3 fenomenler etkilenebilir. (HPLC-E elektrosprey iyonizasyon kaynağı kullanılarak HPLC-MS ile Corvina üzüm meyveleri analiz sırasında bu tür etkilerin incelenmesiSI-MS), düşük tutma süreleri ile şekerler ve diğer moleküller güçlü bir şekilde belki de bu bölgede molekül çok sayıda yansıtan yetersiz olarak gösterdi, ve diğer moleküllerin bolluğu matrisi etkisiyle fazla veya etkilenmez, küçümsenmeyecek ki ancak matris etkisi için veri normalleşme genel sonuçları 4,5'ten üzerinde sınırlı bir etkisi var gibiydi. Burada tarif edilen yöntem, olgunlaşma sırasında üzüm meyveleri içinde yüksek seviyelerde birikmesine orta kutup Metabolitlerin analiz edilmesi için optimize edilir ve bu önemli ölçüde terroir etkilenmektedir. Birlikte renk, tat ve şarap sağlıkla ilgili özelliklerinin belirlenmesi antosiyaninler, flavoneller, Flavan-3-ol, prosiyanidinlerin, diğer flavonoidler, resveratrol, stilbenler, hidroksisinamik asitler ve hidroksibenzoik asitler içerir. HPLC-MS ile niceleme güvenilir olduğu gibi şeker ve alifatik organik asitler gibi diğer metabolitleri nedeniyle effec matrise göz ardı edilirT ve iyon-bastırma fenomeni 5. Bu yöntemle seçilen polarite aralığında, yaklaşım mümkün 6 gibi birçok farklı metabolitleri tespit amaçlamaktadır ki hedefsiz olduğunu.

Asma transkript binlerce eşzamanlı izlenmesine olanak tanır transkriptomik yöntemleri tam asma genom dizisinin 7,8 kullanılabilirliği ile kolaylaştırılır. yüksek verimli cDNA dizileme dayalı erken transkriptomik yöntemler kolektif RNA-Seq teknoloji olarak tanımlanan prosedürlerin bir koleksiyon haline gelecek nesil dizileme gelişiyle gelişmiştir. Bu yaklaşım hızla transkriptomik çalışmalar için tercih edilen bir yöntem haline gelmektedir. Ancak, transkript binlerce melezleme ile paralel olarak sayısal izin mikrodizide dayalı literatürün büyük bir gövde, dedikodu için birikmiş. RNA Seq bir ana teknoloji olmadan önce Nitekim, birçok özel ticari mikroarray platformları olmuştugeliştirilen izin asma transcriptome ayrıntılı olarak incelenecek olan. Platformların çok çeşitli arasında, sadece iki genom transcriptome analizi 9 izin verdi. En gelişmiş dizi böylece her bir deney maliyetlerini azaltarak, tek bir cihazda 12 adede kadar bağımsız örneklerin hibridizasyon izin verdi. 12 alt diziler her 29.549 asma transkript temsil eden 135,000 60-mer probları oluşmaktadır. Bu cihaz, çalışmaları 10-24 çok sayıda kullanılmaktadır. Bu iki platform şimdi kalkıyor ama yeni bir özel mikroarray son zamanlarda dizayn edilmiştir ve ek yeni keşfedilen asma genleri 25 temsil prob daha büyük bir sayı içeren gibi daha yeni bir gelişmeyi temsil etmektedir.

transkriptomiks ve metabolomikler analizi ile üretilen büyük satış veri setleri farklı bir formda arasındaki ilişkiyi belirlemek için çok değişkenli teknikler de dahil olmak üzere veri analizi için uygun istatistiksel yöntemleri gerektirirVerilerin s. En yaygın olarak kullanılan çok değişkenli teknikler projeksiyona dayalı olanlardır ve bunlar gibi temel bileşenler analizi (PCA), ya da, denetimsiz olabilir gibi gizli yapıların diskriminant analizi (O2PLS-DA) 26 çift yönlü dik izdüşümü olarak, denetimli. Bu makalede sunulan protokol örneklerinin gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek için keşif veri analizi ve O2PLS-DA için PCA kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Uygun Malzemeler seçip bir Örnekleme Planı Construct

  1. uygun örnekleme planı geliştirerek deney başlayın. yani bir vaka ile ayrı ayrı her bir plan değerlendirmek hiçbir genel ve evrensel bir yaklaşım vardır. örnekleme planı örnekleme yerleri, zamanları ve hassas örnekleme prosedürü devletler emin olun. Bu vaka çalışmasında kullanılan örnekleme planı için Bkz: Şekil 1.
    NOT: Bu vaka çalışmasında, tek bir klon (. Vitis vinifera cv Corvina, klon 48) üzüm meyveleri Verona ilinde üç farklı makro bölgeleri (Garda Gölü, Valpolicella ve Soave) yedi ticari bağlarından toplanmıştır. Her bağ temel özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Karpuzu Veraison (olgunlaşma başlangıcı), orta olgunlaşma ve olgun çilek karşılık gelen üç zaman noktalarında üç yetiştirme mevsimi (2006, 2007, ve 2008) sırasında toplanmıştır.
    1. katılımların her (vin İçineyard / yıl / olgunlaşma aşaması), randomize yükseklikleri ve bitki üzerinde yerleri ile iki asma satırlar boyunca farklı pozisyonlarda, hasat 30 kümeleri.
    2. görünür hasar ve / veya enfeksiyon belirtileri olanlar kaçınarak, her kümeden rastgele üç meyveleri seçin.
    3. Tekrarlayın üç bağımsız havuzlar elde etmek için 1.1.1 ve 1.1.2 adımları.
    4. meyveleri Deseed ve sıvı azot içinde hemen perikarp dondurma.
    5. Otomatik değirmen değirmeni ile her havuzdan 10 dondurulmuş meyveleri ezmek ve iki eşit parçaya, transkriptomik analiz için tek ve metabolomik analiz için birine her toz örnek bölün.
    6. -80 ° C'de tozlar saklayın.
AM BA BM CS FA MN PM
Makro-zone Soave Garda Gölü Valpolicella Garda Gölü Valpolicella Valpolicella Soave
Yüksekliği (m) 250 120 450 100 130 250 130
anaç 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
satır yönü EW NS EW EW EW NS NS
Eğitim sistemi Tepegöz Sistemi (Pergola) Tepegöz Sistemi (Pergola) Dikey Çekim Konumlandırma (Guyot) Tepegöz Sistemi (Pergola) ısıtılmasındanreklam Sistemi (Pergola) Dikey Çekim Konumlandırma (Guyot) Dikey Çekim Konumlandırma (Guyot)
toprak tipi siltli kil verimli toprak kil verimli toprak Killi toprak silt tın Killi toprak
Dikim düzeni (m) 3.20 x 1.00 4.50 x 0.80 4.00 x 1.25 3.50 x 1.20 3.50 x 0.75 2.80 x 1.00 1.80 x 0.80
Toplam kireç% 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
Aktif kireç% 0.5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
kum% 15 47 66 42 29 13 36
loam% 43 36 21 37 39 67 36
kil% 42 17 13 21 32 20 28
toprak pH 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
Organik madde (%) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
Değiştirilebilir fosfor (mg / kg) 26 73 73 68 48 47 64
Değiştirilebilir Potasyum (mg / kg) 190 376 620 230 168 154 126
Değiştirilebilir Magnezyum (mg / kg) 272 468 848 623 294 293 183
Değiştirilebilir Kalsiyum (mg / kg) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
Berry indirgeyici şekerler arasında 2006 211,25 ± 1.20 176,20 ± 0.42 187,40 ± 0,00 203,70 ± 1.13 212,55 ± 0,64 195,20 ± 0,00 211,65 ± 0,64
Berry indirgeyici şekerler arasında 2007 190.00 ± 1.27 165,25 ± 0.49 153.00 ± 0.42 203,60 ± 0.71 210,90 ± 0.71 192,25 ± 0,64 188.70 ± 1.84
Berry indirgeyici şekerler arasında 2008 191,35 ± 0,64 178,90 ± 0,57 170,05 ± 0.49 205,15 ± 1.48 188,70 ± 0,57 169,35 ± 0.49 108,05 ± 1.06
Berry pH 2006 3.01 ± 0.01 2.96 ± 0.01 2.84 ± 0.00 2.9 ± 0.00 2.98 ± 0.00 3.02 ± 0.00 3.06 ± 0.01
Berry pH 2007 2.97 ± 0.00 3.00 ± 0.00 2.74 ± 0.00 3.07 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.87 ± 0.01 3.09 ± 0.00
Berry pH 2008 2.83 ± 0.00 3.04 ± 0.01 2.71 ± 0.00 2.98 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.82 ± 0.00 3.11 ± 0.00
Hasat tarihi 2006 2007 2008
Veraison 8-Ağustos 18-Temmuz 12-Ağustos
Orta Olgunlaşma 4-Sep 8-Ağustos 2-Sep
Olgun 18-Eylül 29-Ağustos 23-Eylül

Tablo 1: Her bağ başlıca özellikleri venumune toplama tarihleri. m = metre, EW =, NS = Kuzey-Güney-Batı yiyin.
figure-protocol-1
Şekil 1:. Örnekleme prosedürü şematik üç şarap üretimi makro bölgeler Verona, Veneto bölgesi, İtalya'nın şehrin çevresinde yer almaktadır. Üç kez noktaları Bağcılıkta olgunlaşma başlangıcını temsil eden tanecik oluşumundan (V), orta olgunlaşma (MR) ve olgun meyveleri (R). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Berry Powder özleri hazırlayın, Metabolitler Analiz ve Süreci Veri

  1. Analiz için Berry Toz Örnekleri hazırlayın.
    1. Üç hacim içinde oda sıcaklığında meyve örnekleri metabolik özleri hazırlama (ağırlık / hacim)% 0.1 ile asidifiye metanol (h / h) için15 dakika boyunca 40 kHz'de ultrasonik banyoda mikrofon asittir. LC-MS-sınıf su ve formik asit ve HPLC-grade metanol kullanın.
    2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin özler.
    3. iyonu giderilmiş su, iki hacim (hac / hac) içinde Aşama 2.1.2 süpernatant seyreltilir ve 0.2 um'lik bir filtreden geçer.
  2. HPLC-ESI-MS ile Berry ayıklar analiz edin.
    1. tedarikçinin tavsiyelerine göre HPLC-ESI-MS sistemi kurmak.
      NOT: Bu durumda çalışmada, kurulum bir iyon tuzağı kütle spektrometresi ve elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile in-line bağlı bir otomatik numune alıcı ile donatılmış bir HPLC sistemi, oluşuyordu.
    2. Bir C18 koruma kolonu (7.5 x 2.1 mm 2) ve ters faz C18 kolon (150 x 2.1 mm 2, partikül büyüklüğü 3 um) olan HPLC sistemi bağlayın.
    3. mobil faz olarak kullanılan çözücüleri hazırlayın. S gibi Çözücü A olarak su ve% 100 asetonitril içinde% 5 (v / v) asetonitril,% 0.5 (v / v) formik asit kullanılırvası B. Kullanım LC-MS dereceli asetonitril, su ve formik asit.
    4. 0.2 mi dak-1 30 ul örnek bir enjeksiyon hacmi kullanılarak sabit bir akış hızında çözücü maddeler A ve B doğrusal gradyanı ile HPLC ayırma çalıştırın.
      1. İlk numune enjeksiyonu,% 25 solvent B'ye% 20, 20 dakika içinde% 20 solvent B'ye% 10 ila 5 dakika içinde% 10 solvent B'ye% 0 ila gradyanı tesis eden% 100 çözücü A ile bir sütun denge 15 dakika içinde 5 dakika ve% 25 ila% 70 solvent B.
      2. nüsha halinde, her örnek analiz edin. Alet odaklı etkileri önlemek için numune analizi Rastgele. Her bir analiz arasında% 100 çözücü ile yeniden dengeleme için 20 dakika bekleyin.
    5. Alternatif negatif ve pozitif iyonizasyon modlarında kütle spektrumları kazanır. Bu vaka çalışmasında açıklanan sonuçlar için, Tablo 2'de olduğu gibi parametrelerini ayarlamak. Hassas makine ayarı belirli platforma bağlıdır.
      NOT: Alternatif olarak, diğer takım kullanınBelirli platforma göre mümkün yöntemler.
      1. Tüm durumlarda, herhangi bir ayırma platformu gibi, tutma süresi tekrarlanabilirliği elde etmek için, uygun bir yeniden dengeleme zaman kullanmak için emin olun. numune sayısı (on numunelerin üzerinde) yüksek olduğunda, her parti arasındaki kromatografik kolon temizleme programlarının (iki yıkama solventler arasında yavaş degradeler) ile, 9-10 örneklerin gruplar halinde onları analiz eder. Yeterli alıkoyma süresi tekrarlanabilirlik sahip her bir serinin ilk kromatografik analizi boş analiz olduğundan emin olmak için (yani, çözücünün analizi).
    6. Ayrıca parçalanma seçenekleri (iki iyon öncüleri, MS 3) ayarı parçalanmış negatif ve pozitif iyon modlarında kütle spektrumları kazanır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak parçalanma ağacı analizi (MS / MS ve MS 3) ile metabolitleri açıklama.
      Not: genellikle glikosile olduğundan, bu Ther bitki metabolitlerinin için uygundurefore ilk parçalanma (MS / MS) ücretsiz aglikon iyonu ve sonraki parçalanma (MS 3) ayrılan şeker yarımları kaldırmak eğilimindedir otantik standartlar kütüphaneye karşı aglikonu belirlemeye yardımcı olur.
    7. Alternatif olarak 1 V'luk bir parçalanma genlikli m / z aralığı 50-1,500 MS / MS ve MS 3 spektrumları elde edilmesi, belirli bir platforma uygun olarak başka müsait yöntemleri kullanılır.
    8. Her m / z sinyali için, üreticinin talimatlarına göre özgün standartlar kütüphanesine MS / MS ve MS 3 parçalanma desen ve tutma süreleri karşılaştırmak.
      NOT: platformların çoğu tip otantik standartların analizi yoluyla kütüphanenin bu tür oluşturmak için yazılım imkanları bulunmaktadır. Bu sinyallerin çok tanımlamalıdır ancak tüm sinyaller açıklamalı olacaktır.
    9. Kalan anonim sinyaller için, edebiyat, Searc yayınlanan olanlarla MS / MS ve MS 3 parçalanma desen karşılaştırmakm / z değerleri (yani haneli "m / z 353" Böyle m / z açıklanan sahip moleküller olduğu yayınlar bakmak için) serbestçe kullanılabilir ortak bir arama motoru herhangi biri ile, ya da MassBank gibi çevrimiçi veritabanları (www hing .massbank.jp / tr / database.html) ve İnsan Metabolome Veritabanı (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
Kütle spektrometresi bileşenleri işlev parametreler
Elektrosprey İyonizasyon Kaynağı nebulize edici Gaz 50 psi, 350 ° C
Kurutma gazı 10 L dk -1
Iyon tuzağı ve dedektör taramak Saniyede tam tarama modlu, 13.000 m / z aralığı 50-1,500 m / z
Hedef kitle 400 m / z
Çarpışma gaz Helyum
Vakum basıncı 1.4 x 10 -5 mbar
kılcal kaynağı 4000 V
Uç plakası ofset -500 V
kevgir -40 V
Cap çıkış -121 V
1 Ekim DC -12 V
2 Ekim DC -1.7 V
mercek 1 5 V
objektif 2 60 V
Pozitif iyonizasyon modu için ICC 20.000
negatif iyonlaşma modu için ICC 7.000

Tablo 2: kütle spektrumları elde etmek için asıl parametre seti.

operasyon seçim işlev parametreler değerler
pik deteksiyon kütle tespiti ağırlık merkezi Gürültü seviyesi 3.500
kromatogram oluşturucu En yüksek veri noktası dk zaman aralığı 0.15
dk yüksekliği 4.000
m / z toleransı 0.3
pik deteksiyon tepe Dekonvolüsyonun Yerel asgari arama kromatografik eşiği 70
RT aralığında arama asgari (en az) 00:50
En az nispi yükseklik % 15
Asgari mutlak yükseklik 4.000
tepe tepe / kenar Min oranı 2
Süre aralığı (dk) 0-10
izotoplar İzotopik zirveleri orfoz - m / z toleransı 1.2
RT tolerans 00:50
monoton şekil Yok hayır
maksimum yük 3
Temsilci izotop Yok hayır
hiza hizalama katıl - m / z toleransı 1.2
m / z Ağırlık 10
Tutma süresi tolerans 00:50
RT Ağırlık 5
Aynı şarj durumunu gerektir Yok hayır
aynı kimliği gerektir Yok hayır
izotop desen karşılaştır Yok hayır
Boşluk doldurma tepe bulucu - yoğunluk toleransı % 20
m / z toleransı 0.9
Tutma süresi tolerans 00:40
RT düzeltme Yok hayır
süzme Tepe filtre çoğaltın - m / z toleransı 1.2
RT tolerans 00:30
Aynı kimlik gerektir Yok hayır

Tablo 3: Belirli değerleri Mzmine iş akışı olumsuz LC-MS üzüm dut veri dosyalarını işlemek için.

  1. LC-MS Veri işleyin.
    1. erişim veyaBirçok çiğ Kromatogramlarda ilgili bilgileri ayıklamak ve her algılanan metaboliti her numunede miktarı olduğu bir veri matrisi inşa edebilirsiniz veri işleme yazılım paketini indirin.
      NOT: protokol aşağıdaki adımlar açık kaynak yazılım MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net) için tasarlandı. Bu LC-MS verilerine ana odak ile, kütle spektrometresi veri işleme için bir açık kaynak kodlu bir yazılım. 27
    2. ekipman üreticisi tarafından sağlanan yazılımı kullanarak netCDF biçime LC-MS kromatogram verileri dönüştürmek. Burada açıklanan sonuçlar için, Bruker Daltonics Esquire v5.2 ve Veri Analizi v3.2 yazılımları kullanmak ve üreticinin talimatlarına göre adımları uygulayın.
      NOT: Diğer dönüştürücüler kullanılabilir (çeşitli serbest ware dönüştürücüler mevcuttur).
    3. Yazılımın içine .cdf dosyalarını içe aktarın.
    4. parametrik ile tepe noktası belirleme, hizalama, boşluk doldurma ve zirve filtreleme prosedürleri uygulamakers Tablo 3'te rapor etmiştir.
      1. İlk adım olarak, daha sonra Görselleştirme → TIC / XIC görüntüleyici gidin bir ithal .cdf dosyasını seçin. kromatogram en küçük tepe tabanı üzerine imleci koyun ve baz iyon minimum yoğunluk sinyali hakkında not alın. Sonra Tepe Algılama → Ham Veri Yöntemleri gidin.
      2. Kitle Algılama seçin ve her tarama için ayrı iyonları algılamak ve bir iyon listesi oluşturmak için sinyal seviyesini doldurun.
        NOT: Önceki kitle tespiti yapmadan algoritması kontrol edin - kütle spektrometresi bağlıdır. Bizim durumumuzda, biz AğırlıkMerkezi seçin.
      3. Kromatogram Builder seçin ve iyon listeden veri noktalarını bağlamak ve her kitle değeri için kromatogram oluşturmak için sinyal seviyesine sahip doldurun. Min zaman dilimi ve m / z toleransı ayarlamak için kütle spektrometresi kılavuzunda belirtilen parametreleri bakın.
      4. Sonraki Peak algılama → kromatogramı Deconvo → Tepe Listesi Yöntemleri gitmekdökülmesinden. Bireysel zirveleri her bir kromatogram ayrılmasına izin vermek için (bu durumda Yerel Minimum arayın) uygun bir algoritma seçin.
      5. El ile aşağıdaki parametreler için uygun değerleri bulmak için kromatogramlar kontrol edin. gürültü çıkarmak ve iki tepe ayırt asgari halk varlığını belirlemek için 2 (dk) RT Range Minimum Arama% 30 Kromatografik Eşik ayarlayın.
      6. 2.0 Asgari Bağıl Boy ayarlayın. El ile arka zirveye ve karşılık gelen sinyalin minimum mutlak yüksekliği belirlemek için kromatogram kontrol edin; (Örneğin, sunulan deneyde 10.000) Mutlak Yükseklik olarak bu değeri ayarlayın.
      7. üst ve bir tepe düşük veri noktası yoğunlukları arasındaki asgari oran devlet 1.1 Tepe Üstü / Edge Min Oranını ayarlamak gerçek bir zirve olarak kabul edilecek.
      8. El ile çeşitli zirveleri minimum süresi kullanılan Kromat olduğunu görmek için kromatogramlar incelemekographic koşullar (örneğin, 0.2 ve 2 dakika, bileşiğe, gösterilen deneylerde arasında), ve bunun sonucu olarak bir süre kabul edilebilir en yüksek uzunluğunun aralığını ayarlamak için tepe süre aralığını (min) bu değerleri kullanır.
      9. Sonra genellikle en yoğun olarak, bir zirve gruba Tepe Listesi Yöntemleri → izotoplar → İzotop Peaks Grouper izotopları gidin. Not: parametreler kütle spektrometresi çözünürlük ve saklama kez tekrarlanabilirlik bağlıdır.
      10. Son olarak, bir maç skoru kullanarak kendi m / z ve tutma süresine bağlı olarak doruklarına hizalamak için Tepe Listesi Yöntemleri → Uyum → Üyelik Aligner gidin.
    5. zirveleri hizalama sonra → Tepe Finder Dolum Tepe Listesi Yöntemleri → Gap tıklayarak herhangi bir veri boşlukları doldurmak. Son olarak, filtre Tepe Listesi Yöntemleri → Filtreleme → Tepe Filtre Duplicate tıklayarak veri noktalarını çoğaltmak.
    6. Bir .cs olarak ortaya çıkan veri kümesini dışav dosyası.
    7. El ile değiştirin. A. Txt uzantısı csv uzantılı. Hiçbir dosya uzantıları görünür durumdaysa, dosya uzantılarını ortaya çıkarmak için bilgisayar ayarlarını değiştirin. Explorer Seçenek → → Gelişmiş Ayarlar Dosya ve kutu 'Bilinen dosya türleri için uzantıları gizle' işaretini gidin.
    8. Bir elektronik tabloya .txt dosyalarını içe aktarın. Bu, bir kimlik numarası, m / z değeri ve tutma süresi tarafından tanınan tüm tespit metabolitler, pik alanı değerleri olarak tüm örneklerde miktarı olan bir veri matrisi üretir.

3. Transkriptom Analizi Berry Toz ayıklar hazırlayın ve Süreci Veri

  1. Berry Örneklerden Toplam RNA Özü ve RNA Kalite belirleyin.
    1. dut örneklerinden total RNA ayıklayın.
      NOT: Bu vaka çalışmasında, özel bir kit ve diğerlerinin moleküllerinin tamamen kaldırılması sağlayan bir değiştirilmiş prosedürdePolisakkaritler ve polifenoller gibi RNA analizi ile fere kullanıldı. Aşağıdaki talimatlar bu kit 18 özgüdür.
      1. Her numune için dolgu tozu, 400 mg ağırlığında iki kısma bölün ve iki mikrofüj tüplerinde 200 mg, her yerleştirin.
      2. en az 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde, hemen ve toz ve vorteks her 200 mg (kitte sağlanan), β-merkaptoetanol ihtiva eden liziz çözeltisi 900 ul ekle. 5 dakika 800 rpm'de çalkalanarak 56 ° C'de örnek ısıtın.
      3. hücre yıkıntıları pelet haline 10 dakika boyunca bir tezgah üstü mikrofüjde yüksek hızla örnekleri santrifüj.
      4. Pipetleyin 2 ml toplama tüpüne oturmuş kiti (mavi tutma halkası) sağlanan filtrasyon sütuna süpernatant 700 ul. Kalan artığın ayrılması için 1 dakika için bir tezgah üstü mikrofüjde yüksek hızda kap ve santrifüj kapatın. iki üç t sonuçlanan aynı filtrasyon sütun ama taze toplama tüpü kullanarak bu adımı yineleyinUBE açıklık lizat içeren her ~ 700 ul.
      5. Pipet 750 açıklık lizat Her tüpe (kitinde) bağlayıcı çözeltisi ul aşağı en az beş kere yukarı pipetleme ve hemen karıştırın. 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde oturan kiti (kırmızı tutma halkası) sağlanan bağlama kolonuna Bu karışıma 700 ul aktarın. RNA bağlanma, 1 dakika boyunca bir tezgah üstü mikrofüjde yüksek hızda kap ve santrifüj kapatın.
      6. , Akış kısmını Durusu toplama tüp ters ve kalan sıvıyı boşaltmak için emici kağıt temiz bir pad üzerinde kısaca dokunun.
      7. toplama tüpüne sütun dönün ve aynı sütuna kalan karışımı pipetlemeyin ve santrifüj ve şişeden adımları tekrarlayın. Bütün karışım aynı kırmızı bağlayıcı sütuna süzülmüş kadar tekrarlayın.
      8. Şimdi kitinde kalan yönergeleri izleyin ve (kitinde) 50 ul elüsyon tamponu içinde RNA ve mağaza i Zehirkalite kontrol aşamaları için hazır -80 ° C t.
    2. Bir spektrofotometre kullanılarak, RNA miktarı ve saflık belirler. Proteinler (A 260/280) ve polifenoller / polisakaritler (A 260/230) ile kontaminasyon derecesini ortaya emme oranları kaydedin.
      NOT: mikroarray hibridizasyon için uygun RNA her iki oran için en az 1.8 puan gerekir.
    3. RNA bütünlüğünü belirlemek.
      NOT: Çeşitli sistemler kullanılabilir. Bir floresan boya ile kombinasyon halinde bir kılcal elektroforez çalıştırmak yerine dijital edinen Bu durumda çalışmada kullanılmıştır. mikrodizi hibridizasyon için uygun bir RNA en az 8'lik bir RNA Bütünlük Numarası (RIN) olması gerekir.
  2. Örnekler hazırlayın ve bir özel Mikrodizi için RNA melezleşme.
    1. iyonu giderilmiş RNaz içermeyen su ile adım 3.1.1.8 'de elde edilen bir RNA çözeltisi seyreltilerek 200 ng mikro-dizi analizi için toplam RNA'nın başlangıç ​​miktarı ayarlayın. Ekle1.5 ul nihai hacimde 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne RNA, uygun miktarı.
    2. Her RNA örnek seyreltilmiş başak karışımı 2 ul ekleyin ve ilk iplik cDNA sentez cRNA içine bu yazıya ve siyanin 3CTP ile cRNA etiket üreticinin talimatlarını izleyin.
    3. üreticinin talimatlarına uygun olarak işaretlenmiş cRNA arındırmak ve 30 mL RNaz içermeyen su içinde elüt.
    4. Bir spektrofotometre ile üç değeri kaydederek her cRNA verimi ve spesifik aktivitesini belirlemek: cyanine 3 boya konsantrasyonu (ul -1 pmol), RNA saflık (A 260/280) ve cRNA konsantrasyonu (ng ul -1). cRNA verimi (mikrogram) ve spesifik aktivite (ug cRNA başına pmol Cy3) hesaplamak için üreticinin kullanım kılavuzunda bulunabilir formülleri kullanın.
      NOT: Önerilen verimleri ve spesifik faaliyetler belirli mikroarray biçimi bazında farklılıklar göstermektedir. Bu vaka çalışmasında, 4 paket 44K biçimi olduseçilmiş, tavsiye edilen verim 1.65 ve spesifik aktivite 9 oldu.
    5. prob tasarımı için uygun bir yazılım kullanarak özel mikroarray tasarlayın.
      1. Bu vaka çalışmasında açıklanan sonuçlar için, özel mikroarray tasarımlar ve oligonükleotid kütüphaneleri için web tabanlı bir uygulama kullanarak 4-pack 44K formatında tasarlanmış yeni bir özel mikrodizisi hazırlamak. Tasarım probları 29971 Pinot noir V1 diziden transkript tahmin de dahil olmak üzere, 34.651 hedef transkript maç, Corvina transcriptome yeniden yapılanma ve 180 özel Corvina genlerinin 25 Pinot çeşidinde tespit 4.500 yeni odaklar.
        NOT: Bu 29.798 Pinot noir transkript, 4392 yeni Pinot lokusu ve 179 Corvina özel genleri tahmin oluşan 34.651 spesifik 60-mer prob üretimi çıkıyor.
    6. aşağıdaki gibi 4-pack biçimi özelliklerine dayalı melezleme hazırlayınız.
      1. 41,8 nihai hacim içinde Cy3 etiketli cRNA 1.65 ug yerleştiriniyonu giderilmiş RNaz içermeyen su ul. 11 10x Engelleme Ajan ul 2.2 ul 25x parçalanma Buffer ekleyin. RNA fragmanı termostatik banyoda 30 dakika boyunca 60 ° C'de inkübe edin. 1dk boyunca buz üzerinde hemen serin.
      2. Son olarak, 2 x hibridizasyon tampon maddesi 55 ul oda sıcaklığında 15.500 xg'de 1 dakika için pipetleme ve spin ile iyice karıştırın. Zamanında buz üzerinde ependorf tüp yerleştirin. saklamak değil, hemen kullanın.
    7. aşağıdaki gibi özel mikroarray yükleyin.
      1. bir melezleşme odasının tabanına etiketi yukarı gelecek şekilde bir conta slayt yükleyin. Yavaş yavaş hava kabarcığı oluşumunu önleyen pipet ucu ile sıvı dağıtıcı, her bir contanın üzerine adım 3.2.6.2 'de elde edilen hibridizasyon numunesi 100 ul yükleyin.
      2. Yavaşça özel mikroarray sayısal barkod yukarı bakacak şekilde, aşağı bakacak yerleştirin. Sandviç çifti düzgün takıldığından emin olun. Sonunda sandviç üzerine melezleme odasının kapağını yerleştirinslaytlar ve odasının üzerine kelepçe elle sıkın. baloncuklar hareketliliğini değerlendirmek için monte edilmiş bölme döndürün.
    8. Fırın 65 ° C'ye ayarlanmış bir hibridizasyon bir dairesel asamblajı kayıcı odasına koyun. 10 rpm'de döndürmek için rotator ayarlayın. Hibridizasyon 17 saat devam etmesine izin verir.
    9. aşağıdaki gibi mikroarray slayt yıkama ile devam edin.
      1. İlk olarak, üç slayt boyama yemekleri hazırlamak ve uygun yıkama tamponlar ile doldurun: oda sıcaklığında Yıkama Tamponu 1 ile 2 yemekleri ve önceden ısıtılmış (37 ° C) Yıkama Tamponu 2 1 tabak.
      2. melezleme odasına sökün ve sandviç çıkarın. yukarı bakacak şekilde mikroarray slayt sayısal barkodlu, oda sıcaklığında Yıkama Tamponu 1 ile dolu ilk slayt boyama çanak içine sandviç batığın ve temiz forseps yardımıyla, mikroarray slayt contayı ayırın. Hızlı bir slayt rafa mikroarray slayt aktarmak ve Yıkama Tamponu 1 ile doldurulmuş ikinci slayt boyama çanak yerleştirinOda sıcaklığında karıştırıldı.
      3. Bir manyetik karıştırıcı üzerine slayt boyama çanak koymak ve ılımlı karıştırma ile 1 dakika yıkayın. Hızlı bir şekilde önceden ısıtılmış (37 ° C) Yıkama Tamponu 2 ile dolu bir üçüncü slayt boyama kabına sürgülü raf transferi ve ılımlı karıştırma ile 1 dakika yıkayın.
      4. Yavaşça slayt boyama çanak raf kaldırmak ve dikkatle damlacıklar kaçınarak, raftan slayt kaldırmak.
        NOT: yıkama tamponlar Triton X-102 eklemek ve asetonitril yıkama adımı ihmal etmeyin.
    10. Oda sıcaklığında karanlıkta yıkandı çip saklayın.
  3. Mikroarray Tarama ve belirgin özelliklerinden ayıklayın.
    1. Uygun bir tarayıcı içine mikroarray slayt yerleştirin ve mikroarray üreticisinin kılavuzunda önerilen parametre ayarlarını kullanarak her dizi tarayın. Burada açıklanan sonuçlar için, tarama işlemini kolaylaştırmak için bir slayt sahibi her bir mikroarray slayt yerleştirin.
    2. Çıktı almak .shpSayısal floresan değerleri bir dijital sinyal dönüştürme yapabiliyor uygun bir yazılımı dosya. melezleme işlemi başarılı olduğundan emin olmak için kalite kontrol raporunu kontrol edin.
      1. Burada açıklanan sonuçlar için, özellik çıkarma yazılımı kullanma kılavuzunda önerilen parametre ayarlarını kullanmak ve Tablo 4'te listelenen parametreler imalatçı tarafından verilen normal aralık içinde olduğundan emin olmak için kalite kontrol raporunu inceleyin.
metrik Ad Üst sınır alt Sınırı Açıklama
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 NA özellikleri yüzdesi ya kanalda özelliği olmayan tekdüzelik aykırı olduğunu
DetectionLimit 2.00 0.10 Ortalama artı 1 lineer konsantrasyon aralığının altında başak ins standart sapması
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 E1 prob Konsantrasyon vs Signal uyum eğimin mutlak
MedCVProcSignal 8.00 NA İşlenmiş Signal Medyan% CV
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10,00 arka plan Ortalama (BGSubSignal sinyali ortalama özelliğinden BGUsed denilen bir değer çıkarılması ile hesaplanır) tüm İç mostra negatif kontrollerin sinyali çıkarılır
gNegCtrlAveNetSig 40.00 NA Tüm İç mostra negatif kontroller net sinyali ortalaması
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 NA standart sapmasıBilinen Hususlar mostra negatif kontrol sinyallerini çıkarılır
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 NA olmayan kontrol probları İşlenmiş Signal medyan% CV
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 NA Arka plan detrending uyum rezidüel

Tablo 4: Temel parametreler mikrodizin melezleşme kalitesini doğrulamak için kontrol edilmelidir.

  1. Mikroarray Veri işleyin.
    1. Tüm mikroarray slaytlar tarandıktan ve kalite kontrolü olumlu değerlendirilmiştir edildikten sonra, her sonda ham floresan yoğunluklarına temsil her tek alt dizilim sonuç dosyasından gProcessedSignal değerleri seçerek bir sekme ayrılmış veri matrisi hazırlamak.
    2. Elektronik tabloda, her dizinin (P değerleri) ve Enerji kaynakları içinde 75 persentil verileri normalizeR oranını hesaplamak için tüm farklı alt diziler arasındaki tüm P değerlerinin ortalamasını yedik.
    3. Ardından, aynı tablo üzerinde, kendi alt dizinin R oranı her gProcessedSignal değerini normalleştirmek.

Metabolomik ve Transcriptomics Verilerinin Detaylı İstatistiksel Analiz Yürüten 4.

  1. İstatistiksel Analiz Yazılımı hazırlayın.
    NOT: Bu vaka çalışmasında, PCA gerçekleştirmek mümkün bir yazılımda, PLS-DA ve O2PLS-DA kullanıldı.
    1. metabolomik ve transkriptomik veri almak. MZmine yazılımı ile elde edilen veri matrisi almak için yeni Düzenli Projesi → → Yeni Düzenli Project File gidin. Düzen → bütün matris → Ev Sırasını ve uygun Birincil ve İkincil kimlik → Son'u atamak üzerine tıklatın.
    2. Demek verileri ortalamak ve Pareto ölçeği kullanarak ölçek. Ev penceresinde, Düzenle → M1 gidin ve uygun parametrede değişiklikVerileri bağlı ters. Burada açıklanan sonuçlar için, Par Birim Varyans gelen Ölçeği değiştirin.
    3. Birim Varyans ayarını kullanarak transkriptomik verilerini Ölçeğe.
  2. Çok Değişkenli İstatistiksel Analiz Carry Out.
    1. F ŞEKIL 2'de gösterildiği gibi PCA uygulamak. Bu durumda çalışmada, PCA numuneler arasındaki temel farklar, farklı olgunlaşma aşamalarını yansıtan ve mevsim büyüyen ortaya koymaktadır.
      1. Workset penceresinde, model türü olarak PCA-X seçin. Basın Otomatik Sığdır. onlar modelin kalitesi hakkında bir fikir vermek gibi R2X (cum) ve S2 (cum) dikkat edin değerleri.
        NOT: Genel olarak, çok yüksek R2X (cum) ile daha iyi değerler daha yüksek bir model, ancak modeller verileri aşırı uygun olabilir. S2 (cum) değeri azaltmak için başladığında ampirik bir kural olarak, Temel Bileşenler ekleyerek durdurmak.
      2. Ardından, örneklerin mümkün gruplama gösteren arsa görmek için Skorlar → Scatter seçin.
      3. PCA inceleyinPlot puan. iyi bir model elde edilirse (Q2cum> 0.5), bir O2PLS-DA modeli (adım 4.2.2) oluşturmak için numunelerin aynı sınıflarını kullanın.
    2. Makro-zone göre sınıflandırılmış örnekler kullanılarak iki O2PLS-DA modelleri oluşturmak ve 200 permütasyon ile bir permütasyon testi kullanılarak modelleri doğrulamak.
      1. Yeni As → M1 → Gözlemler → Ev penceresine giderek sınıfları atayın. İstenilen sınıfları ayarlayın. Ardından, O2PLS-DA için PCA-X model türünü değiştirmek. Basın Otomatik Sığdır. PLS-DA modelinin bileşenlerin sayısı O2PLS-DA ile aynı olduğundan emin olun.
      2. O2PLS-DA modeli doğrulamak için, CV-ANOVA Analiz gidin ve sağ p-değeri görmek. Ayrıca, M2 → Ev penceresinde olduğu gibi Yeni üzerine tıklayın ve PLS-DA için O2PLS-DA model türünü değiştirmek. Basın Otomatik Sığdır.
      3. Permütasyon → Analiz ve 200 permütasyon (de-select yeniden hesapla Permütasyonlar opsiyon) gerçekleştirmek için gidin.
        Not: nihai çıkış bir pencere gösteren R2 değeri shou içindeQ2 Y ekseni negatif kısmını isabet gerekirken ld genellikle 0,4 altında değerlerde Y ekseni çarptı. R2 ve / veya Q2 değerleri yanlışsa, bileşenlerin her ikisi de PLS-DA ve O2PLS-DA modellerinde sayısını azaltmak.
      4. Proje penceresinde M2 ​​seçin ve arsa ve örnek sınıfların konumunu görmek için Scatter → Puanlarına tıklayın geçin. Bir veya daha fazla özel sınıflar karakterize metabolitleri bittiğini gözlemlemek için, / Liste → Scatter Plot gidin.
      5. Gözlemler Seç Veri türünü değiştirmek ve mevcut olduğunda yüklemeler → sırasıyla 1 ve 2 ya da daha fazla, ya bileşenlerine pq (corr) ve Pred Zorunlu içine X-Ekseni ve Series Öğe Serisi ekleyin ve değiştirin.
      6. arsa üzerinde basılı farenin sağ tuşu ile, moleküllerin ve sınıflar arasındaki arsa sembolleri ayırt etmek Şartlar By Mülkiyet → Renk gidip seçin. İstenilen özelliklere sahip arsa değiştirmek için Eksen ve / veya Styles → Düzen → Format Plot gidin.
      3. .
    3. Transkriptomik O2PLS-DA analizi sonuçlarına dayanarak, almak ve Gen Ontoloji (GO) 28 sınıflandırmalar için farklı şekilde modüle genleri atayın.
    4. elle metabolit düzeyleri ve gen ifadesi arasındaki ilişkileri belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu makalede açıklanan vaka çalışması nispeten 189 örnekleri arasında sayısal moleküler iyonlar artı kendi izotopları, adüktleri ve bazı parçaları da dahil olmak üzere 552 sinyalleri (m / z özellikleri), (7 bağları x 3 olgunlaşma aşamaları x 3 büyüyen mevsim x içeren bir son veri matrisi vermiştir 3 biyolojik çoğaltır). veri noktaları için toplam sayısı, bu nedenle 104,328 idi. Parçalanma ağacı analizi metabolitleri ayrıca adüktleri, izotoplar ve fragmanlarına karşılık gelen,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede, üzüm dut terroir kavramını yorumlamak için kullanılan metabolomik, transkriptomik ve istatistiksel analiz protokollerini açıklar. HPLC-ESI-MS ile metabolomik analiz aynı anda metabolitleri çok sayıda algılamak için yeterince duyarlı olmakla birlikte, göreceli kantitatif matris etkisi ve iyon bastırma / geliştirme etkilenir. Ancak, benzer bir yaklaşım zaten Corvina çilek olgunlaşmasını ve hasat sonrası soldurma tanımlamak için kullanılır olmuştur, ve matriks etkileri düzeltme sonuçları 5 üzerinde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, AB tarafından finanse edilen COST ACTION FA1106 "Domates ve asmada etli meyve kalitesini kontrol eden gelişimsel mekanizmaları belirlemek için entegre bir sistem yaklaşımı" kapsamında koordine edilen ağ oluşturma faaliyetlerinden yararlanmıştır. Bu çalışma, CARIVERONA Bank Vakfı tarafından finanse edilen 'Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale' projesi ve İtalya Tarım ve Orman Politikaları Bakanlığı tarafından finanse edilen 'Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)' projesi tarafından desteklenmiştir. SDS, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı FIRB RBFR13GHC5 "Çevre Etkileşimlerine Göre Genotipte Asmanın Epigenomik Plastisitesi" projesi tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Değirmen ÖğütücüIKAIKA A11 temel
HPLC Otomatik Numune AlmaCihazı Beckman Coulter -System Gold 508 Otomatik Numune Alma Cihazı
HPLC SistemiBeckman Coulter -System Gold 127 Solvent Modülü HPLC
C18 Koruma KolonuGrace -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Koruma Kolonu
C18 Kolonu Grace -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Kolon
Kütle SpektometresiBruker Daltonics -Bruker Esquire 6000; Kütle spektometresi bir ESI kaynağı ile donatılmıştı ve analizör bir iyon tuzağıydı.
Ekstraksiyon çözücüleri ve HPLC tamponlarıSigma34966Metanol LC-MS sınıfı
Sigma94318Formik asit LC-MS sınıfı
Sigma34967Asetonitril LC-MS sınıfı
Sigma39253Su  LC-MS sınıfı
Minisart RC 4 Şırınga filtreleri (0.2 & mu; m)Sartorius17764
Veri toplama (a) ve işleme (b)Bruker Daltonics-BrukerDaltonics Esquire 5.2 Kontrol (a); Esquire 3.2 Veri Analizi ve MzMine 2.2 yazılımları (b)
Spektrum Bitki Toplam RNA kitiSigma-AldrichSTRN250-1KTÜzüm perikarplarından toplam RNA ekstraktino için
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
RNA 6000 Nano ReaktiflerAgilent Technologies5067-1511
RNA ÇipleriAgilent Technologies5067-1511
Agilent Gen Ekspresyonu Yıkama Tamponu 1Agilent Technologies5188-5325
Agilent Gen Ekspresyonu Yıkama Tamponu 2Agilent Technologies5188-5326
LowInput QuickAmp Etiketleme kiti Tek RenkliAgilent Teknolojileri5190-2305
Kit RNA Spike In - Tek RenkliAgilent Teknolojiler5188-5282
Gen Ekspresyonu Hibridizasyon KitiAgilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104cRNA Saflaştırma için
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer MikrodiziAgilent TechnologiesG2514F-048771 
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/
Conta kızaklarıAgilent TechnologiesG2534-60012Agilent SurePrint Microarray 4 dizili Hibridizasyon
Termostatik banyosunuJulabo-Hibridizasyon
Odası Agilent TeknolojilerG2534-60001
Mikroarray Hibridizasyon FırınıAgilent TechnologiesG2545A
Hibridizasyon Fırını Döndürücü RafAgilent TechnologiesG2530-60029
Döndürücü Raf Dönüştürme ÇubuğuAgilent TechnologiesG2530-60030
Boyama kitiBio-Optica10-2000Slayt boyama kabı ve Sürgülü raf
Manyetik karıştırıcı cihazıAREX Isıtmalı Manyetik KarıştırıcıF20540163 
Termostatik FırınThermo ScientificHeraeus - 6030
Agilent Mikroarray TarayıcıAgilent TechnologiesG2565CA
Tarayıcı Karuseli, 48 konumluAgilent TechnologiesG2505-60502
Sürgü TutucularAgilent TechnologiesG2505-60525
Özellik çıkarma yazılımı v11.5Agilent Agilent Mikrodizi Tarayıcı G2565CA
SIMCA + V13 YazılımUmetrics
etkinleştirin İçindeki Teknolojiler

Kaynaklar

  1. Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
  2. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
  3. Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
  4. Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
  5. Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
  6. Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
  7. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
  8. Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
  9. Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
  10. Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
  11. Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
  12. Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
  13. Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
  14. Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
  15. Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
  16. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
  17. Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
  18. Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
  19. Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
  20. Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
  21. Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
  22. Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
  23. Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
  24. Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
  25. Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
  26. Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
  27. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
  28. Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Transkriptom AnaliziLC MS MetabolomikMikroarray HibridizasyonuTemel Bile en AnaliziO2PLS Diskriminant AnaliziMetabolit Tan mlamastatistiksel Veri EntegrasyonuMeyve rnekleme Plan

İlgili makaleler