Et kimlik doğrulaması için peptidler Uygulanan MRM Kütle Spektrometresi kullanarak karışımlar türlerin belirlenmesi ve miktar tayini

Özet

Benzer proteinlere sahip türlerin karışımlarındaki bileşenlerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Kütle spektrometresi, tanımlama için peptitleri tespit eder ve tepe alanlarının oranlarına göre nispi nicelik verir. Dolandırıcılık tespiti için bir araç gıda olarak, yöntem sığır etinde% 1 at tespit edebilir.

Özet

Bir veya daha fazla benzer proteine sahip türlerin ikili karışımlarındaki iki bileşeni tanımlamak ve ölçmek için basit bir protokol açıklıyoruz. Yöntemin merkezinde, ilgilenilen türdeki 'karşılık gelen proteinlerin', başka bir deyişle, nominal olarak aynı olan ancak türe özgü dizi farklılıklarına sahip proteinlerin tanımlanması yer alır. Proteolize tabi tutulduğunda, karşılık gelen proteinler, aynı şekilde benzer ancak türe özgü varyantları olan bazı peptitlere yol açacaktır. Bunlar 'karşılık gelen peptitler'dir. Türe özgü peptitler, türlerin belirlenmesi için belirteçler olarak kullanılabilirken, karşılık gelen peptit çiftleri, bir karışımdaki iki türün nispi niceliklenmesine izin verir. Peptitler, karmaşık sistemlerde bile peptit bazlı türlerin belirlenmesini sağlayan oldukça spesifik bir teknik olan çoklu reaksiyon izleme (MRM) kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilir. Ek olarak, karşılık gelen peptitlerden türetilen MRM tepe alanlarının oranı, nispi kantitasyonu destekler. Karşılık gelen proteinler ve peptitler, esas olarak, hem işlemede hem de deneysel ekstraksiyon ve numune hazırlamada benzer şekilde davranacağından, nispi kantitasyon nispeten sağlam kalmalıdır. Ayrıca bu yaklaşım, mutlak kantitasyon yöntemlerinin gerektirdiği standartlara ve kalibrasyonlara ihtiyaç duymaz. Protokol, kendi miyoglobinleri şeklinde uygun karşılık gelen proteinlere sahip olan kırmızı etler bağlamında açıklanmaktadır. Bu uygulama, gıda sahtekarlığı tespiti ile ilgilidir: yöntem, sığır etindeki at etinin ağırlığı için %1 ağırlığı tespit edebilir. MRM tepe alanı oranları kullanılarak karşılık gelen protein, karşılık gelen peptit (CPCP) nispi kantitasyonu, bir at artı sığır eti karışımının ağırlık bileşimi için ağırlığın iyi tahminlerini verir.

Giriş

2013 Avrupa at eti skandalı, bir dizi süpermarket sığır eti^{ürününde beyan} edilmemiş at etinin bulunduğu 1, ette gıda sahtekarlığını tespit edebilen ve ölçebilen test yöntemlerine duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve DNA tabanlı yöntemler başta olmak üzere çeşitli teknolojiler araştırılmıştır². Kütle spektrometresine dayanan alternatif bir yol, türe özgü proteinlerden ortaya çıkan türe özgü peptitleri hedefler. Burada, bir et karışımındaki tağşiş edici türlerin hem tanımlanmasını hem de nispi niceliğini sunan böyle bir peptit bazlı yaklaşımı özetliyoruz³.

Protokol, kırmızı etler bağlamında ve ağırlıkça %1 düzeyinde birbirinin varlığını belirleme arzusu çerçevesinde çerçevelenmiştir, bu seviye, bazıları tarafından kontaminasyonun aksine hileli gıda tağşişini temsil ettiği düşünülmektedir⁴. Yöntem, ilk olarak, tüm hedef etlerde nominal olarak 'aynı' olan bir proteinin tanımlanmasına dayanır. Etin kırmızı renginden sorumlu protein olan miyoglobin, bol miktarda bulunması, nispeten ısıya dayanıklı olması ve suda çözünür olması nedeniyle iyi bir adaydır ve daha önce etin tür tayini için kullanılmıştır^5,6. Örneğin, sığır eti (Bos Taurus), domuz eti (Sus scrofa), at (Equus caballus) ve kuzu (Ovis aries)³ için miyoglobinler, gerektiği gibi, nominal olarak aynıdır, ancak dizilimleri aynı değildir. Bu dört miyoglobin gibi bu tür 'benzer ama farklı' protein grupları, uygun bir şekilde 'karşılık gelen proteinler' olarak tanımlanabilir. Bu dört miyoglobindeki dizi farklılıkları türe özgüdür: örneğin, sığır ve at için tam miyoglobin proteinleri, sırasıyla P02192 ve P68082, her biri, ikisi arasında 18 dizi farkı olan 154 amino asit içerir. Tripsin kullanılarak proteolize tabi tutulan bu proteinler, bazıları aynı olan ve bazıları bir veya daha fazla türe özgü amino asit farklılıkları gösteren iki set peptit üretir: bu nedenle karşılık gelen proteinler, karşılık gelen peptitlere yol açar.

Bu nedenle CPCP yaklaşımı, ilk olarak, bu proteinlerin türe özgü sınırlı dizi varyantları sergilediği iki veya daha fazla türden proteinleri tanımlamayı amaçlar. Bunlar karşılık gelen proteinlerdir. Proteolizi takiben, karşılık gelen proteinler, bazıları aynı şekilde ana proteinden miras alınan türe özgü dizi varyantları gösteren peptitlere yol açar. Bunlar karşılık gelen peptitlerdir. CPCP yaklaşımı, karşılık gelen peptitlerin seviyelerini izleyerek karışık bir tür örneğindeki karşılık gelen iki proteinin seviyelerini karşılaştırmak için kullanılabilir.

Bilinen peptitlerin tespiti için doğal teknoloji, çoklu reaksiyon izleme kütle spektrometresi veya MRM-MS^7'dir. Türe özgü peptitler, kütle spektrometresi fragman iyonları ile birlikte, yazılım araçları tarafından önceden kolayca maddelendirilen öncü iyonlar verir. Bu listeler daha sonra kütle spektrometresine geçişler adı verilen yalnızca belirli öncüleri ve parça iyon çiftlerini kaydetmesi talimatını vermek için kullanılır. Bu nedenle, belirli bir hedef peptit, yalnızca kütle spektrometresinden önceki kromatografide tutma süresiyle değil, aynı zamanda ortak bir öncü iyonu paylaşan bir dizi geçişle de tanımlanır. Bu, kütle spektrometresi kaynağını verimli bir şekilde kullanan bilinen peptitleri tespit etmenin oldukça seçici bir yoludur.

Diğer yazarlar, peptit belirteçleri aracılığıyla, ancak farklı proteinler^8-14'ten et tağşişini test etmek için kütle spektrometresi kullanmışlardır. Bununla birlikte, karşılık gelen proteinlerin kullanılması, karşılık gelen peptitler (CPCP) şeması, deneysel koşulların optimize edilebileceği anlamına gelir ve karışımdaki türlerin bilinen türe özgü geçişlerden tanımlanmasına yardımcı olur. Ek olarak, karşılık gelen proteinler ve peptitler genellikle ekstraksiyon, proteoliz ve tespit aşamalarında benzer şekilde davranacaktır. Geçiş tepe alanları kantitatif ve tekrarlanabilir olduğundan, farklı türlerden karşılık gelen peptit çiftlerinden kaynaklanan tepe alanlarının oranları, bir karışımdaki iki etin nispi miktarlarının doğrudan bir tahminini sağlar. Buna karşılık, daha geleneksel kantitasyon yolları, mutlak kantitasyon^14,15 oluşturmak için referans malzemelere dayalı kalibrasyonlardan yararlanır.

Protokol, miyoglobin ve et bağlamında ana hatlarıyla belirtilmiş olsa da, miyoglobin dışındaki proteinler, potansiyel olarak protokolde değişiklikler olsa da, et karışımlarında CPCP stratejisi aracılığıyla tanımlama ve nispi miktar tayini için kullanılabilir. Ek olarak, strateji, bir veya daha fazla karşılık gelen proteini paylaşan diğer türlerin ikili karışımlarına da uygulanabilir.

Protokolün başlangıç noktası, bazı türler için satın alınabilen, ancak diğerleri için geleneksel boyut dışlama kromatografisi ile hazırlanması gereken saflaştırılmış 'referans' miyoglobindir. Referans miyoglobin hazırlama prosedürü protokole dahil edilmemiştir, ancak başka bir yerde açıklanmıştır³. Yazılım araçları¹⁶, ilgilenilen miyoglobitlerden kaynaklanan aday peptitleri ve geçişleri listelemek için kullanılır. Her referans miyoglobin, proteolize tabi tutulur ve elde edilen peptitler, hangi aday öncü iyonların ve geçişlerin en yararlı olduğunu keşfetmek ve eşleşen peptit tutma sürelerini belirlemek için sıvı kromatografi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile analiz edilir. Bu aşamanın sonucu, tür tayini için uygun olan geçişleri ile birlikte gözden geçirilmiş bir hedef peptitler listesi ve nispi kantitasyon için uygun bir CPCP çiftleri listesidir. Gerçek etleri test etmek için, numune ekstraksiyonları hazırlanır ve daha sonra hem miyoglobin hem de diğer yabancı proteinlerden peptitler üretmek için proteolize tabi tutulur. Miyoglobin bazlı peptitler daha sonra listelenen geçişlerine göre LC-ESI-MS/MS tarafından izlenir. Bir karışımda bulunan türler, işaretleyici peptitlerle ilişkili geçiş zirveleri ile tanımlanır. Bir ikili karışımdaki iki etin nispi miktarlarının tahminleri, geçiş tepe alanlarının oranları kullanılarak hesaplanır. Et çiftlerinden oluşan bir dizi test karışımı, belirli bir geçiş çifti için tepe alanlarının oranının gerçek karışımlara göre kontrol edilmesine ve kalibre edilmesine izin verecektir.

Protokol

1. Proteoliz ve Referans Myoglobins analizi

1. Referans myoglobins Proteoliz
   1. (- 25 mM amonyum bikarbonat içinde 0.5 mg / ml aralığı 0,2) ^3, saflaştırılmış bir referans myoglobins çözeltilerini hazırlamak.
   2. Aktarım 1 2 ml santrifüj tüplerine her numunenin ml'lik eş payları.
   3. Isı 30 dakika boyunca 95 ° C 'de sıcak bir blok numune ısıtılmasıyla ekstre proteinleri denatüre. bu sırada oda sıcaklığına ulaşana kadar, yaklaşık 15 dakika boyunca numune soğumaya. daha sonra, sindirimini arttırmak karıştırmak için üre (nihai konsantrasyon 0.5 M) 30 mg ekleyin.
2. triptik proteoliz
   1. 25 mM amonyum bikarbonat içinde tripsin 1 mg / mL çözelti ve gerektiğinde buz üzerinde muhafaza edin. Tripsin yeterli hacim ekleme son enzim aktivitesi 420 BAEE olduğu (N-benzoil-L-arginin, etil ester hidroklorür) birim / ekstre mg protein, daha sonra yumuşak bir vorteks ile karıştırın ve 3 gece boyunca proteolyze izin örneğin7 ° C.
   2. Proteoliz tamamlanmasını göstermek için sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) ¹⁷ yapınız.
3. Post-proteoliz numunenin Tuzdan arındırma
   1. 2: v: su ile v örnek 1 seyreltin.
   2. bir polimerik ters faz etkinleştirir (RP) kartuş metanol 1 ml eklenerek 30 mg RP malzemesi ile doldurulmuş, daha sonra 1 ml% 1 formik asit ilave edilerek kartuşu dengeye.
   3. yerçekimi altında kartuşun üzerine örnek yükleyin.
   4. yerçekimi altında% 5 metanol /% 1 formik asit içinde, 1 ml ile yıkayınız.
   5. yerçekimi altında 5 ul dimetilsülfoksit (DMSO) ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüpleri içine;: asetonitril / su, 1 ml (% 0.1 formik asit hac 90:10 h) ile peptidlerin elüt edilmesi.
   6. Daha sonra 250 ul asetonitril / su içinde bir tortu çözülür, 120 dakika süre ile santrifüj buharlaştırıcı kullanılarak 50 ° C'de vakum altında çözücüyü çıkarın (3:97 h: h;% 0.1 formik asit).
   7. transferdüşük hacimli bir otomobil örnekleyici flakon çözüm.
      Not: Örnekler sıvı kromatografi kütle spektrometrisi (LC / MS) analizi için hazır olana kadar 4 ° C'de saklanabilir.
4. MRM geçiş listelerinin oluşturulması
   1. UniProt veritabanından farklı etler için miyoglobin dizileri bulun.
   2. (Örneğin, Skyline) peptid ve geçiş tahmin yazılımı 'Hedef' kutu içine miyoglobin dizileri girin. Gerekirse, kendi fragman listesini ortaya çıkarmak için bir peptid üzerinde gezdirin.
   3. 'Ayarlar' tıklayın ve 'Peptit Ayarlar' seçeneğini seçin. Girdi sindirim için tercihleri ​​(yani tripsin) ve cevapsız bölünmeler sayısı (0). Özellikle, ek parametreler için gerekli olan seçim butonu, peptid uzunluğu (6-25), N-terminal hariç tutma (0) ve (yok) amino asit modifikasyonları almıştır.
   4. 'Geçiş Ayarları' Ayarlar 'tıklayın ve seçin. tercihlerini seçmekLC / MS analizi için kullanılan alet türü.
   5. 'İhracat' tıklayın ve üretilen MRM geçişleri ve parametreleri içeren bir tablo oluşturmak için 'Geçiş Listesini' seçeneğini seçin.
5. LC / MS ile analiz
   1. yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), otomatik örnekleyici, C18 çekirdek-kabuk HPLC sütunu (10 sm x 2.1 mm: İkili gradyan sistemi (h su (A) ve asetonitril (B)% 0.1 formik asit V ile her biri) ayarlama MRM algılama pozitif elektrosprey modunda çalışan bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi bağlı 2.6 um parçacık büyüklüğü).
   2. Veri toplama yazılımı (örneğin, Analist) 'de,' Dosya 've' Yeni 'seçin ve pop-up kutusu' Edinim Yöntemi 'üzerine tıklayın ardından' Tamam 'üzerine tıklayın.
      Not: Bu yeni bir LC / MS yöntemi kurulumu sağlayacak bağlı cihazların bir listesini içeren alet yöntemi düzenleyicisi açar.
   3. 'İkili Pump "ve i tıklayınTemel giriş 5 dakika boyunca 23 dakikada% 100 B'ye artan akış hızı değeri (300 ul / dak) ve 22 dakika boyunca% 30 B% 3 B, bir ikili gradyan profili ayar tablosunda gradyan kez, yıkayın daha 6 dakika başlangıç ​​koşullarına ve yeniden dengeleme dönmeden önce.
   4. 'Otomatik örnekleyici' tıklayın ve enjeksiyon hacmi (5 ul) yerleştirin. 'İğne Yıkama Döngüsü' etkinleştirin ve 'Yıkama Süresi' (30 sn) girin ve 'Flush Bağlantı Noktası' seçiniz.
   5. 'Termostatlı Kolon Kontrolörü' ve 'Kolon Fırını Özellikleri' set 'Sol Sıcaklık' ve 'Sağ Sıcaklık' (40 ° C) tıklayın.
   6. 'Kütle spektrometresi' tıklayın ve ardından kaynak gaz koşullarını girmek için 'Edit Parametreleri' tıklayın. 'Pozitif' olarak 'MRM (MRM)' ve 'Polarite' olarak 'Tarama Tipi' seçeneğini seçin. LC analizi için, toplam zamanı 'Dönem Özeti' gidin ve 'Süresini' girinD, dengeleme (35 dakika).
   7. Tabloda sağ tıklayın ve masaya bu sütunları eklemek için 'Declustering Potansiyeli (DP)' ve 'Çarpışma Enerjisi (CP)' seçiniz. Geçiş listesi (adım 1.4.5 bakınız) oluşturulan bir tek et türü için, geçişler için tüm Q1, Q3, Zaman (msn), kimliği, DP ve CE değerlerini girin.
      Not: Saat (msn), bekleme süresi kütle spektrometresi her geçişi tarayarak harcadığı zamanı ifade eder, toplama olan 3 sn geçmemelidir.
   8. Toplama Yöntemi dosyası (dosya uzantısı .dam) kaydedin.
      Not: - 1.5.8 Her et türü için tekrar edilmesi gerekir 1.5.2 adımları. Bu, aşağıdaki analiz için hazırlık ekran modunda her et türleri için tek bir yöntem dosyası oluşturur.
   9. veri toplama yazılımındaki, 'Edinme' tıklayın ve 'dengeye' seçeneğini seçin. Açılan kutuda, enstrüman dengelenmesini başlamak için gerekli Toplama Yöntemi seçin.
   10. ar örnek şişeleri koymakoto Örnekleyicide ack.
   11. 'Dosya' tıklayın ve 'Yeni' ardından 'Edinim Toplu' seçeneğini seçin. 'Örnek' sekmesinde 'Örnekleri Ekle ardından' Set 'seçeneğini seçin. numune sayısı analiz edilecek takın ve 'OK' tıklayın. 'Edinim' kutusuna açılır menüden analizi için kullanılacak yöntem dosyasını seçin.
   12. Tabloda, 'Plaka Kodu' seçin ve açılır menüden uygun tepsi yapılandırmasını seçin. sonra sağ tıklayın sütun başlığını 'Kodu Plaka' ve 'Aşağı Doldur' de sol tıklayın. 'Flakon Pozisyonu'nda satırların otomatik örnekleyici her numunenin konumunu girin.
   13. 'Veri Dosyası' in edinimi için dosya adını girin, sütun başlığında sonra sol tıklama sağ tıklama ile takip ve 'Aşağı Doldur' seçeneğini seçin. 'Örnek Adı' numunelerin her kimlik analiz edilecek yerleştirin. Bir satın alma toplu iş dosyası olarak kaydet (dosya, extension .dab).
   14. LC / MS analiz edilmesi gereken örnekleri vurgulamak 'Gönder' sekmesini tıklayın. 'Gönder' üzerine tıklayın. analiz başlamak için 'örnek başla' Edinme 've tıklayın.
       Not: Her satın alma yöntemi tek et türün kromatograf tüm uzunluğu boyunca MRM geçişleri için tarar. Bir MRM edinimi için kütle spektrometresi ayarları enstrüman tipi ve peptit göre değişir.
   15. veri görüntüleme yazılımı kullanılarak oluşturulan veri dosyaları görüntüleme. XIC (çıkarılan iyonları) ve tek bir öncü (Q1) için tüm parçaları (Q3 değerleri) vurgulamak Açılır listeden tıklayın. Yeni bir bölmesi sadece seçili geçişleri gösteren açılacaktır.
   16. Bu, tek bir peptide karşılık gelmektedir çünkü aynı anda geçiş grupları için tutma süresi _(Rt) kaydedin.
   17. Her biri için kendi peptidler zirveleri atamak için geçişlerin her set için önceki iki adımı tekrarlayınEt türlerinin.
   18. Tür tanımlamak temin edilmesi için uygun olan markör peptidleri kaydedin (örneğin, peptit HPGDFGADAQGAMTK, ön-madde: m / z = 752, _RT = at için 12.0 dakika) nispi nicelik için müsait çift karşılık gelen oluşturan birlikte tutma süreleri ile, ve dikkat .
       Not: Örneğin, at işaretleyici peptit (ön-madde, m / z = 752) karşılık gelen bir sığır peptidi HPSDFGADAQAAMSK (ön-madde, m / z = 767, _Rt = 13.2 dakika) sahiptir.
   19. , Sırayla her et türleri için, veri görüntüleme yazılımı, et türlerinin tüm kucaklayan tek bir dinamik yöntem oluşturmak (1.5.8 belirli bir peptid atanan) her habercisi için XIC geçiş verilerini açmak için.
   20. Sol tıklayarak seçilen tutma anda tepe kümede yakınlaştırmak ve küme altında imleci sürükleyerek. (Pik etikette sağ tıklayarak) en yoğun geçişler belirleyin.
   21. El ile geçişler kayıtBir e-tabloda ve saklama süreleri.
   22. LC / MS yazılımına yeni bir dinamik yöntem olarak parametreleri girmek için, 'Kütle Spektrometre' tıklayın ve ardından kaynak gaz koşullarını girmek için "Düzenle Parametreleri 'üzerine tıklayın. 'Pozitif' olarak 'MRM (MRM)' ve 'Polarite' olarak 'Tarama Tipi' seçeneğini seçin.
   23. 'Dönem Özeti' gidin ve (LC analizi ve dengeleme için toplam süre olarak ayarlanır) süreyi girin. Tabloda sağ tıklayın ve masaya bu sütunları eklemek için 'Declustering Potansiyeli (DP)' ve 'Çarpışma Enerjisi (CP)' seçiniz.
       Not: 'Zaman' sütunu artık her geçiş için beklenen tutma süresi (dk) karşılık gelir.
   24. LC / MS veri toplama yazılımı 'Düzenleme Parametreler' bölümünde, 'Programlı MRM' kutusunu işaretleyin. Q1, Q3, Süresi (dak), kimlik, elektronik tablo (1.5.21) 'de oluşturulan geçişleri için DP ve CE değerleri ve Devralma Yöntemi kaydetmek (fil girişie uzatma .dam).
       Not: Bu yöntem genellikle MRM sayısı her peptid için 4 en yoğun için geçişler ve gelişmiş hassasiyet ve veri kalitesini veren, sadece her peptit tepe tutma süresi penceresinde karşısında tarar azaltır. Bir 'dinamik' yöntemi 'güdümlü tutma süresi pencere' yöntemi, bazen denilen zamanlama olduğunu.

Kalibrasyon Örneklerinin 2. Hazırlama ve Analizler

1. et karışımlarının ekstraksiyonu
   1. Daha önce, sonra bir toz haline dondurulmuş et kullanılarak, 15 ml plastik santrifüj tüplerine et ilgili miktarda (yaklaşık 300 mg toplam kütlesi) tartılarak et karışımlarının bir dizi hazırlar.
   2. ekstraksiyon tamponu (pH 6.5 + 0.15 M fosfat tamponu, 0.15 M potasyum klorür) 4 ml. 30 saniye vorteksleyin. 250 devir / dakika ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir laboratuar karıştırıcısı üzerinde ekstrakte edin.
      Not: devir / dk bir titreşimli hareketine karşılık gelir.
   3. 2 ml aktarın2 ml mikrosantrifüj tüpü içine ekstrakte edin. 17,000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje.
   4. Aktarım 200 ul 2 mi santrifüj tüplerine süpernatanın alikotlan (protein tahlili için küçük bir miktar saklı 2.2) ve bir santrifüj buharlaştırıcı kullanılarak kuru (önceden belirlenmiş bir program: 50 ° C, havalandırma ve 120 dakika süre ile).
2. protein deneyi
   1. Aktarım, 96 gözlü bir levhanın gözleri içine üç kopya halinde ayrılmış süpernatan 7 ul tam bölünen miktarları (2.1.4).
   2. Aktarım üç kopya halinde Protein standartlarının bir dizi 7 ul alikotları, aralık 0-1,0 mg / ml sığır serumu albümini (BSA), aynı 96 plaka.
   3. Her bir oyuğa, Coomassie protein tahlili artı reaktif 200 ul ekle.
   4. Görme numuneler kalibrasyon standartları aralığında olup olmadığını kontrol etmek için protein standartları ile örnek kuyuların renk karşılaştırın. Gerekirse bu aralıkta olur böylece, seyreltilmiş numune ile tekrarlayın.
   5. st plaka bırakınve 3 dakika boyunca.
   6. Bir derialtı iğne ile oluşmuş herhangi bir kabarcıkları patlamaya.
   7. 595 nm'lik bir dalga boyunda bir standart uç protokolü kullanılarak plaka okuyucusu üzerinde plaka analiz edin.
   8. Protein standartlarının kalibrasyon verilerini kullanarak örneklerin protein konsantrasyonunu belirleyin.
      Not: Bu, triptik sindirimi kullanılan tripsin miktarının hesaplanması için gereklidir.
3. et karışımlarının Proteoliz
   1. 25 mM amonyum bikarbonat solüsyonu, 1 ml Aşama 2.1.4 kurutulmuş tortu yeniden çözülmemiştir. Bir rotamixer üzerinde iyice karıştırın.
   2. 1.3.7 adım 1.1.3 den protokolü uygulayın.
4. LC / MS ile analiz
   1. Daha önce (adım 1.5.1) olarak LC / MS ayarlayın.
   2. Et türlerinin hepsi birleştiren bir dinamik LC / MS yöntemi kullanır 1.5.24 de adımda oluşturulan satın alma yöntemi seçerek, ve için veri elde - Daha önce belirtildiği gibi, yeni bir satın alma toplu oluşturun (1.5.14 1.5.9 adımlar) Digested et örnekleri.
   3. veri görüntüleme yazılımı tam kromatogram gösterir. sırayla belirlenen her bir geçiş için Xic görüntüler. Görme her küme böylece seçilen peptid varlığını teyit beklenen tutma anda çan şeklindeki zirvelerinden gerekli sayı içerir onaylayın.
   4. Navigasyon bar 'kantitasyonu Yöntemi kurmak' üzerine çift tıklayarak ilgi geçişleri her biri için pik alanları entegre görüntüleme yazılımı verileri kullanarak kantitatif gerçekleştirin.
   5. 'Select Örnek' bölmesinde 'Veri Dosyası' ve 'Örnek' seçeneğini bir 'analitlerin' tablo oluşturmak için analiz edilecek.
   6. entegre edilecek geçişler (analitler) ilk görüntülemek için 'Bütünleşme' sekmesine tıklayın.
   7. Geçişlerin listesinde açılan görüntülemek için 'analit' kutusuna tıklayın. görüntülemek ve görsel doğru tepe entegrasyonu için seçilmiş onaylamak için sırayla her geçişi seçin. m'yeodify veya entegrasyon, sol tıklama zorlamak ve hedef zirve üzerine imleci (bu yeşil vurgulanır) sürükleyin. 'Select Tepe' butonuna tıklayın ve 'Uygula' düğmesine tıklayın.
   8. Bir yöntem dosyası (.qmf) olarak çalışma alanını kaydedin.
      Not: Bu örnek pik alanlarının izleyen hesaplamada bir kantitasyonu Yöntemi dosyası oluşturur.
   9. Navigasyon çubuğundaki çift tık 'kantitasyonu Sihirbazı'. 'Seçkin örnekleri' penceresinde sonra, bir veya daha fazla 'Mevcut Örnekler' tek bir 'Veri Dosyası' seçerek 'kantitasyonu Set' yaratmak. Seç 'İleri' 'Seç Ayarlar ve Query' kutusunu görüntülemek için. 'İleri' 'Seç Yöntemi' göstermek için seçin varsayılan ile bırakın. 'Yöntem' kutu adımda 2.4.8 oluşturulan 'Entegrasyon Yöntem' dosyayı seçin açılan, daha sonra 'Finish' seçeneğini seçin.
      Not: Bu et karışımlarının kaynaklanan geçiş pik alanları da dahil olmak üzere bir 'Sonuçlar Tablo' oluşturur.
   10. 'Sonuçlar Tablo' (dosya uzantısı .rdb), bir metin dosyası olarak ihracat (.txt) kaydedin ve verileri gözden geçirmek için e-tabloda açın.
   11. , Peptidleri ilgili iki parça içeren durumlarda odaklanan seçilen geçişler için seçilen MRM iki etler ölçülen yüzdesine göre başka bir et (geçiş pik alan ile) yüzde arsa grafikler (a / a) C-terminal ucunda sayılır gibi amino asitlerin aynı sayıda.
       Not: aynı parçalanma siteleri ile Özdeş parçaları optimum sonuçlar verir.
   12. Yukarıdaki 2.4.11 gelen araziler inceleyin. Ya görsel veya çizim paketinde bir eğilim satırı aracını kullanarak, doğrusal ve benzeri gradyan hem araziler bir grup tanımlamak. gerçek et örneklerinde kalibrasyon için, bu CPCP ek parçası kombinasyonlardan herhangi birini ya da daha fazlasını kullanarak.
       Not: sıradışı gradyanı gösteren bir çizim sinyal stre müteakip bir azalma ile peptit veya fragman bastırma ya da gösterebilirngth. Doğrusal Olmayan araziler kötü tepe algılama veya başka sorunlara işaret edebilir.

3. Et Örnekleri

1. Hedef et örneklerinden proteinlerin ekstraksiyonu
   1. Nerede bir spatula kullanarak örnekten uygulanabilir, tüketim yabancı olmayan et malzeme. Örneğin, bir soğutulmuş lazanya gelen sos ve makarna kazınması.
   2. bir metal kap içine et 20 g tartılır.
   3. pH 6.5, 0.15 M potasyum klorür / 0.15 M potasyum monofosfat tamponu 100 ml.
   4. 1 dakika boyunca yüksek hızlı bir homojenleştiricide et karıştırma proteinleri çıkarın.
   5. 2.3.2 - Adım 2.1.4 den protokolü uygulayın.
2. LC / MS vasıtasıyla numunelerin analizi
   1. Adımı tekrarlayın 2.4.2 dinamik LC / MS yöntemi kullanılarak veri elde etmek.
   2. Adım 2.4.3 gerçekleştirilen her et miyoglobinden peptidler belirleyin.
   3. nicelendirilmesi için, ilgi konusu her bir geçiş için pik alanları birleştiren niceleme yazılım kullanımı,gibi adım 2.4.9 olarak açıklamıştır.
   4. bir karışım türlerin tanımlanması için, geçişler numaralar için kararlaştırılan kriterleri karşılayan bu işaretleyici peptidler kaydedebilir ve bu geçişler için gürültü sinyal.
   5. kantitatif için, geçiş pik alanı ile yüzdesini kullanarak, adım 2.4.12 den anlaşmaya varıldığı şekilde entegre geçiş pik alanları kullanmak ve karışım iki türe miyoglobin yüzdesini hesaplar.
   6. Numunede mevcut iki etler göreceli ağırlık / ağırlık miktarları tahmin etmek etlerde muhtemel miyoglobin düzeyleri Literatürde ¹⁸ önceden bilgiyi kullanmak.

Sonuçlar

tek bir dinamik mod MRM deneyde her programlanmış geçiş ayrı kaydedilir belirli bir tutma süresi penceresi üzerinde (saniyede dedektör sayısı, cps gibi). Tüm veriler bir deneyde elde gelen bu nedenle, her bir geçiş için pik yoğunluğu ayrı ayrı elde edilebilir. Sonra sadece sonlu sinyal geçiş için belirlenen tutma süresi penceresinde içindir. Pencerenin dışında, sinyal tanımı gereği sıfırdır. Örneğin, herhangi bir geçiş için sinyal, attan 752 → 1269 (kütle 1,501.66 dalton, haberci iyon m / z 751,84 dalton, devlet = 2, fragmanı iyon y ¹³ şarj Monoizotopik peptid), tipik olarak ölçüm gürültü ve sadece rekabet etmek zorunda belki de diğer türlerden olabilir başka geçiş uç noktalarından korur. çıkışı, bu nedenle, ortak bir ön-madde iyonu paylaşan bu geçişler için ortak bir retansiyon süresinde temiz tepe geçiş başına bir, bir dizi.

Şekil 1, ağ / ağ% 1 bir karışımı dört geçişleri 752 → (1269, 706, 248, 1366) grubu çıkışını gösteren sığır atı. Görüntülenen dört geçişler atı ile ilişkili ve saf sığır, kuzu ya da domuz eti örneklerinde bulunmadığına olduğundan, bu zirveleri at varlığının işaretidir. gürültü seviyesi kimlik kurar için sağlamlık kriterlerine, iki veya daha fazla geçişler bir dizi bağlı olarak her bazı belirtilen sinyali aşan. Bu şekil, bu nedenle sığır, at a / a% 1 karışımında at varlığını belirler.

Bazen, bir tek izole geçiş tespit edilir. Bu kütle spektrometresi içine sistemden beklenen ve programlı olanlarla, muhtemelen bir yabancı protein, haberci iyonu ve tek parçanın bir şans maçı gösterir. Tekil tepe doğası ve beklenmedik bir alıkonma zamanında Oluşması, Sigöz ardı edilebilir bir kaza geçiş gnature.

her bir geçiş tepenin altındaki alan, tek tek hesaplanır. 767 → 1299 (sığır),. Karışımının gerçek etler oranı ile orantılı Şekil 2 bir gösterir, örneğin, → 1269 752 (ATI) için uygun bir fragmanı, sığır geçiş pik alanları at oranına bağlı sığır, at karışımında at ağırlık için yüzde ağırlığına karşı bu iki geçiş için pik alanı ile olan yüzdesinin grafiğidir. Yüzde geçiş pik alanları etin ağırlığı yüzde ağırlığını maç sonra eğim bu parselde eğim bu geçişler ve CPCP çifti için, geçiş pik alanları nispi miktarları güvenilir bir ölçü vermek olduğunu belirten, 1.03 1'dir karışımdaki iki etler. eğimi, diğer faktörler değişmeden ile numunedeki at eti, sonra sığır olarak miyoglobin iki kat zengin olsaydı Satır birden büyük olacaktır.

Şekil sığır at a / a% 1 için saklama zamana karşı 1. MRM geçiş yoğunlukları. Geçişler → (1269, 706, 248, 1366) 752 vardır, turuncu, sırasıyla, siyah, mavi ve yeşil gösterilir. işaretleyici peptit HPGDFGADAQGAMTK olup. Dört geçiş fragmanları Y'nin ^N peptit C-terminal ucunda N amino asitler sayma belirtir, sırasıyla y ^13, y ^{7, Y2} ve ¹⁴ Y, ifade edilebilir. Gürültü sinyal 23 ile dört geçişler üzerinde 53 arasında değişmektedir. Ek bir kırmızı çizgi 0% atı, karşılaştırma için% 100 sığır eti için 752 → 1269 geçişi ifade eder. tutma süresi sadece sıfır olmayan bölgesi gösterilir. Bu rakam, Watson ve ark., ³ modifiye edilmiştir.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil. Arsa peptidler sığır (767) ve at (752) ve her ikisi için y ¹³ fragmanı iyon çifti kullanan yüzde geçiş pik alanı olarak sığır atı karşı ağırlık için yüzde ağırlık olarak sığır atı 2. Konu,. Bir pik alanı anlamına gelir, o zaman koordinatı, 100 A, _H / (A, _H + A _B). En uygun hat ^(R2 = 0.99) eğimi 1.03 olduğunu. Bu rakam Watson ve ark. ³ modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Uygun bir hedef proteinin seçimi önemlidir. İyi bir hedef protein ilgi türlerinde gelen formlar, yeterli türe bağımlı dizisi varyasyonu, türlere göre, sahip ve organizmalar içinde erişilebilir miktarlarda bulunması gerekir. işlem görmüş olması karışımları (örneğin, ısı işlemi) belirlenmesi için, bu işlem nispeten bağışıklık bir sekansa sahip bir protein arzu edilir. Miyoglobin pişmiş kırmızı et de dahil olmak üzere kırmızı et, için iyi bir aday olduğunu, ancak tek olasılık değildir. hedef protein karar verildiğinde, protokolün en önemli parçası, protein proteoliz olduğunu. miyoglobin farklı bir protein de alternatif bir proteoliz protokolü talep edebilir.

açıklandığı gibi protokol referansı saflaştırılmış protein dayalı bir segment içerir. Bu tutma süresi pencereler ve uygun bir ön-madde ve fragman iyonu bilgiye amaçlamaktadır. Bu segment çok yararlı ama şart değildir.

, bazen sekans farkı, sindirim profilinde ciddi sonuçlara yol açar durumdur. Örneğin peptit çifti VLGFHG (sığır) ve ELGFQG (at) (gradyan Şekil 2'de daha az bir sürede tezahür) anormal niceleme sonuç verir. İkinci peptid karışımında at seviyesinin düşük tahmin neden nispeten bastırılmış KE bölünme ortaya olmasıdır. Farklı amino asitler ile başlayan tekabül eden peptidler bu nedenle en iyi kaçınılmalıdır. Genellikle iki karşılık gelen peptidler gelen fragmanlar aynı amino asit dizilerine sahip ve iyi davrandım, ama bu her zaman böyle değildir ve yöntem geliştirme sırasında kontrol edilmelidir. Türler kimlik daha az hassas göreceli kantitatif daha bu konular etmektir.

protokol dört kırmızı et için ortaya konmuşturs ^3. Çok fazla işaretleyici peptidler eş elute eğer geçiş zirve şeklinin kalitesi etkili bir bekleme süresini azaltmak ve sonuçta göreceli kantitatif tahminleri aşağılayıcı, bozulabilir olsa ek et türleri, dahil edilebilir. zaten mevcut gelişmiş enstrümantasyon, bu artıracaktır. Bununla ilgili bir konu değil, tüm etler farklı myoglobins olması. Örneğin, at, eşek ve zebra myoglobins aynıdır ve bu nedenle kesinlikle yöntemi konuşan sığır atı veya eşek ya da zebra tespit edebilen tek olduğunu. Bazı durumlarda, myoglobins denk olmasa da, bazı önemli peptidler olabilir. Örneğin, bazı kuzu miyoglobin türevli markör peptitler de keçi görünür.

Bu ve diğer protein bazlı niceleme yöntemi bakan bir komplikasyonu, protein ya da peptid seviyeleri, bir karışım içinde etler seviyelerine trivially kıyaslamak için ise, protein düzeyi, tüm türler arasında sabit kabul edilebilir olmasıdır. miyoglobin ve dört kırmızı mBu evrensel doğru değildir yiyor. Genel olarak düzeyleri dört düşük seviyede sergileyen domuz bağımlı türler vardır. Buna ek olarak, miyoglobin düzeyi et kesim ve hayvan yaşla birlikte değişir. Geçiş pik alanlarının oranları miyoglobin oranlarına güvenilir bir haritada rağmen Yani, gerçek et oranı haritalama karışımındaki etler muhtemel kaynaklarına ilişkin varsayımlara tahmini resmidir.

Bu çalışmada açıklanan yaklaşım, diğer geçme katkılardan bir dizi yolla farklıdır. Daha tipik yol farklı türleri için işaretler birbirine ^8-12,14,19 ile özel ilişkisi sahip bu durumda, çeşitli farklı türe bağımlı markör peptitleri tanımlamak için proteomik yöntemlerinin kullanılmasıdır. Buna karşılık, biz türe bağımlı dizisi ³ varyantları kadar ilgi tüm türlerin ortak proteinleri seçtiniz. Apart bizim göreceli kantitatif stratejisine merkezi olmaktan, bu o örnek avantajı vardırPreparasyon stratejileri optimize edilebilir. Buna ek olarak, bu karşılık gelen proteinler çıkarma ya da pişirme ya da konserve olarak örneklerin, ticari işlem, örneğin, benzer şekilde davranır beklenebilir. Türlere tanımlaması normal tipik haliyle bir ya da iki dizi farklılıkları sahip yakından ilişkili peptitlerin algılama ile CPCP yaklaşımı tür tanımlaması ilerler iken, farklı işaret peptitlerinin algılama yoluyla ilerler. Son olarak, protein kantitasyonu geleneksel ayrıca bilinen standartlara ^7,14,15 dayalı olarak her bir protein olarak mutlak nicelendirilmesi ile devam edebilecek başka bir tür olan ağırlıkça yüzde tahmin etmek. Ancak kalibrasyon yöntemi için bir ihtiyaç vardır CPCP yöntemi kullanılarak. Bunun yerine, göreceli seviyelerinin tamamen kesin bir ölçüm aşamasını atlayarak iki türden iki karşılık gelen peptitlerin sinyal güçlerini karşılaştırmak suretiyle tahmin edilmiştir. Nihai hedef ano bir türün ağırlık yüzdesi olduğuther, göreceli kantitatif, sonra CPCP hem daha doğrudan ve iki mutlak kantitatif ölçümleri karşılaştırarak daha basittir. Bu özellikler gıda sahtekarlık algılama alanında hızlı bir gözetim aracı olarak teknik kullanışlı hale rafine protokolleri kullanarak yaklaşık iki saat olması beklendiğinden kısa deneysel kez, çevirmek.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Uniprot database	www.uniprot.org		Protein dizilerinin serbestçe erişilebilen veritabanı
Skyline software	www.skyline.gs.washington.edu		Proteomik çalışmalar, peptit ve fragman için hedeflenen yöntemlerin oluşturulmasını sağlayan ücretsiz yazılım Tahmin
Amonyum bikarbonat	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, İngiltere www.sigmaaldrich.com	O9830
Metanol, HPLC sınıfı	Fisher Scientific, Loughoborough, İngiltere www. fisher.co.uk	10674922
Asetonitril, HPLC sınıfı	Fisher Scientific, Loughoborough, İngiltere www. fisher.co.uk	10010010
Urea	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Birleşik Krallık www.sigmaaldrich.com	U5378
Tripsin (TPCK ile tedavi edilen sığır pankreasından)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, İngiltere	www.sigmaaldrich.com T1426
Formik asit ve nbsp;	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Birleşik Krallık www.sigmaaldrich.com	F0507
Coomassie Plus Protein Tahlil Reaktifi	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Protein standardı	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Birleşik Krallık www.sigmaaldrich.com	P0914
Ultra Turrax homojenizatör T25	Fisher Scientific, Loughoborough, İngiltere www. fisher.co.uk	13190693
Edmund ve Buhler KS10 laboratuvar çalkalayıcı
Heraeus Fresco 17 Santrifüj	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Vakumlu santrifüj RC 1022	Jouan
Plaka Okuyucu
Strata-X 33u polimerik ters fazlı kartuşlar 60 mg / 3 ml tüpler	Phenomenex, Macclesfield, Birleşik Krallık	8B-S100-UBJ
4000 QTrap üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi	AB Sciex, Warrington, İngiltere www.sciex.com
1200 hızlı çözünürlüklü LC sistemi	Agilent, Stockport, İngiltere
XB C18 ters fazlı kılcal kolon (100 mm x 2,1 mm, 2,6 & m parçacık boyutu)	Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 yazılımı	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com		QTrap veri toplama ve analizi, tepe alanı entegrasyonu
dahil Otomatik numune alma şişeleri