Yöntem makalesi

İşitsel HEI-OC1 Hücreleri ile Çalışma

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 Eylül 2016

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1), şu anda araştırma amaçlı mevcut olan birkaç fare işitsel hücre hattından biridir. Bu protokol, farmakolojik ilaçların sitotoksik etkilerinin yanı sıra iç kulak proteinlerinin fonksiyonel özelliklerini araştırmak için HEI-OC1 hücreleri ile nasıl çalışılacağını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEI-OC1, araştırma amacıyla kullanılabilen birkaç fare işitsel hücre hattından biridir. Başlangıçta ototoksik ilaçların taranması için in vitro bir sistem olarak önerilen bu hücreler, ilaca aktive olan apoptotik yolakları, otofaji, yaşlanma, hücre koruma mekanizmasını, inflamatuar yanıtları, hücre farklılaşmasını, farmakolojik ilaçların genetik ve epigenetik etkilerini, hipoksinin etkilerini, oksidatif ve endoplazmik retikulum stresini ve moleküler kanalların ve reseptörlerin ekspresyonunu araştırmak için kullanılmıştır. Koklear tüy hücrelerinin diğer birkaç önemli belirtecinin yanı sıra, HEI-OC1 hücreleri endojen olarak dış tüy hücrelerinin paradigmatik motor proteini olan prestin'i eksprese eder. Bu nedenle, bu önemli işitsel proteinin yeni fonksiyonel yönlerini aydınlatmak için çok yararlı olabilirler. HEI-OC1 hücreleri çok sağlamdır ve kültürleri genellikle büyük komplikasyonlar göstermez. Bununla birlikte, streptomisin veya diğer antibiyotikler içeren yaygın anti-bakteriyel kokteyllerin kullanımından kaçınmanın yanı sıra hücre proliferasyonunu uyarmak için 33 °C'de inkübasyon ve hücre farklılaşmasını tetiklemek için 39 °C'de inkübasyon gibi bazı özel koşullar gerektirirler. Burada, HEI-OC1 hücrelerinin nasıl kültürleneceğini ve bunların hücre proliferasyonu, canlılık, ölüm, otofaji ve yaşlanma gibi bazı tipik tahlillerde nasıl kullanılacağını ve ayrıca yama-klemp ve doğrusal olmayan kapasitans ölçümlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Corti 1 Ev Kulak Enstitüsü Organ (HEI-OC1) hücreler transgenik fare 1,2 işitsel organdan türetilmiştir. 33 ° C /% 10 CO2 (permisif koşullar) bu transjenik fareden bir hücre inkübasyonu de-farklılaşma ve hızlandırılmış çoğalmasını tetikler bir immortalize genin ekspresyonuna neden olur; 39 ° C /% 5 CO2 en az Hei-OC1, hücre ölümü 2,3 halinde, çoğalma, farklılaşma azalma ve (non-permisif koşullar) talebi hücreleri ediyor.

HEI-OC1 hücreleri klonlanmış ve on yıl önce laboratuvarımızda karakterize ve ilk çalışmalar spesifik gibi lüks mah, miyozin 7a, Atoh1, BDNF, calbindinden ve kalmodulin olarak koklear saç hücrelerinin, belirteçleri, aynı zamanda destekleyici işaretleri ifade belirtti edildi Connexin 26 ve fibroblast büyüme faktörü reseptörü (FGF-R) 2 gibi bir hücre. Bu nedenle, HEI-OC1 bir Commo temsil kanısına varıldıCorti 2 organı duyusal ve destekleyici hücreler n progenitör. Penisilin gibi, olmayan ototoksik kabul ilaçlar, 2,3 vermedi iken Paralel çalışmalar bu hücrelerde kaspaz-3 aktivasyonu kaynaklı sisplatin, gentamisin ve streptomisin gibi ototoksik ilaçlar arketipsel güçlü deliller sağladı. Bu nedenle, bu hücre çizgisi ototoksisitenin potansiyel ototoksiklikleri veya farmakolojik ilaçların otoprotective özellikleri taranması için dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için in vitro bir sistem önerilmiştir. HEI-OC1 hücreleri son on yıl içinde yayınlanan birden fazla yüz elli çalışmalarında kullanılmıştır tahmin edilmektedir.

Farklı ilaçların potansiyel pro-apoptotik etkisi bakarak bu hücre hattını kapsayan çalışmaların çoğunda temel amacı iken, otofaji ve yaşlanma gibi diğer önemli hücre işlemleri sadece HEI-OC1 hücrelerinde 4-7 araştırılması başlamıştır. benna Laboratuvarımızda 8'den yeni bir çalışmada, sık sık klinikte kullanılan farklı farmakolojik ilaçların yol açtığı hücre ölümü, hayatta kalma, proliferasyon, yaşlanma ve otofaji ilgili verilerin kapsamlı bir dizi toplamak için HEI-OC1 hücreler kullanılmaktadır. Ayrıca aynı tedavi HEK-293 (insan embriyonik böbrek hücreleri) ve HeLa gelenler (insan epitel hücre) Hei-OC1 hücre yanıtları bazıları karşılaştırıldığında. Sonuçlarımız, Hei-OC1 hücreleri üzerinde çalışılan mekanizmaların en az birine farklı bir doza ve zamana bağımlı bir hassasiyetle, karakteristik bir şekilde, The her ilacın yanıt göstermiştir. Biz de deney sonuçlarını doğru bir yorumu birden fazla teknikle 8 ile paralel çalışmalar yapmak gerektirdiğini Bu çalışmada vurgulanmıştır.

Farklı çalışmada lüks mah fonksiyonel yanıtı, koklear dış saç hücreleri motor protein (OHCs) 9 değerlendirmek için Hei-OC1 hücrelerin kullanımı araştırılmıştır Yukarı. Bu izin veren (P-Hei-OC1) ve non-kültüre Hei-OC1 hücrelerinde Prestin ifade deseni, hem de doğrusal olmayan kondansatör (NLC) bütün hücre yama kenetleme çalışmaları akış sitometrisi ve konfokal lazer tarama mikroskobu incelemeleri rapor keyfi (NP-HEI-OC1) koşullar. Bizim sonuçlar, NP-Hei-OC1 hücrelerinde zamana bağlı bir şekilde, toplam Prestin sentezleme ve plazma membran lokalizasyonuna artış hem. İlginç bir şekilde, daha da bulundu toplam hücre ekspresyonunda önemli bir değişiklik olmadan sitoplazma plazma membranından transloke Na + K + ATPaz bir azalma ile ilişkili NP-Hei-OC1 hücrelerin plazma membranında Prestin lokalizasyonu artış. Ayrıca, p-Hei-OC1 hücreleri sağlam olarak kendisine plazma membranında bulunan Prestin moleküllerin yoğunluğu arttıkça azalmıştır motor fonksiyonları, Prestin ilişkili olduğunu göstermiştir. Toplamda, bu sonuçlar şiddetle HEI-OC yararlılığını destek1 hücreleri işitsel proteinleri araştırmak.

Bu video makalede, nasıl ilaca bağlı sitotoksisite ve nasıl mekanizması / sn değerlendirmek için nasıl sitotoksisite çalışmaları için (P-HEI-OC1) izin veren koşullar büyüyen hücreleri kullanmak daha uygun olur neden kültür HEI-OC1 hücrelerini, açıklamak elektrofizyolojik çalışmalar yapmak (örneğin, patch-kelepçe, doğrusal olmayan kapasitans (NLC)) lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Kültürü

Not: Tüm hücre kültürü protokolleri uygun hücre kültür teknikleri kullanılarak yapılmalıdır (: Bir Laboratuar El Kitabı, Cilt I 10 başvuru için Hücre Biyolojisi ilk 3 Bölümler bakınız). Hei-OC1 hücreleri uygun bir yapışma ve bir büyüme hücre kültür kaplarına ilave kaplama ya da işlem gerektirmez. Çok önemli: Hücre kültürü amaçlı cam yemekleri kullanmayın; fenotip ve farmakolojik ilaçların, hücrelerin biyolojik yanıt (yayınlanmamış G Kalinec & F Kalinec) değişecektir; geleneksel plastik hücre kültürü yemekleri (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) tavsiye edilir. Bulaşmayı önlemek için aseptik teknikler özellikle dikkat edin, ancak HEI-OC1 hücreleri ile antibiyotik (örneğin, ampisilin veya streptomisin) asla kullanmayın. Gerekirse HeLa ve HEK-293 hücreleri Hei-OC1 8, başka bir hücre soyu olabilir önceki çalışmalarda bir kontrol olarak kullanılmış olsa da, amfoterisin B kullanımıBu amaç için kabul edilebilir.

  1. Dondurulmuş HEI-OC1 Hücrelerinin Resüsitasyon
    Not: stria 13,14 vaskularis gelen bu protokol, aynı transjenik Corti 11,12 organdan, örneğin OC-K3 olarak, laboratuarda geliştirilmiş fare ve SV-K1 diğer hücre çizgileri de kullanılabilir.
    1. Sıvı N 2 dondurulan Hei-OC1 hücrelerinin bir şişe çıkarın ve 37 ° C'de bir su banyosu içine koyun. Şişenin sadece alt yarısı daldırın ve buz sadece küçük bir miktar şişede kalmaktadır kadar çözülme sağlar. % 70 alkol ile flakon dışını silin.
    2. (Dulbecco değiştirilmiş Eagle aracı maddesi gibi önceden ısıtılmış büyüme ortamında 10 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içine yavaşça bütün hacmi (-1.5 x 10 5 hücre / mi), damla damla, şişeden hücreler pipet ve teslim DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir.
    3. t atarak, 5 dakika boyunca 300-500 xg tüp santrifüjle DMSO kaldırO süpernatan ve yeniden süspansiyon, taze büyüme ortamına (DMEM +% 10 FBS) 9 ml hücreleri. orta ve tersi, tüpün alt dokunmadan pipet ucu ile üç dört kez pipetle dan, asma hücrelerinin akı ve reflü kümeleri veya hücre yaprak parçalara ayırma.
    4. 100 mm çapında işlenmemiş plastik hücre kültürü tabakları büyüme ortamı içinde süspansiyon haline hücrelerin toplam hacmi yerleştirin.
    5. % 10 CO2 (izin veren koşullar) ile 33 ° C'de inkübe hücreleri.
  2. HEI-OC1 Hücrelerinin Altkültür
    Not: izdiham önce (~% 80) hücre boyama kültür önlemek için süspansiyon ve alt-kültür haline getirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, aynı zamanda stria gelen 13,14 vaskularis, çorti 11,12 ve SV-K1 organdan Bu OC-K3 aynı transgenik fare laboratuvarda geliştirilen diğer hücre çizgileri, kullanılabilir.
    1. 2 ml PBS ile hücreleri eski orta alın ve yıkama.
    2. Yüzey alanı 25 cm2 başına 1 mi kullanılarak,% 0.25 tripsin solüsyonu ile hücre mono tabakasının örtün. hücrelerin% 40'ından fazlası çıkartılması gerekmektedir sonraki adıma hareket ettirin. Gerekirse, ters bir mikroskop kullanılarak hücrelerin inceleyin ve "tokat veya dokunun" kalan bağlı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe kültür yemekleri.
      Not: hücre ölümüne neden olabilir uzun süre trypsinization olarak özen gösterin; Yeterince ve transfer hücreleri olacak planlanan çalışmalar için yetersiz. değil
    3. 1.1.3 tarif edilen prosedür izlenerek, hücrelerin tekrar ve 15 ml konik bir tüp aktarın.
    4. 300-500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje, orta atmak, taze büyüme ortamına hücreleri toplamak ve, en az dört, 100 mm çapında, hücre kültür kaplarına bunları tohum. çanak başına hücre sayısı, geri kazanılan hücre miktarına bağlıdır. % 10 CO2 (P-Hei-OC1) ile 33 ° C'de inkübe hücreleri ve için gerekli daha birçok kez bölmekPlanlanan deneyler ya da yeni bir stok oluşturmak için.
    5. stok hazırlanması için, 250-550 ml hücre kültürü şişeleri ile 100 mm çaplı yemekler yerine; Deneyler için, daha küçük bir yemekler veya çok-kuyucuklu plak daha uygun olabilir.
    6. Onlar gelinceye kadar farklılaşma, ~ hoşgörülü koşullarda% 80 izdiham HEI-OC1 hücreleri inkübe; daha sonra 2 ila 3 hafta içinde,% 5 CO2 (NP-Hei-OC1) 39 ° C'ye kadar yemekler hareket eder.
      Not: Hücreler giderek çoğalan ve ölen duracaktır. Ölü hücreleri çıkarmak için her gün orta değiştirin. daha fazla hücre deneyleri için uygun olacak, genellikle yaklaşık 4 hafta sonra, orijinal hücre sayısına bağlı olarak. Hücreler NP koşullarında yerleştirilir olarak farklılaşma en kısa sürede başlar, ancak her hücre aynı hızda ayırt. Önemlisi, nitel sağlayan (Şekil 4 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) farklılaşma sürecinde ifade ve membran yerelleştirme artar Prestinve farklılaşma düzeyi kantitatif bir gösterge.

2. İlaç Sitotoksisite çalışmaları

Not: izin veren koşullar (P-HEI-OC1) yetiştirilen HEI-OC1 hücreleri bu çalışmalarda (Şekil 1 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) için tavsiye edilir.

  1. Hücre Canlılık (MTT testi)
    1. 1.2 anlatılan prosedürü izleyerek P-HEI-OC1 hücreleri toplamak ve otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ya onları saymak. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    2. 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum substrata eklenmesi için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın!
    3. ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C'de), imalatçının protokolü izlenerek MTT gerçekleştirin. Genel olarakBu deney için protokol, aşağıdaki adımları vardır:
      1. Her bir oyuğa, MTT ayıracı 10 ul ekle.
      2. mor boya görünene kadar 2 ila 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası ve daha sonra her bir MTT Deterjan reaktifi 100 ul ilave edin. plaka sallamayın.
      3. plaka Kapak ve 37 ° C'de 2 saat 4 için karanlıkta bırakın.
      4. boşlukları (tek başına büyüme ortamı) de dahil olmak üzere, her bir 570 nm'de absorbansı ölçmek için bir mikro-plaka plaka okuyucusu kullanarak. canlılığı% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama OD kullanarak veri normalize.
  2. Kaspaz 3/7 aktivasyon deneyi
    Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir.
    1. 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    2. wh üzerinde hücreleri Tohum(100 ul oyuk başına), 96 gözlü levhalar ite duvarlı, alt-tabakaya bağlanması için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın!
    3. ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C'de), ilgili üreticinin protokolü takip kaspaz deneyi yapar. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır:
      1. , Reaktifler hazırlayın iyice karıştırın ve onları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
      2. inkübatör hücreleri çıkarın ve plakalar oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın.
      3. Aynı pipet uçları ile farklı örnekleri içeren kuyu dokunmadan değil tarafından çapraz bulaşmayı önlemek için dikkatli olmak, iyi her reaktif belirtilen miktarda ekleyin.
      4. plaka Kapak ve 300-500 rpm'de bir plaka çalkalayıcı kullanarak 30 saniye boyunca karıştırın.
      5. en az 30 dakika, bir süre için, oda sıcaklığında inkübe plakası. determinampirik optimum kuluçka dönemi e. Oda sıcaklığı sıcaklık dalgalanmaları lüminesans okuma etkileyecektir, çünkü sabit sıcaklık kuluçka kullanın dalgalanmalar durumunda.
      6. her bir lüminesans ölçümü ve kaspaz aktivasyonunun% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama ışıldama kullanarak değerleri normalize.
  3. Hücre Bölünmesi (Proliferation)
    1. 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
    2. 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum alt-tabaka bağlanma izin veren koşullar gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın!
    3. muameleden sonra bir saat, her çukuruna hazırlanan 100x BrdU 1 ul (5-Bromo-2'-deoxyuri) Çözeltisi yemek ve 33 ° C'de inkübatör plakaları döndürür.
    4. 12, 24 ve 48 saat sonra, ilgili plakalar mevcut orta kaldırmak ve PBS ile de bir kez, her yıkama.
    5. Üreticinin protokolü takip hücre proliferasyon tahlili gerçekleştirmek. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır:
      1. / Sabitleme de dahil olmak üzere, üreticinin protokolüne belirtildiği gibi denatüre edici çözelti, yıkama tamponu birincil antikor algılama çözeltisi, ikincil antikor algılama çözeltisi ve BrdU çözelti belirteçlerinin hazırlayın.
      2. üreticinin protokolü gösterilen miktarlarda, her bir kuyucuğa sabitleme / denatüre solüsyonu ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında plaka tutun.
      3. Kurma / denatürasyon çözeltisi çıkarın ve üreticinin protokolüne belirtilen konsantrasyonda primer antikor ilave edin. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında plaka tutun.
      4. Primer ant ile çözüm çıkarıniBody, plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkayın ve daha sonra imalatçının protokolüne belirtilen konsantrasyonda sekonder antikoru ilave edin. 30 dakika için oda sıcaklığında, ikincil antikor ile plaka tutun.
      5. , Ikincil antikor ile çözüm çıkarın plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkanır ve substrat ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyondan sonra, durdurma çözeltisi ilave edin. Dikkatli olun: renk değişimi kontrol; çözüm çok karanlık olursa, 10 dakika standart geliştirme zamanı öncesinde reaksiyonu durdurmak.
      6. Durdurma çözeltisi ekleyerek 30 dakika içinde 450 nm'de absorbansı okumak.
  4. sitotoksisite
    Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir.
    1. tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri.
    2. Tedavi sonundaHücreleri, PBS ile üç kez yıkanır, ve 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml ile çıkarınız.
    3. çıkardıktan sonra toplamak ve 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri Süpernatantı ve sitotoksisite analizi dahil reaktif ile karanlıkta 15 dakika için hücrelerin lekelenmesi.
    4. akış sitometresinin üreticisi tarafından belirtilen sitometri olarak akış canlı HEI-OC1 hücrelerinin sayısını belirler.
  5. yaşlılık
    1. tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri.
    2. Güvenilir sonuçlar sağlamak için bilinen Debacq-Chainiaux ve ark., 15 ya da başka bir yöntemle tanımlanan protokol ile akış sitometrisi kullanılarak yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz pozitif hücrelerin sayısını belirler. flow sitometri için kısa bir protokol şudur:
      1. deneysel tedavi sonunda, hücrelerin PBS ile üç kez yıkanır ve daha sonra izin veren koşullar da 1 saat süre ile hücre kültür ortamı içinde, 100 nM bafilomisin A1 ile inkübe edin.
      2. ~ 33 uM'lik bir son konsantrasyonda C12FDG ekleyin ve 1-2 saat boyunca hücrelerin inkübe edilmesi devam edin.
      3. 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml kullanarak hasat, PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile bunları pelet.
      4. buz soğukluğunda PBS hücrelerin yeniden süspanse edin ve akış sitometresi üreticisi tarafından gösterildiği gibi akış sitometrisi ile pozitif Hei-OC1 hücrelerinin sayısını belirler.
  6. otofaji
    1. Hei-OC1 hücreleri kontrol etmek ve aç 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek (48 saat boyunca serumdan yoksun) ve standart protokoller izlenerek, batı lekesi üzere işlemden toplayın. Genel olarak, Western blot protokolleri, aşağıda st bilgisieps:
      1. 1.0 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda, 6 oyuklu tabaklar Tohum Hei-OC1 hücreleri. 24 ve / veya 48 saat sonra, buz gibi soğuk PBS ile yıkayın hücreleri.
      2. Lyse ile TNESV tamponu (% 1 NP40, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4), buz üzerinde 5 dakika süre ile proteaz inhibitör kokteyli ile ve 1 mM PMSF 200 ul.
      3. (Her bir alt kazıma) hücreler toplama 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,800 x g'de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj aktarın.
      4. süpernatantlar toplamak ve BCA Testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek.
      5. proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 5x yükleme tamponu ve her bir örnek için, 1 mM DTT ve kaynatılır.
      6. % 4-12 jel üzerinde SDS-PAGE kullanılarak örnekleri çalıştırın ve PVDF zarlarına transfer.
      7. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca Tween 20% 0.1 TBS-T içinde% 5 yağsız kuru süt ile bloke membranlar.
      8. Birincil ant ile 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe membranlaribodies.
      9. Sonraki gün, TBS-T ile iyice membranları yıkamak ve yaban turpu peroksidazı (HRP) (1: 1500) konjüge edilmiş bir sekonder IgG ile inkübe 1 saat karıştırıldı.
      10. bir chemiluminescence (ECL) algılama sistemi ile immünoreaktivite algılar. standart olarak (% 10 yağsız kuru süt ile TBS-T içinde 2.000 1) GAPDH kullanılarak protein ekspresyon seviyelerini normalize.
    2. Western blotlar olarak ekspresyonunu incelemek en azından bu Beclin-1 ve LC3B olarak Otofaji iki farklı işaretleri (genellikle 1 için:% 2.5 BSA ile TBS-T içinde 1000 seyrelti). GAPDH veya aktin gibi protein ifade bir denetim bakmak için unutma.
    3. Böyle kamu malı NIH Image veya ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) gibi dijital Blot tarayıcı veya bilgisayar yazılımı kullanılarak dansitometrisi tarafından ilgilenilen proteinin ifadesini değerlendirir.

HEI-OC1 Hücreleri ile 3. Elektrofizyoloji Deneyler

  1. Hasat Hücreler
    Not: kullanımlar hücreleri 50% -80% birbirine karıştığında 100 mm çaplı kültür tabaklarında büyüyen. Tripsin, Accutase bir asetik asit (PBS-EDTA) etra meti! D iamine t uffered s aline + e B enzim içermeyen bir çözelti ya da p hosphate- gigaseals sayısı ve kalitesi üzerinde önemli bir etkisi olmaksızın hücreleri kaldırma için kullanılabilmektedir . Bazı durumlarda ise, tripsin tedavisi hücreleri daha kırılgan hale getirmektedir. Bu gibi durumlarda, hücreler, bir deney başlamadan önce, yaklaşık 30 dakika boyunca geri sağlar.
    1. 10 ml Ca olmadan PBS 2+ ve Mg 2+ ile iki kez hücreleri yıkayın.
    2. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 3 dakika boyunca yemekler gibi enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi gibi bir enzim içermeyen detacher çözeltisi 2 mi, ekleme ve inkübe edilir.
    3. Hücrelerin dekolmanı kontrol etmek için ters bir mikroskop kullanın. Gerekirse, cel hareketl kültür çanak fazla hücreleri ayırmak için, ama nazikçe yapın.
      Not: çanak sallamayın.
    4. DMEM +% 10 FBS, 10 ml ilave edilir ve yavaşça yukarı ve 10 ml bir pipet ile beş defa hücreleri pipetle.
    5. Mikroskop altında hücrelerin bak. Hücrelerin>% 80 zaten (tek) ayrılmış ise, başka pipet gereklidir. Hücreler kümeler hala varsa% 80'den fazla hücreleri tek olana kadar yavaşça pipetleme tekrarlayın.
    6. 100 x g'de 2 dakika süre ile, 15 ml konik bir tüp içine santrifüj süspansiyon hücrelerinin ~ 10 mi yerleştirin ve süpernatant atılır.
    7. hücreler tekrar süspansiyon - harici kayıt solüsyonu ~ 200 ul kullanarak (damıtılmış su ile 310 mOsm Leibovitz L-15 ortamı 305 ayarlanmıştır). hücrelerin optik kontrol pürüzsüz zar kenarlara sahip çok sayıda tek, yuvarlak hücreler göstermesi gerekir.
  2. Patch-kelepçe ve NLC Ölçümler
    1. yama-kelepçe ve bir kullanarak voltaj bağımlı doğrusal olmayan kapasitans ölçümü (NLC) gerçekleştirindequate yükselticiler ve yazılım, yanı sıra standart elektrofizyolojik teknikler. İç (intrapipette) çözeltisi kullanımı, 150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 0.1 mM EGTA, 2 mM ATP, Mg gibi, 0.1 mM GTP-Na ve 10 mM HEPES; Tris ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın.
    2. Mikroskop altında, yuvarlak ve pürüzsüz zar kenarlara sahip tek, sağlıklı hücreyi seçin. hücre yüzeyine cam pipet ucu takın ve membran direnci kontrol edin. Bu ~ 2 um pipet ucu, iç çapı (ID) tekabül eden, yaklaşık 3-6 megohm olmalıdır.
    3. Yavaşça hücre plazma zarı karşı mikropipet ucu basın ve sonra emme uygulanır. 100 gigaOhms (gigaseal) - hücre zarının bir kısmı 10 için bir elektriksel direnç üreten pipet içine emilen olacaktır.
    4. Emme darbeleri ile plazma zarı bozarak tüm hücre durumunu kurmak.
    5. Kontrol 9 gibi, bu HEK-293 olarak Prestin eksprese etmeyen hücreler, kullanma.
      Not: Şu tepkiler 5 kHz filtre edilmelidir ve düzeltmeler artık seri direnç etkileri için yapılmış. Tüm veri toplama ve çoğu analizler genellikle kilitli amplifikatörler birlikte gelen yazılımı kullanılarak yapılabilir. Kapasitans fonksiyonu membran gerilimine 16 doğrusal olmayan ücret ile ilgili bir iki devlet Boltzmann fonksiyonunun birinci türevi takılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yayınlar bir çift biz birkaç sık kullanılan farmakolojik ilaçlara HEI-OC1 hücrelerinin tepkisini değerlendirirken yanı sıra Prestin fonksiyonunu 8,9 araştırılması amaçlanmıştır çalışmaların kapsamlı bir dizi bildirdi. Bu çalışmalarda önceki bölümlerde açıklanan tüm protokollerin kullanımını yaptı.

Bu önceki çalışmaların sonuçlarından biri HEI-OC1 hücreleri non-permisif koşullarda kültüre oldu (39 ° C /% 10 CO

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda nasıl kültür HEI-OC1 hücrelerini açıklamak ve ilaca bağlı sitotoksisite mekanizmaları değerlendirmek için bunları kullanmak ve lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için. teknik prosedürler, ancak kolayca farklı çalışmalara adapte edilebilecek kadar geneldir.

Burada tarif edilen tüm protokoller, köklü hücre kültürü teknikleri 10 doğru kullanımını gerektirir. Sadece herhangi bir başka hücre hattı olduğu gibi, Hei-OC1 hücreleri ile çal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar mevcut veya potansiyel bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH Hibeleri R01-DC010146 ve R01-DC010397 tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HEI-OC1 hücreleriTÜM TAHLİL KİTİMLERİ, EKİPMANLARI& nbsp;
Sınıf II Biyolojik Güvenlik kabiniBaker CompanySterilgard IIIVE
Soğutmalı santrifüjdebelirtilen şirketler Eppendorf5810RÖNCEKİ 2 SÜTUN YALNIZCA
Ters mikroskopZeissAxiovert 25EXAMPLE, VE DİĞER BENZER HERHANGİ BİR
WaterbathStovallHWB115ÜRÜNÜ KULLANILABİLİR.
Hücre sayacıNexcelomCellometer Auto T4
İki (2) Hücre inkübatörü, biri 33 ° C'de; C/%10 CO2 ve diğer 39 &°C; C/5% CO2Forma Scientific3110
Hücre kültürü kapları, PS, 100 mm x 20 mm havalandırma delikleri ileGreinier Bio-One664-160
Hücre kültürü kapları, PS,  60 mm x 15 mm havalandırma delikleri ile Greiner Bio-One628160
Cellstar doku kültürü şişeleri  250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar doku kültürü  şişeler 550 mlGreiner Bio-One660-175
  6 oyuklu hücre kültürü plakası, kapaklı-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Doku kültürü plakası, 96 oyuklu, kapaklı düz tabanlıBecton Dickinson353072
Mikro Test Plakası, Chimmey, 96 oyuklu beyaz, şeffaf dipliGreiner Bio-One655098
50 ml Kapaklı polipropilen konik tüp CellstarsBecton Dickinson 352070
15 ml Kapaklı Polipropilen konik tüpler-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7.4 (1x) Yaşam Teknolojileri10010-023
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Fetal sığır serumu (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz'in L-15 Medium, fenol kırmızısıGibco / Invitrogen21083-027
Tripsin,% 0.25 & nbsp;Yaşam Teknolojileri25200-056
TACS MTT Hücre Proliferasyon Test KitiTrevigen4890-25-K
Kaspaz-Glo 3/7 Test ve nbsp; kitiPromega  G8091 
BrdU Hücre Proliferasyon Test Kiti Hücre Sinyalizasyonu6813
Enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi Sigma-AldrichC5789
Hücre-Toks Yeşil Sitotoksisite Test KitiPromega  G8741 
FACSAriaIII cihazı BD Biyobilimler& nbsp; FACSAriaIII488 nm uyarmalı (mavi lazer)
Dijital Leke TarayıcıLI-CORC-DiGit
Elektroforez ve Lekeleme ÜnitesiHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Soft Max Pro 5.2 Yazılımlı Plaka OkuyucuMoleküler CihazlarSpectraMax 5
Yama-kelepçe amplifikatörüHEKAEPC-10
Çektirme hazırlamak için yama elektrotlarıSutter InstrumentsP-97

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre K lt rProliferasyon AnaliziViabilite AnaliziYama Kenetleme Patch ClampDo rusal Olmayan KapasitansPrestin EkspresyonuAk SitometrisiS cakl k nk basyonuH cre Diferansiyasyonu

İlgili makaleler