Yöntem makalesi

Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon

11.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54444

⸱

7 Eylül 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

Bu makalede

Özet

Bu kadın üreme sisteminin normal ve transforme epitel çalışmaları için uygun bir yumurtalık FAD pedi nakli deneyi tarif eder. Fare yağ yastığı, geniş doku parçalarının nakli izin verir cerrahi ve görüntüleme için kolay erişilebilir ve Müllerian kökenli dokular için en uygun yerli bir ortam sağlar.

Özet

Farelerde ortotopik transplantasyon testleri, hücre yenilenmesi ve neoplastik transformasyon çalışmaları için paha biçilmezdir. Over yüzeyi ve tubal epitelin ortotopik transplantasyonu için yaygın yaklaşımlar, hücrelerin intraperitoneal ve intrabursal uygulamasını içerir. Bu yöntemlerin ilgili sınırlamaları, enjekte edilen hücrelerin kötü tanımlanmış konumunu ve sınırlı alan hacmini içerir. Ayrıca, nakledilen organların uzun süreli yapısal korunması için pek uygun değildirler. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, hücrelerin ve doku parçalarının fare yağ pedine sokulmasına dayanan alternatif bir yaklaşım geliştirdik. Fare yumurtalık yağ yastığı, yumurtalık ve uterus tüpünün (diğer adıyla yumurta kanalı, fallop tüpü) hemen yakınında bulunur ve bu organların hücreleri ve dokuları için tanıdık bir mikro ortam sağlar. Bizim yaklaşımımızda, floresan işaretli fare ve insan hücreleri ile uterus tüpünün parçaları minimal travmatik dorsal insizyon cerrahisi kullanılarak engrafte edilmektedir. Nakledilen hücreler ve bunların büyümesi, 40 günden fazla bir süre boyunca yumurtalık yağ yastığına kolayca yerleştirilir. Tüm uterus tüpünün uzun süreli nakli, tüm temel doku bileşenlerinin doğru bir şekilde korunmasına izin verir ve fibroz ve iltihaplanma gibi olumsuz yan etkilere neden olmaz. Yaklaşımımız, belirli hücre popülasyonlarının farklılaşması, rejeneratif ve neoplastik potansiyeli gibi önemli biyolojik soruları yanıtlamak için benzersiz bir şekilde uygulanabilir olmalıdır. Ayrıca, normal gelişim ve kanserde mikroçevresel faktörlerin çalışmaları için uygun olmalıdır.

Giriş

farelerde belirli vücut sitelerine hücre ve dokuların getirilmesini, Transplantasyon deneyleri, doku rejenerasyonu ve karsinogenez çalışmaları için önemli bir yaklaşımı temsil etmektedir. hücrelerin Ortotopik transplantasyonlar, yani, bir ana ortamın içine yerleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin tanımlanması için özellikle önemlidir. Meme kök hücrelerin varlığı ilk farelerin 1 bezi serbest meme yağ pedleri içine epitel meme bezi parçalarının nakli önerildi. Insanlaştırılmış fare yağ yastığı 2 Aşı deneyleri, insan primer meme epitelyal hücrelerinin yeniden üretilebilir potansiyel ve normal gelişim özetlemek için kullanılmıştır. Ayrıca, temizlenmiş ve memenin yağlı pedine fenotipik farklı hücre tiplerinin seri ve sınırlayıcı seyreltme transplantasyon meme kök hücrelerin 3-5 kendini yenileme ve multilinaj farklılaşmasını test etmek için çok önemliydi. combinat Transplantasyon deneyleriGenetik soy iyon meme karsinogeneziste 5 menşe hücrenin kanıt sağladı izleme. Böbrek kapsülü nakilleri sıklıkla putatif prostat kök hücreler 6 özelliklerini test etmek için kullanılmıştır. Normal ve neoplastik fare ve insan pankreas organoids ortotopik transplantasyon kanseri ilerlemesinde 7 değişmiş genleri ve yollar ortaya çıkardı. Yerli çevrenin önemi de sonra bu tür meme yağ yastıkları, omuz yağ pedleri ve arka cilt 8 olarak farklı yerlerde, içine ter bezlerinin engraftments farklı rejenerasyon gösterilmesi tarafından desteklenmektedir.

Periton boşluğu ve yumurtalık bursa, genellikle dişi üreme yolunun 9-12 epitel hücrelerinin ortotopik transplantasyon için yerler olarak kullanılır. Bu yöntemlerin her ikisi de sınırlamaları bir dizi. hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu karın boşluğu farklı alanlarda implantasyon yol açar, bu şekilde comhücre büyümesini izlemek plicating. Ayrıca, mikro-varyasyonlar, örneğin damarlanma, innervasyon ve immün hücre temsil uzantısı olarak, periton boşluğu farklı alanlarda oldukça önemli olabilir. Yumurtalık bursa sıvının en fazla 10 ul enjekte etmeyi sağlamak, çok sınırlı bir hacme sahiptir. Bu önemli ölçüde tatbik edilebilir hücre miktarını sınırlar. Ayrıca, yumurtalık bursa içine enjeksiyonlar oldukça teknik olarak zor olabilir ve işlem süresi önemli miktarda gerektirir.

Bu sınırlamaları gidermek için, biz yumurtalık yağ yastığı özelliklerinin avantajlarından almış. Fare yumurtalık yağ yastığı, büyük bir boyuta sahip yumurtalık ve rahim tüp bitişik ve cerrahi ile kolayca erişilebilir. At trofoblast mouse over yağ yastığı 13 naklediliyor edilebileceği bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin ayrıntıları tarif edilmemiştir. Aynı zamanda bu benim eğer rapor değilmetod ile yetişkin hücre ve dokuları için uygulanabilir. Burada, fare ve dişinin üreme kanalında insan hücrelerinin nakli için güvenilir bir yöntem anlatılmaktadır, bu yöntem, aynı zamanda, uzun süreli, organ nakli için de uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

Protokol

anlatılan tüm in vivo çalışma Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

Yumurtalık Fat Pad Tahliller için 1. Örnek Hazırlıklar

  1. İzolasyon ve Kültür İlköğretim Tubal Epitel (TE) Hücreler
    1. CO 8 haftalık bakire β-aktin-Geliştirilmiş Yeşil floresan proteini (EFGP) ya da β-aktin-Discosoma Kırmızı Floresan Protein (DsRed) farelere servikal dislokasyon tarafından takip 2 yönetimini verici 6- euthanize. Bir ayak tutam başarılı ötenazi doğrulayın.
    2. emici drape, ventral yüzü up bireysel fare yerleştirin ve sonra% 70 etanol ile karın silin. vücut orta hatta lateral kesi yaparak ve parmak uçları üzerinde ve fare baş ve kuyruk doğru kesi altında cilt çekme ile cilt açın.
    3. Künt forseps kullanarak periton tutun ve vücut boşluğu açmak için ince makas ile kesim yapmak. Yavaşça intestin bobini itmekKenara e ve üreme organları bulun.
    4. ince forseps ile bir uterin boynuz pick up ve rahim boynuzları ayrı noktasının üstünde 0,5 cm kesti. uterin boynuz tutarken, bağ uterin boynuz bağlı doku, rahim tüp, yumurtalık ve yumurtalık yağ yastığı uzak teşrih. 6 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanak içinde parçalara üreme yolu yerleştirin. İkinci üreme sistemi ile devam edin.
    5. Bir Biyogüvenlik kabine çanak aktarın ve steril PBS 6 ml dokular 3 kere yıkayın. Biyogüvenlik kabinede yer alan bir diseksiyon mikroskobu altında çalışmaya devam. ince cımbız ile uterin boynuz tut ve utero-tubal kavşakta kesilmesinin uterin tüp uterin boynuz ayırın. 25 G iğne kullanılarak yumurtalık çevreleyen yumurtalık bursa kesin.
      Not: Yumurtalık bursa çıkarıldıktan sonra, diseksiyon tamamlandıktan ve bireysel uterus borusu PBS çözeltisi kalır.
    6. Bir Singl aktarın3,5 cm tabak PBS 50 ul damla e uterin boru ve 28 gauge iğne kullanılarak 0.1 mm parçalar halinde kıyma. 200 ul sindirim tamponu 1 (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) F12 (Ham) ortamı 300 birim ml -1 kollajenaz ve 100 ünite ml -1 Hyaluronidaz ile takviye edilmiş) ve transfer, bir% 5 CO, 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe 2 inkübatör.
    7. İnkübasyondan sonra, 1 mi,% 0.25 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 1 ml pipet ucu (aka mavi ucu), 3 dakika boyunca 20 kez yardımıyla çözelti askıya. (Ham) ortamı,% 2 fetal sığır serumu içeren 5 ml, + 4 ° C DMEM / F12 ekleyin.
    8. ((Ham) ortamı 7 mg ml -1 Dispase II ve 10 ug ml -1 Deoksiribonükleaz I ile takviye santrifüj (600 RCF, 5 dakika, oda sıcaklığında (RT)), dokuları toplamak ve 1 mi sindirim tamponu 2 (DMEM F12 ekleme DNase I)). 1 ml pipet ti yardımıyla doku topağı 20 kez Askıyas.
    9. 5 ml serum barındırmayan tüm fare tüp epitel büyüme ortamı (M-TE-GM, Tablo 1) ekleyin.
    10. santrifüj hücreleri (600 RCF, 5 dakika, RT) toplayın. askıya alma ve hemasitometre hücreleri saymak, 1 ml M-TE-GM ekleyin. Tohum 1 x 10 5, 24, alçak bağlanma plakasında çukur başına 1 ml hücre ve 4 gün boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de M-TE-GM inkübe edin.
    11. Her gün orta değiştirin.
    12. Β-aktin EGFP ya da β-aktin-DsRed farelerden kültürlenen birincil süspansiyonu TE hücreleri tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması.
      1. 24-iyi düşük bağlanma plakaları TE süspansiyon kültürleri toplayın. 1 mi% 0.25 tripsin-EDTA ile santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ve askıya hücre peletleri. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin.
      2. 5 ml DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ekleyerek tripsin aktivitesi durdurun. Santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ile hücre pelletleri toplayın.
    13. Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C), 4 ml, hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. Buz üzerinde çalışarak, 10 ul PBS 1 x 10 5 hücre ekleyin, daha sonra 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak.
      Not: steril koşullar altında bir Biyogüvenlik kabini içinde tüm diseksiyon ve doku kültürü çalışmaları yapın.
  2. Ölümsüzleştirilmiş insan hücre hattı hazırlanması
    1. Ayrıca büyüme lentivirüs EGFP ve -mCherry etiketli insan immortalize over yüzey epitel hücresi lineHIO118 80 kadar - bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 10 cm yemekler% 90 konfluansa.
    2. 10 ml PBS ile iki kez bulaşık yıkama, çanak başına 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 10 dakika inkübe edilir. 10 mi DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Toplamaksantrifüjle hücre topakları (600 RCF, 5 dakika, RT).
    3. Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C) 10 ml hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer.
    4. Buz üzerinde çalışarak, 1.0 x 10 6 Lenti mCherry etiketli hücreleri + 1.0 x 10 6 Lenti EGFP 10 ul PBS hücreleri etiketli ekleyin. 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak.
  3. Rahim Tüp hazırlanması
    1. 1.1.1-1.1.5 adımlarda açıklandığı gibi, 6- PBS içinde 8 haftalık bakire β-aktin-DsRed farelere ayrı ayrı rahim tüpleri teşrih. Bir diseksiyon mikroskobu altında PBS 200 ul damla içine tek rahim tüpleri aktarın. Yavaşça Mezosalpinksi, rahim tüp segmentleri destekleyen geniş ligament bir kısmını kaldırarak cımbız ve 28 gauge iğne yardımı ile rahim tüpleri uncoil. 2 bir damla tek kıvrıldığı rahim tüpleri yerleştirin00 ul buz gibi soğuk PBS alıcının yumurtalık yağ yastığı maruz kalan ve nakli için hazır kadar.

2. Yumurtalık Fat Pad Nakli

Not: Her hayvan cerrahisi arasındaki aletleri dezenfekte edin. Hazırlayın ve önceden tüm ekipmanı düzenlemek. Bu dalak önler olarak sağ over yağ yastığı dorsal transplantasyon tercihli vardır. Ancak, alıcılar hem yumurtalık yağ takviyesinde nakli olabilir.

  1. singeneik fareler veya birincil hücre alıcıları olarak ağır kombine immün yetmezlik (SCID / NCR) fareler kullanın. insan hücreleri gibi HIO118 hücreleri kullanımı Nod / SCID / gama (NTG) fareler veya SCID fareleri için.
  2. 0.15 ml / 10 g vücut ağırlığı dozunda 2,2,2-tribromoetanol tek bir intra-peritonal enjeksiyon, alıcı fare anestezisi. hayvan kaput, bir ısıtma pedi üzerinde hayvan koyun ve pedal refleks (ayak tutam) kaybı ile doğru anesthetization onaylayın. ise kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürünhayvan anestezi altında olduğunu. ameliyat sonrası ağrı tedavisi için 4 mg / g vücut ağırlığı dozunda analjezik Ketoprofen hayvan deri altına enjekte edilir.
    Not: Alternatif olarak, anestezi izofluran kullanımı. indüksiyon odasında hayvan koyun ve 0.8-1.5 L / dk ve% 2-3 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlayın. , Odasından anestezi hayvan kaldırmak o zaman ameliyat başlatmak, bir maskeden izofluran nefes ve 0.4-0.8 L / dk ve% 1.5 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlamanızı sağlar.
  3. 40. makası ile cerrahi alan Tıraş; , Bir alandan 2 kez cerrahi alan saç kaldırmak% 70 etanol ve ardından povidon-iyot üç antiseptik scrubs ile traş cildi hazırlamak ve steril bir örtü ile kaplayın.
  4. Biyogüvenlik kabini içinde bulunan bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan taşımak. doğrudan yumurtalık yağ yastığı üzerinde dorsomedial pozisyonda bir kesi ile üreme yolu Açığa.
    Not: Critical adım: Hassas cilt kesi yara iyileşmesini kolaylaştırır, bir neşter kullanılması aşamasında 2.4 tavsiye edilir.
  5. Kullanarak künt ince forseps sinirler ve büyük kan damarları zarar minimize dikkatle orta çizgisine doğru kesikten yumurtalık yağ yastığı çekin.
    Kritik Adım: kanama oluşursa, ameliyat durdurmak ve farklı bir konak hayvana nakli düşünün.
  6. 28 ayar eğimli iğne yardımı ile diseksiyon mikroskobu kontrolü altında yumurtalık yağ yastığı içine 2-4 mm derinliğinde kesi, yumurtalık üzerinde 3-4 mm yapmak.
    Kritik adım: kesi sadece yağ yastığı yarısı geçer emin olun; alt tarafa tüm yol boyunca delme sızıntı olur. hızlı olun ve bu aşamadan sonra gecikmeden devam edin.
  7. hücre nakli için, hücre bazal membran matris karışımı 10-20 ul bir şırınga (30 iğne) doldurmak ve yağ yastığı kesi içine enjekte edilir. rahim tüp nakli için, rahim tüp zekâ pick uph ince forseps ve 10 yer - 20 ul bazal membran matrisinin buz üzerinde tutulmalıdır. Bir 0.1-10 / 20 ul kullanarak XL (3 mm kısaltılmış) filtre ucu doku ve taban membran matris süspansiyonu pick up ve yağ yastığı kesi içine bırakın mezun oldu.
  8. bazal membran matris kuvvetlendirmek ve geri periton içine üreme yolu yerleştirmek için 5 dakika bekleyin. 2 cerrahi sütür stiches ve iki küçük yara klipleri veya cerrahi sütür ile deri ile kasların kapatın.
  9. Tekrarlayın kontrol olarak görev yapacak hayvan kontra yanal yağ yastığı içine PBS-bazal membran matris karışımı nakli 2.4-2.8 adımları tekrarlayın.
    Kritik adım: ısı kaybı anestezi farelerde hızlıdır çünkü Ameliyattan sonra bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin.
  10. Hayvan yerli kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde kurtarmak ve anestezi tamamen uyanık kadar hayvan inceleyelim. o sterna korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınl recumbence. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
  11. Ameliyat sonrası kafese yiyecek kuru ek olarak kafes içinde ön-ıslak gıda pelet bir avuç koyun. Önümüzdeki birkaç gün için gerekirse ameliyat sonrası analjezik uygulayın ve günlük yara inceleyin. yara enfeksiyonu oluşursa onaylı hayvan protokole göre antibiyotik uygulayın. Yara tamamen kapalı olduğunda ameliyat sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın.

3. Histoloji ve Image Acquisition

  1. Greft Toplanması ve Korunması
    1. 4 mi 10x PBS ve 10 ml% 16 paraformaldehit çözeltisi ile 26 ml GKD 2 O karıştırılarak% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın.
    2. Bir blok aşılanan yumurtalık yumurtalık yağ yastığı, uterin tüp, 1.1.1-1.1.4 adımda tarif edildiği gibi, 0.5 cm rahim teşrih. Hemen 2 mi% 4 paraformaldehid içinde yer ve oda sıcaklığında, 2 saat süre ile düzeltin. Aynı hayvandan olmayan engrafted teşrihBir kontrol olarak PBS-bazal membran matris karışımı ile nakledilen kontralateral over yağ yastığı sistemi (adım 2.9 bakınız). Düzeltmek ve aynı şekilde işlem.
    3. sabitleme yıkamadan sonra, 5 dakika boyunca PBS ile üç kere, doku ve 4 ° C de PBS içinde bir gece boyunca inkübe edilir.
    4. yumurtalık yağ yastığı tüm montaj görüntüleme için 3.2.1 adıma geçin.
      Not: görüntü alma dokular dondurulmuş olabilir sonra (3.3.1) ya da parafine (3.3.2) için işlenmiş. 4 ° C'de PBS içinde% 30 sukroz içinde bir gece inkübasyon donmuş dokular kalitesini artırır.
  2. Görüntü edinme
    1. Bir floresan eki, renkli kamera ve Plan ile donatılmış 4, 10x hedefleri ve stereomikroskopta, epi-floresan eki ve yüksek çözünürlüklü renkli kamera ile donatılmış PBS dolu yemekleri ve ters bir mikroskop kullanılarak görüntüde yumurtalık yağ yastığı sistemleri-bütün montaj yerleştirebilirsiniz apo 1xWD70, ED Planı 1.5xWD45 hedefleri.
  3. histoloji
    1. Takip etmetüm montaj görüntü toplama (3.2.1) Laboratuvar film ve forseps kullanarak bir 2 x 1 cm parçası üzerinde dondurulmuş doku örnekleri için orta gömme bir 200-500 ul damla yerleştirin damlasına kadar doku aktarın. bir kenarda filmi Pick up ve 1.8 ml kriyojenik flakon doku orta damla aktarın. şişeyi kapatın ve sıvı azot içine dalma. -80 ° C'de donmuş dokular saklayın.
    2. Alternatif olarak, standart parafine devam edin. Her adım için doku hacminin 20-40 hacimleri kullanın.
      1. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 65 etanol içerisinde dokuların bırakın.
      2. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 70 etanol içinde dokuların bırakın. Bu aşamada örnekler oda sıcaklığında ay depolanabilir.
      3. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 90 etanol içerisinde dokuların bırakın.
      4. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 95 etanol içinde dokuların bırakın.
      5. Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca iki kez mutlak etanol (200 proof) içinde dokuların bırakın.
      6. RT'de hafifçe sallayarak, 30 dakika boyunca kloroform iki kez dokuları daldırın.
      7. 58 ° C 'de yavaşça çalkalanarak 30 dakika için parafin içine bir kez dokuları bırakın.
      8. 58 ° C 'de yavaşça çalkalanarak 12 saat için parafin içine bir kez dokuları bırakın.
      9. 58 ° C 'de, 3 saat parafin kez dokuları bırakın.
      10. Metal histoloji kalıplarında dokuları koyun ve 58 ° C parafin ile kalıpları doldurun. parafin üstüne plastik bir histoloji kaseti ekleyin ve + 4 ° C'ye kadar parafin soğutmak. Oda sıcaklığında parafin doku blok ve mağaza ayıklayın.
        Not: Parafin sıcaklığı immünohistokimyasal için uygun dokuda optimal korunması için 58 ° C'yi geçmemelidir.
    3. Alternatif olarak, Örnek İşleme Jel ile Parafin Gömme hazırlanın.
      1. PBS aspire ve% 70 etanol ile tüm montaj dokuları aktarın. 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. bir su banyosu içinde, ön-ısıtma numune, 60 ° C'ye jel işlem.
      2. Pipette laboratuar film kaplı Petri kabı üzerine numune işleme jel 200 ul. Kullanarak ince diseksiyon forseps numune işleme jel düşmesi tüm montaj doku sistemini aktarmak.
      3. örnek işleme jel yatağından oda sıcaklığında katılaşan, ya da 4 ° C 'de 10 dakika süre ile fiş katılaşmasına izin verin.
      4. biyopsi köpük pedler arasına sıkıştırılan histoloji doku kasetlerde örnek işleme jel gömülü doku yerleştirin. adımlarda 3.3.2-3.3.2.10 gibi parafin gömün.
        Not: Numune işleme jel gömme kaybını önler ve küçük kırılgan doku örneklerinin korunmasını sağlar.
        Not: dondurma ya da parafine korunmuş dokular immünohistokimyasal 14,15 için uygundur.

Sonuçlar

Deneysel hücreler ve dokular doğru bir diseksiyon mikroskobu (Şekil 1) altında yumurtalık yağ yastığı içine transplante edilebilir. Örnekler her yerde görülen EGFP (Şekil 2A) ya da DsRed (Şekil 2B) ve HIO118 16,17 hücreleri MCherry ve EGFP lentivirüs ile işaretlenmiş insan immortalize over yüzey epitel hücrelerinin (F - Şekil 2C) eksprese eden farelerden türetilen birincil fare tüp epitel hücrelerini içerir. Yaklaşım, aynı zamanda, fare uterus borusu (Şekil 3) gibi organların, uzun süreli nakli için geçerlidir. Immünohistokimyasal boyanma göre, her iki kirpikli (FOXJ1 pozitif 14) ve salgı (PAX8 pozitif 15) hücreleri nakledilen dokuların (Şekil 3B ve E) tuba epiteli korunur.

figure-results-1
Şekil 1:. Transplantasyonu (ok) Yumurtalık Yağ Pad Nakli (A) Exposed alan. (B) Bir kesi 28 G iğne (ok) tarafından yapılır. Pipet (ok) (C) UT / bazal membran matris karışımı aşılanmasına. (D) UT engrafted (ok, parlak kırmızı, β-aktin-DsRed farelerin UT). FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2:. Nakledilen Fare İlköğretim Tüp Epitel Hücreleri ve İnsan Algılama ölümsüzleştirdi Yumurtalık Yüzey Epitel Hücreleri (A, B) Out birincil fare tüp epitel hücrelerinin 8 gün singeneik fare transplantasyon sonrası (A, yeşil) ve β-aktin-DsRed (B, kırmızı) β-aktin EGFP farelerin (oklar) büyümeleri. (C, D), 10 gün NTG farelere transplantasyonu sonrası Lenti-EGFP (yeşil) veya Lenti mCherry (kırmızı) ile ya etiketli karışık HIO118 hücrelerinin (oklar) Engraftments. (D) (C, ok) Genişletilmiş alan. (E, F) Greft SCID fare (oklar) D, 43 gün C ile aynı hücre naklinden sonra geliştirdi. AD, F, floresan; E, parlak bir alan, FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A, B, DF) Ölçek çubuğu = 500 mikron; (C) Ölçek çubuğu = 1.600 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

reklam / 54444 / 54444fig3.jpg "/>
Şekil 3: Uterus Tüp nakli Karakterizasyonu. (A) β-aktin-DsRed fare 6 gün yumurtalık yağ yastığı içine naklinden sonra tam rahim tüp (ok) (ok, parlak kırmızı). (B) (a) 'da gösterilen transplant yağ yastığı Floresan frozen. Kırmızı, DsRed; Mavi, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer counterstaining. (C) Rahim tüp greft (ok) NSG alıcı fare (ok) içine nakli sonrası 40 gün. Parafin bölümü. Doğru tüm ilke rahim tüp bileşenlerinin korunması ve transplantasyon ilişkili fibrozis ve inflamasyon olmayışına dikkat edin. Hematoksilen ve eozin boyama. (D, E) Algılama tuba epiteli işaretçileri Eşli kutu geni 8 (PAX8) ve Forkhead kutusunun J1 ve (FOXJ1 kahverengi nükleer renk, ok başları) gösterilen greft (oklar) hücrelerinde ( C). Immünoperoksidaz sistemi. metil yeşili ile karşıt. FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A) Ölçek çubuğu = 1,000 mikron; (B) Ölçek çubuğu = 200 mikron; (CE) Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bileşen 1x DMEM F12 (Ham'ın) orta
L-Glutamin 2 mM
Sodyum pruvate 1 mM
Epidermal büyüme faktörü 10 ng ml -1
Temel fibroblast büyüme faktörü-2 10 ng ml -1
hidrokortizon 500 ng mL -1
ensülin 5 ug mi -1
Transferrin 5 ug mi -1
sodyum selenit 5 ng ml -1
sığır albümini % 0.10
Penisilin / Streptomisin 100 birim mi -1/100 ug mi -1
Minimum gerekli ortam (MEM) temel olmayan amino asitler, 0.1 mM
Beta-merkaptoetanol 10 -4 M

Tablo 1:. Fare Tüp Epithelim Gelişim Ortamı (M-TE-GM) Bileşenler sol sütununda sıralanan 1x DMEM F12 belirtilen konsantrasyonlarda (Ham) orta, sağ sütunda çözündürülür. Nihai orta kompozisyon serbest serum olduğunu.

Tartışma

Epitel hücrelerin ve dokuların doğru teslimat saptanmasına izin verir, bir yumurtalık yağ yastığı nakli deneyi kurduk. Yumurtalık yağ yastığı tahlil nakli prosedürü daha az teknik açıdan zor intrabursal enjeksiyon 10-12 daha ve daha düzgün ve intraperitoneal enjeksiyon 9 ile karşılaştırıldığında nakledilen hücrelerin tam yerini sağlar. Aynı zamanda, iyi bir rahim tüp gibi bir organ, uzun süreli nakli için uygundur.

Önemlisi, yumurtalık yağ yastığı kadın üreme sisteminin epitel için tanıdık bir mikro sağlar. Bu rejenerasyon ve habis dönüşüm sırasında insan ve fare yumurtalık ve tubal epitel hücrelerinin moleküler ve hücresel çalışmalar için özellikle uygun olacaktır. Diğer organlarda aksine, çok az çalışma dişi r epitelde tanımlanması ve kök hücrelerin karakterizasyonuna odaklanmıştıreproductive yolu 18,19. Birçok kanser yetişkin kök hücrelerin 20 kaynaklandığı düşünülmektedir, çünkü bu tür çalışmalar büyük önem taşımaktadır. Epitelyal over kanserlerinin henüz hücresel kökenleri 18 derece tartışmalı kalır. Epitelyal over kanserleri, yumurtalık kanserlerinin çoğunluğu için hesap ve ABD'de 21 kadın tüm kanser bağlı ölümlerin arasında 5. sırada yer almaktadır. Mevcut transplantasyon teknikleri 9-12 üzerinde çeşitli avantajları ile ortotopik tahlil Böylece gelişme büyük ölçüde bu alandaki çalışmaları kolaylaştıracaktır.

yumurtalık yağ yastığı yüzeysel konumu göz önüne alındığında, küçük hayvan görüntüleme sistemleri güçlü floresan veya bioluminescent gazetecilere ile etiketlenmiş engraftments takip etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu doğrusal olmayan mikroskopi 22 minimal invaziv yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme deneyleri, kurulması mümkün olmalıdır. yumurtalık yağ yastığı da organ kültürleri tutulabilir, böylece izinyakından hücrelerin organizasyonu ve hücre dışı matriks yansıtan koşullar altında normal ve neoplastik epitel üç boyutlu kültür ing. Gelecekteki çalışmalar bu umut verici olanakları ele almalıdır.

Birkaç kritik adımlar dikkate alınmalıdır. bir ısıtma yastığı sağlanması ve ameliyat sırasında sıcak kemirgenleri tutarak büyük ölçüde hayatta kalma oranını artırır. yağ yastığı taşıma araçlarının Sterilite engrafted sistemler steril tutulmasını sağlar. Bizim deneyim, nakli büyüme geriliği önemli kanama sonuçlarında. Önemlisi, yağ yastığı kesi kesin yapılmalıdır yağ yastığı yırtılma veya kanama nedenleri aracılığıyla delinmesiyle çünkü. Koagülantlar gerekli kanamayı durdurmak için kullanılmalıdır. gelişmez engraftments takdirde, enjekte edilen hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu dikkate alınmalıdır. İlk başarılı çıkıntılar transplantasyon sonrası bir hafta kadar erken gözlenen ve en görünür biri olmalıdır engraftments edilebilirİşlemden sonra ay. nakli için, daha büyük bir çapa (23-25 ​​G) iğneler (çapı 10 um) üzerinden büyük hücreler kesme önlemek için de kullanılabilir. Ancak, bu tür iğneler yağ yastığı daha travmatik olabilir ve bunların kullanımı önceden test edilmelidir. Deneyler için biz 6 ila 8 hafta eski donör ve alıcı fareler kullanılmıştır. her iki amaç için daha küçük veya daha büyük farenin kullanılabilir. Bununla birlikte, enjekte edilen hücrelerin sayısı ayarlanması gerekebilir. genç vericilerden over yağ yastıkları küçük boyutta da dikkate alınması gerekir.

herhangi bir yöntem olduğu gibi, fare yumurtalık yağ yastığı nakli testinin bazı sınırlamalar vardır. singeneik immüno-kompetan farelerde kemirgen birincil hücreler / dokular için kullanılabilecek olsa da, bizim teknik NTG veya insan malzemenin nakli için SCID fareleri gerektirir. Insan epitelyum hücrelerinin gelişimini desteklemek için yağ yastığı humanize mümkün muhtemeldir. Ancak, henüz bu yaklaşımı test değil. Genç fe Kullanımıerkekler daha düşük üreme maliyetleri yol açabilir; Bununla birlikte, yetişkin bakire dişi fareler (8 ila 10 haftalık) ve böylece daha büyük bir örneklerin nakli sağlayan daha büyük bir yağ yastığı bulunmaktadır. Son olarak, laboratuvar personeli prosedürün zamanında ve başarılı bir şekilde yürütülmesini sağlamak, hayvan cerrahisi konusunda eğitilmelidir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biz insan hücrelerini HIO118 sağlamak için, Dr. Andrew K. Godwin, Kansas Tıp Merkezi Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum. (; T028095 NYSTEM) Çocuk Sağlığı ve AFN İnsan Gelişimi (P50HD076210) Sağlık / National Institute National Institutes ve NYSTEM (C028125, C024174 ve hibe tarafından bu çalışmalar New York Kök Hücre Programı hibe ile desteklenmiştir T028095), Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü (CA182413) ve Ayn için Yumurtalık Kanseri Araştırma Fonu (327516) National Institutes of.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
25 gauge iğneBD Becton Dickinson305122
28 gauge iğne (ekli iğne ile hipodermik şırınga)Kendall30339Parça Numarası: 8881500014
temel fibroblast büyüme faktörü-2Sigma-AldrichF9786
bazal membran matrisi (Geltrex)InvitrogenA1413202
β-actin-DsRed farelerJackson Laboratuvarı6051B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-aktin-EGFP fareleriJackson Laboratuvarı3291C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM7522
sığır albüminiSigma-AldrichA3311
kloroformVWREM-CX1058-1
kollajenaz/hyaluronidazKök Hücre Teknolojiler7912
kriyojenik şişelerThermo Scientific Nunc377267
dispase IIWorthingtonNPRO2
DMEM F12 (HAM's)Corning10-092-CV
DNaseI (Deoksiribonükleaz I)Kök Hücre Teknolojileri7900
donmuş doku örnekleri için gömme ortamı (OCT)Sakura Finetek 4583
epidermal büyüme faktörüSigma-AldrichE4127
etanol 200 geçirmezKoptecV1001% 70 
fetal sığır serumuSigmaF4135
filtre ucu 0.1-10 / 20 &mikro; l XL ABD Bilimsel1120-3810
FOXJ1 antikorueBioscienceE10109-1632konsantrasyonda kullanılır 1: 1.000 (maskeleme yok)
hidrokortizonSigmaH0135
KetoprofenZoetis4396H
laboratuvar filmi (Parafilm M)Amerikan Ulusal CanPM-999
L-GlutaminCorning25-005-Cl
insülin-transferin-sodyum selenitSigma-AldrichI884
izofluran, 250 mlSanta Cruz Hayvan Sağlığısc-363629Rx
düşük bağlantı plakası 24 kuyuluCostar3473
MEM esansiyel olmayan amino asitlerCorning25-025-Cl
metal histoloji kalıplarıElektron Mikroskobu Bilimleri62527-22
mikroskop, ters çevrilmişNikonEclipse TS 100
mikroskop, stereoNikonSMZ800
Nod/SCID/gama (NSG) farelerJackson Laboratuvarı05557NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
paraformaldehit %16 çözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri15710
parafin (Paraplast, X-TRA)Fisher Thermo Scientific23-021-401
PAX8 antikoruProteintech10336-1-AP1:1,000 konsantrasyonda kullanılır (maskeleme yok)
PBS (Fosfat Tamponlu Salin)Corning  21-030-CV
penisilin streptomisinCorning30-002-Cl
şiddetli kombine immün yetmezlik (SCID/NCr) fareleri, BALB/C arka planı)NCI-Frederick Hayvan Üretim Programı01S11
sodyum piruvatCorning25-000-Cl
numune işleme jeli (HISTOGEL)Richard-Allan ScientificHG-4000-012
sükrozSigma-AldrichS0389
Tripsin-EDTA,% 25Corning25-053-Cl

Kaynaklar

  1. Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
  2. Proia, D. A., Kuperwasser, C. Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model. Nature protocols. 1, 206-214 (2006).
  3. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
  4. Stingl, J., Caldas, C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).
  5. Koren, S., et al. PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525, 114-118 (2015).
  6. Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -P., Roy-Burman, P. Prostate stem cells and cancer in animals. Stem Cells and Cancer. Bagley, R. G., Teicher, B. A. , Humana Press. New York, NY. 199-216 (2009).
  7. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, 324-338 (2015).
  8. Lu, C. P., et al. Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair. Cell. 150, 136-150 (2012).
  9. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  10. Orsulic, S., et al. Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system. Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).
  11. Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice. Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).
  12. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  13. Albihn, A., et al. Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice. Reproduction. 125, 855-863 (2003).
  14. Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia. Genesis. 52, 350-358 (2014).
  15. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).
  16. Capo-Chichi, C. D., et al. Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis. Cancer. 95, 1802-1815 (2002).
  17. Roland, I. H., et al. Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies. Cancer. 98, 2607-2623 (2003).
  18. Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers. Mol Cell Oncol. 1, 963435(2014).
  19. Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).
  20. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469, 314-322 (2011).
  21. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  22. Williams, R. M., et al. Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy. Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ortotopik TransplantasyonUterin T p TransplantasyonuH cre TransplantasyonuFloresan G r nt lemeBazal Membran MatrisiCerrahi nsizyonDoku GreftlemesiUzun S reli KorumaDi i reme Kanal
Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.