Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Summary

Burada, biz kemostat kültür kullanarak koşullar altında mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimini elde etmek için bir protokol mevcut. Ayrıca, gelişmiş soyunun genomik analiz tartışılmıştır.

Abstract

Doğal evrim, çevresel değişim ve küçük popülasyonlar arasındaki bir seçim gibi genetik çeşitliliği içerir. Uyarlanabilir laboratuvar evrimi (ALE), kontrollü koşullar ve stres faktörleri altında canlı organizmalar kullanılarak evrimin gözlemlendiği deneysel durumu ifade eder; Organizmalar böylece yapay olarak evrimsel değişiklikler yapmaya zorlanır. Mikroorganizmalar çevrede çeşitli stres faktörlerine maruz kalırlar ve hayatta kalma şanslarını artırmak için strese bağlı belirli proteinleri düzenleyebilirler. Doğal olarak meydana gelen spontan mutasyonlar, bir mikroorganizmanın genomunda hayatta kalma şansını etkileyen değişikliklere neden olur. Kemostat kültürüne uzun süreli maruz kalma, spontan mutasyonların birikmesine neden olur ve en uyarlanabilir suşu baskın hale getirir. Koloni transferi ve seri transfer yöntemleriyle karşılaştırıldığında, kemostat kültürü en yüksek sayıda hücre bölünmesini ve dolayısıyla en yüksek sayıda farklı popülasyonu gerektirir. ALE için kemostat kültürü daha karmaşık kültür cihazları gerektirse de, işlem başladıktan sonra daha az emek yoğundur. Uyarlanmış suşun karşılaştırmalı genomik ve transkriptom analizleri, stresörlerin stresin üstesinden gelen mutasyonlara nasıl katkıda bulunduğuna dair evrimsel ipuçları sağlar. Bu makalenin amacı, kontrollü laboratuvar koşulları altında mikroorganizmaların hızlandırılmış evrimini sağlamaktır.

Introduction

Mikroorganizmalar hayatta ve çeşitli ortamlara uyum sağlayabilir. Ağır stres altında, adaptasyon rastgele genomik mutasyonların ve sonraki pozitif seleksiyon ^1-3 yararlı fenotip kazanması ile ortaya çıkabilir. Bu nedenle, mikrobiyal hücreler "adaptif evrim" olarak adlandırılır optimum büyüme için metabolik veya düzenleyici ağları değiştirerek uyum sağlayabilir. Bu tür süpermikroplar salgınları ve sağlam mikrobiyal suşların ortaya çıkması gibi yeni önemli mikrobiyal eğilimler, çok yakından stresli koşullar altında evrimi uyarlamalı ilişkilidir. tanımlanan laboratuvar koşullarında, moleküler evrim mekanizmaları incelemek ve hatta çeşitli uygulamalar için mikrobik evrimin yönünü kontrol edebiliyoruz. onlar büyük nüfusları korumak, hızlı bir şekilde yeniden ve oluşturmak ve Hom bakımı kolaydır: Çok hücreli organizmalardan farklı, tek hücreli canlılar aşağıdaki nedenlerden ötürü adaptif laboratuvar evrim (ALE) için uygundurogeneous ortamlar. DNA dizileme teknikleri ve yüksek verimli teknolojilerindeki son gelişmeler ile birlikte, ALE sistemik düzenleyici değişikliklere yol genomik değişikliklerin doğrudan gözlem sağlar. Mutasyon dinamikleri ve nüfus çeşitliliği de gözlemlenebilir. Genetik mühendisliği yöntemi ALE suşlarının ^4,5 analizinden belirlenebilir.

Kemostat kültür kararlı durum hücreleri elde etmek ve fermantasyon süreçleri ⁶ verimliliği artırmak için kullanılan bir yöntemdir. Taze ortam ilave edilir ve kültür sıvısı işlemi (ikinci orta ve biyokütle içerir) içinde toplanır. Uzun vadeli kemostat kültürü Bununla birlikte, kültürün kararlı durum verimliliği değiştirir ve kültür (Şekil 1a) sırasında spontan mutasyon ve seleksiyon birikimi getiriyor. Çeşitli seçim basınçlarında (stres) altında, mutasyonların birikimi artar. Uzun vadede stres kademeli bir artış kemostat tekrarlanan sıvı bir ortamda bir katı ortam ve seri transferi (arasında, sıcaklık, pH, ozmotik basıncı, besin açlık, oksidasyon, toksik son ürün, vb Koloni transferi verilen stres karşı çalışma mutasyonlar, sürekli bir seçim sağlar küme kültür), araştırmacılara gelişti mikroorganizmaları (Şekil 1B ve 1C) elde edilmesine olanak sağlamaktadır. kemostat kültür karmaşık yöntemler gerektirmesine rağmen, çeşitlilik havuzu (tekrarlamalı ve nüfus büyüklüğü sayısı) koloni transfer ve seri transfer teknikleri ile elde edilenden daha yüksektir. tek tek hücrelerin kararlı stres maruziyeti ve kemostat kültürü (sabit durum) toplu kültür temelli tekniklerle karşılaştırıldığında ALE diğer faydaları şunlardır sırasında hücresel devlet varyasyon azalmıştır. Yüksek süksinat koşullara tabi Escherichia coli strese bağlı ALE Bu makalede tanıtıldı.

iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Şekil 1: adaptif laboratuvar evrim Yöntemleri (A) Kemostat;. (B) Seri transferi; (C) koloni transferi. Üst rakamlar ALE yöntemleri kavramını göstermek ve alt rakamlar ALE sırasında büyüyen hücrelerin sayısını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protocol

1. Ekipman Hazırlığı

1. Bir kemostat küp (150-250 mi) ya da bir giriş noktası ihtiva eden bir bir Erlenmeyer şişesi (250 mi) ve bir çıkış portuna elde edin. silikon boru 10-100 ml / saat akış hızları için izin ile bağlantı noktalarını bağlayın. İsteğe bağlı olarak, bir hava deliği, bir hava çıkış ağzı, ve sıcaklık kontrollü su giriş ve çıkış bağlantı noktaları kullanımı.
2. ajitasyon ve ısı kontrolü sağlayan kemostat kavanoz için uygun olan bir cihaz elde edilir (veya bir döner çalkalama inkübatöründe kullanın).
3. kültür taze orta teslim ve toplamak için iki peristaltik pompa edinin.
4. orta çıkış deliği ve bir hava giriş ağzı ihtiva eden bir hazne kavanoz (10-20 L) elde edilir.
5. (L / S 13 boru Yani, ID, 0.8 mm, akış aralığı 0,06-36 ml / dak) seyrelme oranı için uygun silikon boru elde edilir.

2. Orta Hazırlama ve Sterilizasyon

1. ilk Orta
   1. 0.3 gr glikoz, 0.08 g _NH4 çözülürCI, 0.05 g NaCl, 0.75 g Na ₂ HPO ₄ · 2H _2, O, ve 0.3 g KH ₂ PO ₄ 90 ml damıtılmış su, kemostat kavanoza (DW).
   2. kelepçeler kullanılarak boru ile birlikte kemostat kavanoz mühür. havalandırma deliğini mühür yok.
   3. 15 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav içinde kemostat kavanoz sterilize edin. Sterilizasyon sonrasında, oda sıcaklığında kemostat kavanoz saklayın.
   4. Çözülür 0.02 gr MgSO ₄ · 7H _2, O, 0.01 g _CaCl2 ve 10 mi DW (A çözeltisi) içinde 0.1 mg tiamin.
   5. bir şırınga ve bir önceden sterilize edilmiş şırınga filtresi (0.45 mikron gözenek filtresi) ile filtre solüsyonu için uygun değildir.
   6. Bir kemostat kavanoza süzüntüler çözüm ekleyin.
2. stres Orta
   1. 30 g glukoz, 8 g _NH4CI, 5 g NaCl, 75 g ₂ Na HPO ₄ · çözülür 2H _2, O, 30 g KH ₂ PO ₄ ve 300 g disodyum süksinat heksahidrat _(Na2 · süksinat · 6H _{2 O; Bir rezervuar kavanoza 9.9 L DW bu deneyde kullanılan stres).}
   2. kelepçeler kullanılarak boru ile birlikte rezervuar kavanoz mühür. havalandırma deliğini mühür yok.
   3. 15 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav içinde, rezervuar kavanoz sterilize edin. Sterilizasyon sonrasında, oda sıcaklığında kavanoz saklayın.
   4. 2 g MgSO ₄ · 7H _2, O, 1 g _CaCl2, ve 100 ml DW (A çözeltisi) içinde 10 mg tiamin çözülür.
   5. bir şırınga ve bir ön-sterilize edilmiş şırınga filtresinden (0.45 mikron gözenek filtresi) ile filtre solüsyonu için uygun değildir.
   6. Bir rezervuar kavanoza süzüntüler solüsyonu ekleyin.
   7. Aseptik rezervuar kavanoza sterilize silikon tüp bağlamak ve peristaltik pompalar takın.
3. Yüksek stres Orta
   1. Bölüm 2.2 gibi orta hazırlayın, ama stresörün büyük bir konsantrasyon ile (yani, süksinat adaptasyon 3-5 g / L daha yüksek).
      Not: Bu protokol bir stres inci adaptasyon içinde orta yoluyla teslim edilebilir. sıcaklık, ajitasyon ya da aydınlatma gibi fiziksel stres durumunda, kültür buna göre tasarlanmış olmalıdır.

3. İlk Yetiştirme

1. Yabani tip E. tek bir koloni İnokülasyon Başlangıç ​​ortamı 4 ml içeren 15 ml'lik deney tüpünde coli.
2. 37 ° C'de 12 saat ve 220 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesinde test tüpünü inkübe edin.
3. Aseptik olarak transferi kemostat kavanoza ön kültür 1 ml.
4. 6 saat boyunca 37 ° C 'de, havalandırma (hava 50 ml / dakika) ve karıştırılarak (200 rpm) sağlayan, kemostat kavanoz inkübe edin.

4. Stres Adaptasyon

1. Aseptik kemostat kavanoza pompalardan silikon hortumun ucunu.
2. çıkış pompası (10 ml / saat veya daha yüksek) başlatın ve kültür toplamak.
   Not: Kültür tipik olarak 4-8 ​​saat, ilk yetiştirme sonrasında, üslü fazda olması gerekir.
3. Chçıkış borusundan kültürün optik yoğunluğu (600 nm) eck.
4. Giriş pompası (0.1 saat ^-1 sulandırma bir orana karşı gelen 10 ml / sa,) başlatın.
5. her 24 saatte tüp çıkışından 600 nm'de kültür optik yoğunluk kontrol edin.
6. 96 saat (9.6 kat ciro) ya da daha fazla kemostat çalıştırın. optik yoğunluk stabil ise, yüksek stres ortamı içeren rezervuar alışverişi. Optik yoğunluk 0.2 düşükse, 6 saat boyunca besleme giriş pompayı durdurun. giriş pompasını yeniden başlatın ve optik yoğunluk 0.2 üzerinde olup olmadığını kontrol edin.
7. Yavaş yavaş daha yüksek stres konsantrasyonunu ihtiva eden bir rezervuara değiştirerek stres konsantrasyonunu artırır.
8. O bir dönüm noktası ulaştığında adapte kültür örnekleri almak (örneğin, 100 g / L süksinat strese adapte suş) ileri genomik analiz için, ve mağaza.
9. Örnek depolama için, steril bir% 80 gliserol soluti kültür numunesi (0.5 mL) karışımıilgili (0.5 mi) ve -80 ° C'de saklayın.
   Not: Mikroorganizma ALE sürecinde stres aşağılamak için bir yeteneği edinirse, fermantasyon kavanoz stres konsantrasyonu taze haznesinde aynı değildir.

Stres adapte Uzama 5. Tek koloni izolasyonu

1. Agar plaka orta (% 1.6 ağar) aynı stres içeren ve ortamın aynı konsantrasyonda hazırlayın.
2. kemostat gelen çıkış kültür (0.1 mi) plaka ve 16 saat 37 ° C'de inkübe edin.
3. Steril kürdan ile plaka, tek koloniler aynı stres ihtiva eden 15 ml'lik deney tüpleri ve kemostat aynı ortam konsantrasyonunda bunları inoküle ve 6 saat inkübe edilir.
4. Transfer ortamı 50 ml içeren 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde bulundukları kültür çorbasından 1 mi. Hasat kültür sıvısının 0.5 ml her 1 saat ve 600 nm'de OD'yi ölçün. adapte strai büyüme hızını karşılaştırmakstres verilen yabani tip suşu edilene n.

Results

Yüksek süksinat stres adaptasyonu için, vahşi tip E. coli W3110 suşu D bir kemostat kültürlenmiştir = 0.1 saat ^-1 270 gün (Şekil 2).

Şekil 2: E. Yüksek süksinat stres adaptasyonu E. coli kemostat kültür kullanarak W3110. İnce oklar stresörün konsantrasyonu artmış edildiği kez gösterir ve kalın oklar kültürleri muhafaza edi...

Discussion

Mikroorganizmalar nedeniyle hızlı büyüme oranı ve genetik çeşitliliğin hemen hemen tüm ortamlarda uyum yeteneğine sahiptirler. Adaptif laboratuvar evrim verilen koşullar altında yararlıdır spontan mutasyon barındıran bireysel organizmaların seçerek bir yol sağlar tasarlanmış koşullar altında gelişmeye mikroorganizmaları sağlar.

kemostat tekniği aşağıdaki nedenlerle transfer teknikleri daha yapay tahrik evrimi elde etmek için daha sağlamdır, (a) sürekli bir ortam - transfer teknikleri, katı y...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini kemostat fermentörü	Biotron Inc.	-	Özel sipariş
silikon boru	Cole-Parmer	Masterflex L / S 13	boru boyutu, seyreltme hızına ve fermentör kavanozunun boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir.
rezervuar kavanozu	Bellco	Media saklama şişesi	20 L
kimyasallar	Sigma-Aldrich-reaktif		sınıfı
glikoz	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reaktifi
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	moleküler biyoloji için, hücre kültürü için uygun, vb; % 99.5
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reaktifi, ≥ % 99
Na < alt > 2 < / alt >HPO< alt >4 < / alt > ve orta nokta; 2H2O	Sigma-Aldrich	4272	%98.5-101
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reaktifi, & ge; % 99
MgSO 4 < / alt > ve orta nokta; 7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reaktifi, & ge; % 98
CaCl < alt > 2 < / sub>	Sigma-Aldrich	793639	ACS reaktifi, & ge; % 96
tiamin ve orta nokta; HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reaktif sınıfı, > % 99
Na < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; süksinat ve orta nokta; 6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, & ge; %99