Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

1-hücre embriyoların Sitoplazmik mikroenjeksiyon çok güçlü bir tekniktir. Bu, örneğin, gen fonksiyonu çalışma ya da gen düzenlenmiş hayvanlar oluşturmak için, gen, çıkıntılara üretilmesi için embriyo herhangi bir çözüm sunmak için de kullanılabilir. En tarımsal-ilgili çiftlik hayvanı zigot kendi sitoplazma opak ve ¹ karanlık kılan çok yüksek yağ asidi kompozisyonu var. Onlar da oldukça esnek plazma zarı (PM) var. Bu özellikler kemirgen türleri zorlu ve sık sık yanlış kullanılan geleneksel pronüklear / sitoplazmik enjeksiyon kullanılarak mikroenjeksiyon yapmak.

Sonuçlar, daha kolay olan ve aynı zamanda daha yüksek canlılığı ^2'de elde edilen, enjekte edilen embriyolar için daha az zarar yana Sitoplazmik mikroenjeksiyon pronükleer mikroenjeksiyon fazla avantajlara sahiptir. Bu protokolün genel amacı çiftlik hayvanı zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için başarılı bir yöntem ortaya koymaktır. yapabilmek içinBesi embriyoların yüksek verimle sitoplazmik mikroenjeksiyon, bir lazer, bir küt uç cam iğne mikroenjeksiyon için kullanılan zona pellucida (ZP) ve daha sonra bir delik oluşturmak için kullanılır. Bu strateji enjeksiyon sırasında embriyo üzerinde baskılı mekanik zararı azaltmayı hedefliyor. Sonra, enjeksiyon iğnesi içinde sitoplazmik içeriğin aspirasyon çözümü embriyo sitoplazmaya teslim edilmesini sağlamak PM verimli ve güvenli kırılmasına izin verir.

Bu teknik başarıyla zigotik sitoplazma ^3,4 içine siRNA teslim etmek ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarı (CRISPR) / CRISPR ilişkili sistem 9 (Cas9) sistemi ⁵ ile mutasyon üretmek için sığır embriyolarının kullanılmıştır. Ayrıca sığır cumulus-kapalı oosit ⁶ enjekte etmek (küçük değişikliklerle) uygundur. Burada, bir boya teslim eden enjeksiyon protokol açıklar, herhangi des enjekte uygulanabilir olabilirzigot içine IRED çözüm ve bu tekniği kullanarak en az erimesine yol açar ve erken embriyo gelişimini etkilemediğini göstermektedir.

Protocol

1. Mikropipet Üretimi enjeksiyon mikropipet borosilikat cam kapiller (: 1,0 mm, iç çapı (ID): dış çap (DÇ) 0.75 mm) koyun, bir mikropipet çektirmenin (sağ ve sol kılcal sahipleri merkezinde) ve kilitleyin. uzun uzantılar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir program kullanın. (Örnek: Isı: 825; çekin: 30; Hız: 120; Süresi: 200; Basınç: 500). Dikkatle cihazdan çekti pipetler kaldırmak ve yatay konumda bir microforge üzerine yerleştirin. çekti pipet ve odak noktası haline cam boncuk ile Microforge ısıtıcı iplik getir. İstenilen kalınlığı ölçümü ve ısıtıcı Filament hedef iç çapı (5 mikron) ulaşıncaya kadar yatay pipet taşımak için mercek reticle kullanın. yaklaşık% 45 ısı ayarlama ve filamanın dokunur şekilde hafifçe aşağı pipet getirmek. kısaca ısıtıcı etkinleştirin. Bu Whasta hafifçe filamanın yapışır, böylece pipet eritmek ve soğutma üzerine, pipet düz bir kesim üreten temas noktasında kıracak. Not: Çok yüksek sıcaklıklar pipet bend yapacak ve böylece düz bir kesim mümkün olmayacak ve çok düşük sıcaklıklarda pipet (Şekil 1A) eritmek için yeterli olmayacaktır çünkü uygun sıcaklık ayarı bu adımda anahtarıdır. Isıtıcı filament yaklaşık 10 mikron uzak konumlandırarak pipet yakın yaklaşık 30 ° açı yapar. % 60 sıcaklığını ayarlamak ve ısıtıcı etkinleştirin. Not: Bu filament üzerinde pipet viraj. Bu açı, enjektör (Şekil 1B) içine monte edildiğinde iğnenin ucu püskürtme plakasının yüzeyine paralel olacak şekilde tercih edilir. Bunlar son derece keskin ve kırılgan olduğu gibi dikkatli mikroenjeksiyon pipetler anlaştım. Holding mikropipet Bir borosilic yerleştirin(: 1,0 mm, ID: OD 0.75 mm) cam kapiller yedik (sağ ve sol kılcal sahiplerinin merkezinde) Mikropipet çektirmenin ve kilitleyin. uzun hatta konik ve paralel duvarlar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir programı kullanın (: Heat: Örnek 815; çekin: 20; Velocity: 140; Zaman: 175; Basınç: 200). Dikkatle çektirmenin cihazdan çekti pipet kaldırmak ve yatay konumda Microforge tutucu üzerine yerleştirin. Isıtıcı lif ve pipet üzerinde odağı ayarlayın. pipet çapını ölçmek ve filamanın üzerinde çapı 180 mikron ulaşıncaya kadar pipet taşımak için mercek reticle kullanın. Belirtilen boyutta bir elmas uç kalem ile cam kapiller işaretleyin ve sonra yavaşça camı kırmak için çekti ucunda basın. Bu, düz bir kesim (Şekil 1C) ile sonuçlanmalıdır. filaman yakın olan ucu ile dikey bir konuma pipet getirin. sıcaklığı ayarlayın % 60 microforge evi. Yangın lehçe o 40 mikron bir kimliği ulaşıncaya kadar standart teknikler 7 kullanarak pipet ucu. Kimliği (Şekil 1D) kontrol etmek için mercek reticle kullanın. pipet üzerinde bir açı yapar. yaklaşık 10 mikron uzaklıkta filamanın ve uzak ucu 5 mm geri yatay konuma pipet getirin. Yaklaşık% 60 sıcaklığını ayarlamak ve filamanın üzerinde pipet bend ısıtıcı etkinleştirin. (Yaklaşık 30 O) arzu edilen bir açı elde edilene kadar ısıtma devam edin. Açı görsel (Şekil 1E) kontrol edin. Not: Pipet, genellikle enjeksiyon tabağın tabanına göre 60 ° bir açı ile yaklaşık mikroenjektör monte edilir. onun orta düzleminde embriyo doğru enjeksiyon için gerekli olan çanak tabanına paralel şekilde pipet ucu bükülür. le "> 2. Mikromanipülatör Kurulumu mikroenjektörler tamamen yağ ile yüklü olduğundan ve sistemde hiçbir hava kabarcığı olduğunu (mikroenjektör kabarcıklar enjeksiyon ince kontrol edilmesini önlemek) kontrol edin. mikromanipülatörler orta konumda olduğundan emin olun. Bu pipetler geniş bir hareket aralığı sağlayacak. Sol mikromanipülatör tutucuya yerleştirin tutma pipet ve sağ mikromanipulasyon tutucu içine enjeksiyon pipet yerleştirin. Yağ kılcallık tarafından pipetler girmek ve sistem mikroenjektör kontrollerini kullanarak pipet içinde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yağı düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için izin verin. Not: iğne içinde yağ hiçbir hareket yoksa, bir yapışmasına neden olabilir. Bu durumda, yeni bir iğne kullanınız. görüş mikroskop alanının merkezi haline pipetler getirmek için mikromanipülatör denetimlerini kullanın. 4X büyütme kullanarak, mikropipet uçları (doğru açıda p olduğunu kontrol edinçanak alt) için arallel. Not: iğne Doğru kurulum başarılı bir enjeksiyon için ve sonuç tutarlılığı için anahtardır. Üreticinin kalibrasyon kılavuzuna aşağıdaki lazer sistemi kalibre edin. Enjeksiyon Dish 3. Hazırlama (Şekil 2) 100 mm petri kabı kapağının merkezine,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş ısıtıldı (37 ° C), SOF-HEPES (malzeme bölümünde ayrıntılı olarak bileşimin) içindeki bir 50 ul damla yerleştirin. solüsyonu 2 ul damla enjeksiyon damla yakın enjekte edilecek – 1 yerleştirin. embriyolar RT aşağıda soğumasını etmediğinden emin olun. Not: Bu protokolde enjeksiyon siteyi görselleştirmek ve daha sonra takip edebilmek için enjekte çözüm Dekstran-Kırmızı boya katacak. mineral yağ, yaklaşık 10 ml kullanılarak enjeksiyon plaka damla örtün. ters mikroskop aşamasında enjeksiyon çanak yerleştirin ve pip getirmekEnjeksiyon damla içine ettes. iğneler damla içindeki odak olup olmadığını kontrol edin. mikromanipülatör denetimlerini kullanarak gerektiği gibi kendi yüksekliğini ayarlayın. Enjeksiyon damla üst tarafında – (20 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 17) 30 zigot – Bir microdispenser kullanarak, yaklaşık 20 yükleyin. Enjeksiyon damla embriyo sayısı kişi bunları enjekte etme hızı tarafından belirlenmektedir, ki böylece, oda sıcaklığında enjeksiyon gerçekleştirin. 30 dakika içinde enjekte edilebilir olanlarına göre daha fazla embriyolar yüklemeyin. microdispenser içine embriyolar yüklemek için, tam pistonu bastırın ve embriyoları içeren çözelti içine ucu batırın. Dokunmatik embriyolar cam kapiller ucu (seferde bir) ile aldı ve yavaş yavaş piston böylece her embriyo kılcal girer serbest olması. tüm embriyolar toplanır veya microdispenser kapasitesi dolana kadar bu işlemi tekrarlayın. Yüklenen embriyolar serbest tüm hacim co kadar pistonu hafifçe bastırmak içinembriyolar ntaining kılcal salınır. 4. Mikroenjeksiyon 4X objektif kullanarak, negatif basınç (emme) uygulanarak enjeksiyon pipetine enjekte edilecek çözelti yüklenir. 3 zigot – 2 enjekte etmek yeterli bir çözüm yükleyin. Sonra enjeksiyon damlasına kadar hareket ettirin. ucu bir zigot yakın alır bu yüzden enjeksiyon damla içinde holding pipet hareket ettirin. zigot 20X amaca tutma pipet ve değişime onarılır böylece tutma mikroenjektör ile negatif basınç (aspirat) uygulayın. zigot tutma pipet takıldıktan sonra, yavaşça ayırarak olmadan etrafında embriyo hareket enjekte pipet kullanarak kalitesini kontrol edin. Kaliteli zigot iki kutup bedenlere sahip (tek görülür bazen rağmen) ve homojen bir sitoplazma olmalıdır. Anormal zigot (Şekil 3A) enjekte etmeyin. Gerekirse, uygun bir enjeksiyon için embriyo yeniden konumlandırmakyer. İyi bir konumlama olan ZP ve PM arasında biraz boşluk var, bu yüzden PM lazer zarar almaz olacaktır. Enjeksiyon pipet yavaşça enjeksiyon yerinde zigot dokunarak embriyonun orta düzlemde konumlanmasına dikkat edin. Bu orta düzleminin üzerinde değil, iğne embriyo yerine ponksiyon dönmesini sağlamak eğiliminde olacaktır. gerektiği gibi enjeksiyon pipet yüksekliğini ayarlayın. Bir lazer (Şekil 3B) kullanılarak ZP bir delik sağlayın. lazer yazılım yer deliği (embriyo tutma pipet bağlı olduğu yere karşı tarafında) yapılacaktır ZP lazer retikül kullanılması. Yangın butonuna lazer kontrol penceresi tıklayın kullanma. Deliğin boyutu PM zarar vermeden geçmesi iğne ZP bir açılış oluşturmak için yeterince büyük olduğundan emin olun (Örnek: 0.662 msn Pulse genişliği / 6.9 mikron Delik boyutu). iğne geçirinve ZP delikten PM ile temas. İğne embriyo (Şekil 3C) içine yolu ¾ kadar ileri pipet itmeye devam edin. Bu tutarlı bir enjeksiyon hacmini kontrol etmek için kullanılacak şekilde, çözelti, yağ ara yüzeyinde menisküsün konumunu dikkate alınmalıdır. PM ve sitoplazma enjeksiyon iğnesi içine aspire edilen sonuçlanacaktır enjeksiyon pipet üzerinde negatif basınç (aspirat) uygulayın. iğne içine sitoplazma hareketi hızlandırır kadar veya enjeksiyon solüsyonu ile karıştırma sitoplazma içeriği görülebilir zaman devam ediyor. Bu PM (Şekil 3D) kırılma gösterecektir. çözüm yağı interfaz menisküs başlangıç ​​noktasına geçmiş bir zigot çapı eşdeğer ilerlemiştir kadar pozitif basınç (enjekte) uygulayarak zigot sitoplazmaya solüsyonu ardından sitoplazmik içeriğin geri enjekte edilir. Not: Bizim koşullarda, bu Repreyaratabilecek enjekte çözeltisi (Şekil 3E), yaklaşık 7 Pl. Bir 4X amaca Değişim ve enjeksiyon damla alt tarafına enjekte embriyo / s taşıyın. tutma mikroenjektör pozitif basınç uygulayarak embriyo serbest bırakın. Enjekte / olmayan enjekte edilen embriyoların takip ve verimli çalışmanıza yardımcı olmak için üst tarafta olmayan enjekte edilen embriyolar ve damla alt tarafında enjekte olanları tutun. 5. Embriyo Kurtarma ve Enjeksiyon Sonuçları Önceden ısıtılmış SOF-HEPES ile yeni bir tabağına yaklaşık 200 ul 3 damla sağlayın. Bir microdispenser (yukarıda anlatıldığı gibi) kullanılarak enjekte embriyolar toplayın. 3 SOF-HEPES yoluyla damla taşıyarak enjekte embriyolar yıkayın. Mikroenjeksiyon sırasında parçalanmış embriyoların saymak ve atın. İlki bütün ZP doldurun, şeffaf görünür beri bir parçalanmış zigot sağlam bir birinden rahatlıkla ayırt edilebilir ve genellikle sitoplazmik vardır: NotEmbriyonun dışarıya sızıntı içeriği. İsteğe bağlı olarak, bir floresan mikroskop kullanılarak mikroenjeksiyon verimliliğini kontrol edin. UV ışığı maruziyeti sonraki gelişimini etkileyebilir embriyo hasarına neden olabileceğini unutmayın. 38.5 ° C 'de, mineral yağ altında 4 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) ile desteklenmiş, potasyum simpleks optimizasyonu ortamı 50 ul damlalar (KSOM) 25 enjekte edilen embriyoların Kültür gruplan, doyma noktasına kadar,% 5 havadaki CO2 ve nem. enjeksiyondan iki gün sonra,% 5 FBS ile kültür ortamı Ek. enjeksiyondan sonra blastosist (BL) oranlarını 7 gün kontrol edin. blastosist embriyolar / o damla kültür embriyo sayısının toplam sayısı olarak BL oranlarını hesaplayın.

Representative Results

Lazer destekli sitoplazmik mikroenjeksiyon hayvancılık zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için güçlü ve güvenilir bir protokoldür. 3 önce ve enjeksiyon yanı sıra tekniğin genel hatlarıyla sonra zigot genel hatlarını göstermektedir. Dekstran, kırmızı püskürtme ve enjeksiyon verimliliği ve doğruluk izleme sitesi sağlamak için çözelti enjekte olarak kullanılır. Çözeltinin başarılı dağıtım boya homojen olarak s…

Discussion

zigot Mikroenjeksiyon memeli embriyolarının içine çözümleri tanıtmak için köklü bir yöntemdir. türleri ve Deneyin amacı göre bazı farklılıklar ile, bu teknik genel olarak kullanılabilir. Biz bir künt uç mikropipet girişinde yardımcı olmak için bir lazer kullanarak intrasitoplazmik mikroenjeksiyon nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. (Örneğin sığır, koyun ve domuz gibi) bazı hayvan türlerinin zigot, embriyo içinde bir kez enjeksiyon pipet görselleştirme engelleyen, karanlık bir si…

Materials

Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverted microscope	Nikon	TE2000-U	Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish	Corning	430166	Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier.
35mm culture dish	Corning	430165	These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800	Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage	Minitube	12055/0003	Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil	sigma	M8410	Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes			Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl	Sigma	S5886	Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O	Sigma	M2393	Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate	Sigma	P4562	Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer	Sigma	W1503	Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Made in the lab		pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.