Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

8.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54465

⸱

5 Ekim 2016

 ,  , 
1Department of Animal Science, University of California, Davis

Bu makalede

Özet

Bu protokol, çiftlik hayvanı zigotlarında sitoplazmik mikroenjeksiyonun nasıl yapılacağını gösterir. Bu teknik, nakavt hayvanlar oluşturmak için genom düzenleme araçları gibi tek hücreli embriyoya herhangi bir çözelti vermek için kullanılabilir.

Özet

Tek hücreli embriyolara sitoplazmik mikroenjeksiyon çok güçlü bir tekniktir. Örnek olarak, yetişkin bir organizmanın her hücresinde bulunacak genetik modifikasyonlar yaratabilen genom düzenleme araçlarının sunulmasını sağlar. Preimplantasyon embriyolarında gen fonksiyonunu incelemek için siRNA, mRNA'lar veya bloke edici antikorlar vermek için de kullanılabilir. Kemirgenlerde kullanılan embriyoları mikroenjekte etmek için geleneksel teknik, embriyoya ilerletildiğinde doğrudan plazma zarına nüfuz eden çok ince bir mikropipetten oluşur. Bu teknik çiftlik hayvanlarına uygulandığında genellikle düşük verimle sonuçlanır. Bunun temel nedeni, farelerin ve sıçanların aksine, sığır, sığır ve domuz zigotlarının çok koyu bir sitoplazmaya ve plazma zarının enjeksiyonu ve penetrasyonu sırasında görselleştirmeyi zorlaştıran oldukça elastik bir plazma zarına sahip olmasıdır. Bu protokolde, sığır zigotlarının sitoplazmasına çözeltilerin verilmesi için koyun ve domuz embriyoları için de başarılı olduğu kanıtlanmış uygun bir mikroenjeksiyon yöntemi tanımlanmıştır. İlk olarak, zona pellucida'da bir delik oluşturmak için bir lazer kullanılır. Daha sonra künt uçlu bir cam mikropipet delikten sokulur ve iğnenin ucu embriyonun yaklaşık 3/4'üne ulaşana kadar ilerletilir. Daha sonra, plazma zarı, iğne içindeki sitoplazmik içeriğin aspirasyonu ile kırılır. Son olarak, aspire edilmiş sitoplazmik içerik ve ardından ilgilenilen çözelti embriyonik sitoplazmaya geri enjekte edilir. Bu protokol, sığır ve küçükbaş zigotlara %100 verimlilik, minimum lizis ve normal blastokist gelişim oranları ile farklı solüsyonların verilmesi için başarıyla kullanılmıştır.

Giriş

1-hücre embriyoların Sitoplazmik mikroenjeksiyon çok güçlü bir tekniktir. Bu, örneğin, gen fonksiyonu çalışma ya da gen düzenlenmiş hayvanlar oluşturmak için, gen, çıkıntılara üretilmesi için embriyo herhangi bir çözüm sunmak için de kullanılabilir. En tarımsal-ilgili çiftlik hayvanı zigot kendi sitoplazma opak ve 1 karanlık kılan çok yüksek yağ asidi kompozisyonu var. Onlar da oldukça esnek plazma zarı (PM) var. Bu özellikler kemirgen türleri zorlu ve sık sık yanlış kullanılan geleneksel pronüklear / sitoplazmik enjeksiyon kullanılarak mikroenjeksiyon yapmak.

Sonuçlar, daha kolay olan ve aynı zamanda daha yüksek canlılığı 2'de elde edilen, enjekte edilen embriyolar için daha az zarar yana Sitoplazmik mikroenjeksiyon pronükleer mikroenjeksiyon fazla avantajlara sahiptir. Bu protokolün genel amacı çiftlik hayvanı zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için başarılı bir yöntem ortaya koymaktır. yapabilmek içinBesi embriyoların yüksek verimle sitoplazmik mikroenjeksiyon, bir lazer, bir küt uç cam iğne mikroenjeksiyon için kullanılan zona pellucida (ZP) ve daha sonra bir delik oluşturmak için kullanılır. Bu strateji enjeksiyon sırasında embriyo üzerinde baskılı mekanik zararı azaltmayı hedefliyor. Sonra, enjeksiyon iğnesi içinde sitoplazmik içeriğin aspirasyon çözümü embriyo sitoplazmaya teslim edilmesini sağlamak PM verimli ve güvenli kırılmasına izin verir.

Bu teknik başarıyla zigotik sitoplazma 3,4 içine siRNA teslim etmek ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarı (CRISPR) / CRISPR ilişkili sistem 9 (Cas9) sistemi 5 ile mutasyon üretmek için sığır embriyolarının kullanılmıştır. Ayrıca sığır cumulus-kapalı oosit 6 enjekte etmek (küçük değişikliklerle) uygundur. Burada, bir boya teslim eden enjeksiyon protokol açıklar, herhangi des enjekte uygulanabilir olabilirzigot içine IRED çözüm ve bu tekniği kullanarak en az erimesine yol açar ve erken embriyo gelişimini etkilemediğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Mikropipet Üretimi

  1. enjeksiyon mikropipet
    1. borosilikat cam kapiller (: 1,0 mm, iç çapı (ID): dış çap (DÇ) 0.75 mm) koyun, bir mikropipet çektirmenin (sağ ve sol kılcal sahipleri merkezinde) ve kilitleyin.
    2. uzun uzantılar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir program kullanın. (Örnek: Isı: 825; çekin: 30; Hız: 120; Süresi: 200; Basınç: 500).
    3. Dikkatle cihazdan çekti pipetler kaldırmak ve yatay konumda bir microforge üzerine yerleştirin.
    4. çekti pipet ve odak noktası haline cam boncuk ile Microforge ısıtıcı iplik getir. İstenilen kalınlığı ölçümü ve ısıtıcı Filament hedef iç çapı (5 mikron) ulaşıncaya kadar yatay pipet taşımak için mercek reticle kullanın.
    5. yaklaşık% 45 ısı ayarlama ve filamanın dokunur şekilde hafifçe aşağı pipet getirmek. kısaca ısıtıcı etkinleştirin. Bu Whasta hafifçe filamanın yapışır, böylece pipet eritmek ve soğutma üzerine, pipet düz bir kesim üreten temas noktasında kıracak.
      Not: Çok yüksek sıcaklıklar pipet bend yapacak ve böylece düz bir kesim mümkün olmayacak ve çok düşük sıcaklıklarda pipet (Şekil 1A) eritmek için yeterli olmayacaktır çünkü uygun sıcaklık ayarı bu adımda anahtarıdır.
    6. Isıtıcı filament yaklaşık 10 mikron uzak konumlandırarak pipet yakın yaklaşık 30 ° açı yapar. % 60 sıcaklığını ayarlamak ve ısıtıcı etkinleştirin.
      Not: Bu filament üzerinde pipet viraj. Bu açı, enjektör (Şekil 1B) içine monte edildiğinde iğnenin ucu püskürtme plakasının yüzeyine paralel olacak şekilde tercih edilir.
    7. Bunlar son derece keskin ve kırılgan olduğu gibi dikkatli mikroenjeksiyon pipetler anlaştım.
  2. Holding mikropipet
    1. Bir borosilic yerleştirin(: 1,0 mm, ID: OD 0.75 mm) cam kapiller yedik (sağ ve sol kılcal sahiplerinin merkezinde) Mikropipet çektirmenin ve kilitleyin.
    2. uzun hatta konik ve paralel duvarlar ile ince ucu ile sonuçlanır böylece cam kapiller çekmek için uygun bir programı kullanın (: Heat: Örnek 815; çekin: 20; Velocity: 140; Zaman: 175; Basınç: 200).
    3. Dikkatle çektirmenin cihazdan çekti pipet kaldırmak ve yatay konumda Microforge tutucu üzerine yerleştirin. Isıtıcı lif ve pipet üzerinde odağı ayarlayın.
    4. pipet çapını ölçmek ve filamanın üzerinde çapı 180 mikron ulaşıncaya kadar pipet taşımak için mercek reticle kullanın.
    5. Belirtilen boyutta bir elmas uç kalem ile cam kapiller işaretleyin ve sonra yavaşça camı kırmak için çekti ucunda basın. Bu, düz bir kesim (Şekil 1C) ile sonuçlanmalıdır.
    6. filaman yakın olan ucu ile dikey bir konuma pipet getirin. sıcaklığı ayarlayın % 60 microforge evi.
    7. Yangın lehçe o 40 mikron bir kimliği ulaşıncaya kadar standart teknikler 7 kullanarak pipet ucu. Kimliği (Şekil 1D) kontrol etmek için mercek reticle kullanın.
    8. pipet üzerinde bir açı yapar.
      1. yaklaşık 10 mikron uzaklıkta filamanın ve uzak ucu 5 mm geri yatay konuma pipet getirin. Yaklaşık% 60 sıcaklığını ayarlamak ve filamanın üzerinde pipet bend ısıtıcı etkinleştirin. (Yaklaşık 30 O) arzu edilen bir açı elde edilene kadar ısıtma devam edin. Açı görsel (Şekil 1E) kontrol edin.
        Not: Pipet, genellikle enjeksiyon tabağın tabanına göre 60 ° bir açı ile yaklaşık mikroenjektör monte edilir. onun orta düzleminde embriyo doğru enjeksiyon için gerekli olan çanak tabanına paralel şekilde pipet ucu bükülür.
le "> 2. Mikromanipülatör Kurulumu

  1. mikroenjektörler tamamen yağ ile yüklü olduğundan ve sistemde hiçbir hava kabarcığı olduğunu (mikroenjektör kabarcıklar enjeksiyon ince kontrol edilmesini önlemek) kontrol edin.
  2. mikromanipülatörler orta konumda olduğundan emin olun. Bu pipetler geniş bir hareket aralığı sağlayacak.
  3. Sol mikromanipülatör tutucuya yerleştirin tutma pipet ve sağ mikromanipulasyon tutucu içine enjeksiyon pipet yerleştirin.
  4. Yağ kılcallık tarafından pipetler girmek ve sistem mikroenjektör kontrollerini kullanarak pipet içinde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yağı düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için izin verin.
    Not: iğne içinde yağ hiçbir hareket yoksa, bir yapışmasına neden olabilir. Bu durumda, yeni bir iğne kullanınız.
  5. görüş mikroskop alanının merkezi haline pipetler getirmek için mikromanipülatör denetimlerini kullanın. 4X büyütme kullanarak, mikropipet uçları (doğru açıda p olduğunu kontrol edinçanak alt) için arallel.
    Not: iğne Doğru kurulum başarılı bir enjeksiyon için ve sonuç tutarlılığı için anahtardır.
  6. Üreticinin kalibrasyon kılavuzuna aşağıdaki lazer sistemi kalibre edin.

Enjeksiyon Dish 3. Hazırlama (Şekil 2)

  1. 100 mm petri kabı kapağının merkezine,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş ısıtıldı (37 ° C), SOF-HEPES (malzeme bölümünde ayrıntılı olarak bileşimin) içindeki bir 50 ul damla yerleştirin. solüsyonu 2 ul damla enjeksiyon damla yakın enjekte edilecek - 1 yerleştirin. embriyolar RT aşağıda soğumasını etmediğinden emin olun.
    Not: Bu protokolde enjeksiyon siteyi görselleştirmek ve daha sonra takip edebilmek için enjekte çözüm Dekstran-Kırmızı boya katacak.
  2. mineral yağ, yaklaşık 10 ml kullanılarak enjeksiyon plaka damla örtün.
  3. ters mikroskop aşamasında enjeksiyon çanak yerleştirin ve pip getirmekEnjeksiyon damla içine ettes. iğneler damla içindeki odak olup olmadığını kontrol edin. mikromanipülatör denetimlerini kullanarak gerektiği gibi kendi yüksekliğini ayarlayın.
  4. Enjeksiyon damla üst tarafında - (20 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 17) 30 zigot - Bir microdispenser kullanarak, yaklaşık 20 yükleyin. Enjeksiyon damla embriyo sayısı kişi bunları enjekte etme hızı tarafından belirlenmektedir, ki böylece, oda sıcaklığında enjeksiyon gerçekleştirin. 30 dakika içinde enjekte edilebilir olanlarına göre daha fazla embriyolar yüklemeyin.
    1. microdispenser içine embriyolar yüklemek için, tam pistonu bastırın ve embriyoları içeren çözelti içine ucu batırın. Dokunmatik embriyolar cam kapiller ucu (seferde bir) ile aldı ve yavaş yavaş piston böylece her embriyo kılcal girer serbest olması. tüm embriyolar toplanır veya microdispenser kapasitesi dolana kadar bu işlemi tekrarlayın.
    2. Yüklenen embriyolar serbest tüm hacim co kadar pistonu hafifçe bastırmak içinembriyolar ntaining kılcal salınır.

4. Mikroenjeksiyon

  1. 4X objektif kullanarak, negatif basınç (emme) uygulanarak enjeksiyon pipetine enjekte edilecek çözelti yüklenir. 3 zigot - 2 enjekte etmek yeterli bir çözüm yükleyin. Sonra enjeksiyon damlasına kadar hareket ettirin.
  2. ucu bir zigot yakın alır bu yüzden enjeksiyon damla içinde holding pipet hareket ettirin. zigot 20X amaca tutma pipet ve değişime onarılır böylece tutma mikroenjektör ile negatif basınç (aspirat) uygulayın.
  3. zigot tutma pipet takıldıktan sonra, yavaşça ayırarak olmadan etrafında embriyo hareket enjekte pipet kullanarak kalitesini kontrol edin. Kaliteli zigot iki kutup bedenlere sahip (tek görülür bazen rağmen) ve homojen bir sitoplazma olmalıdır. Anormal zigot (Şekil 3A) enjekte etmeyin.
  4. Gerekirse, uygun bir enjeksiyon için embriyo yeniden konumlandırmakyer. İyi bir konumlama olan ZP ve PM arasında biraz boşluk var, bu yüzden PM lazer zarar almaz olacaktır.
  5. Enjeksiyon pipet yavaşça enjeksiyon yerinde zigot dokunarak embriyonun orta düzlemde konumlanmasına dikkat edin. Bu orta düzleminin üzerinde değil, iğne embriyo yerine ponksiyon dönmesini sağlamak eğiliminde olacaktır. gerektiği gibi enjeksiyon pipet yüksekliğini ayarlayın.
  6. Bir lazer (Şekil 3B) kullanılarak ZP bir delik sağlayın.
    1. lazer yazılım yer deliği (embriyo tutma pipet bağlı olduğu yere karşı tarafında) yapılacaktır ZP lazer retikül kullanılması. Yangın butonuna lazer kontrol penceresi tıklayın kullanma. Deliğin boyutu PM zarar vermeden geçmesi iğne ZP bir açılış oluşturmak için yeterince büyük olduğundan emin olun (Örnek: 0.662 msn Pulse genişliği / 6.9 mikron Delik boyutu).
  7. iğne geçirinve ZP delikten PM ile temas. İğne embriyo (Şekil 3C) içine yolu ¾ kadar ileri pipet itmeye devam edin.
  8. Bu tutarlı bir enjeksiyon hacmini kontrol etmek için kullanılacak şekilde, çözelti, yağ ara yüzeyinde menisküsün konumunu dikkate alınmalıdır.
  9. PM ve sitoplazma enjeksiyon iğnesi içine aspire edilen sonuçlanacaktır enjeksiyon pipet üzerinde negatif basınç (aspirat) uygulayın. iğne içine sitoplazma hareketi hızlandırır kadar veya enjeksiyon solüsyonu ile karıştırma sitoplazma içeriği görülebilir zaman devam ediyor. Bu PM (Şekil 3D) kırılma gösterecektir.
  10. çözüm yağı interfaz menisküs başlangıç ​​noktasına geçmiş bir zigot çapı eşdeğer ilerlemiştir kadar pozitif basınç (enjekte) uygulayarak zigot sitoplazmaya solüsyonu ardından sitoplazmik içeriğin geri enjekte edilir.
    Not: Bizim koşullarda, bu Repreyaratabilecek enjekte çözeltisi (Şekil 3E), yaklaşık 7 Pl.
  11. Bir 4X amaca Değişim ve enjeksiyon damla alt tarafına enjekte embriyo / s taşıyın. tutma mikroenjektör pozitif basınç uygulayarak embriyo serbest bırakın. Enjekte / olmayan enjekte edilen embriyoların takip ve verimli çalışmanıza yardımcı olmak için üst tarafta olmayan enjekte edilen embriyolar ve damla alt tarafında enjekte olanları tutun.

5. Embriyo Kurtarma ve Enjeksiyon Sonuçları

  1. Önceden ısıtılmış SOF-HEPES ile yeni bir tabağına yaklaşık 200 ul 3 damla sağlayın. Bir microdispenser (yukarıda anlatıldığı gibi) kullanılarak enjekte embriyolar toplayın. 3 SOF-HEPES yoluyla damla taşıyarak enjekte embriyolar yıkayın.
  2. Mikroenjeksiyon sırasında parçalanmış embriyoların saymak ve atın.
    İlki bütün ZP doldurun, şeffaf görünür beri bir parçalanmış zigot sağlam bir birinden rahatlıkla ayırt edilebilir ve genellikle sitoplazmik vardır: NotEmbriyonun dışarıya sızıntı içeriği.
  3. İsteğe bağlı olarak, bir floresan mikroskop kullanılarak mikroenjeksiyon verimliliğini kontrol edin. UV ışığı maruziyeti sonraki gelişimini etkileyebilir embriyo hasarına neden olabileceğini unutmayın.
  4. 38.5 ° C 'de, mineral yağ altında 4 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) ile desteklenmiş, potasyum simpleks optimizasyonu ortamı 50 ul damlalar (KSOM) 25 enjekte edilen embriyoların Kültür gruplan, doyma noktasına kadar,% 5 havadaki CO2 ve nem.
  5. enjeksiyondan iki gün sonra,% 5 FBS ile kültür ortamı Ek.
  6. enjeksiyondan sonra blastosist (BL) oranlarını 7 gün kontrol edin. blastosist embriyolar / o damla kültür embriyo sayısının toplam sayısı olarak BL oranlarını hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lazer destekli sitoplazmik mikroenjeksiyon hayvancılık zigot sitoplazması içine çözümler sunmak için güçlü ve güvenilir bir protokoldür. 3 önce ve enjeksiyon yanı sıra tekniğin genel hatlarıyla sonra zigot genel hatlarını göstermektedir. Dekstran, kırmızı püskürtme ve enjeksiyon verimliliği ve doğruluk izleme sitesi sağlamak için çözelti enjekte olarak kullanılır. Çözeltinin başarılı dağıtım boya homojen olarak sitoplazmada dağıtıldığı bir en son enjekte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

zigot Mikroenjeksiyon memeli embriyolarının içine çözümleri tanıtmak için köklü bir yöntemdir. türleri ve Deneyin amacı göre bazı farklılıklar ile, bu teknik genel olarak kullanılabilir. Biz bir künt uç mikropipet girişinde yardımcı olmak için bir lazer kullanarak intrasitoplazmik mikroenjeksiyon nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. (Örneğin sığır, koyun ve domuz gibi) bazı hayvan türlerinin zigot, embriyo içinde bir kez enjeksiyon pipet görselleştirme engelleyen, karanlık bir sitoplazma var. Ayrıca, plazma membranlar,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu teknikle ilgili çalışmalar NIH/NICHD RO1 HD070044 ve USDA/NIFA Hatch projeleri W-3171 ve W-2112 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mikropipet çektirme SutterAletiP-97
Cam kılcalSutter aletleriB100-75-10Bu kılcal damarlar, pipetleri tutmak ve enjekte etmek için kullanılır. Filamentsiz herhangi bir kalın/standart duvar borosilikat boru kullanılabilir.
MicroforgeNarishigeMF-910X büyütme lensi ile donatılmıştır.
MikromanipülatörNikon / NarishigeNT88-V3
Ters mikroskopNikonTE2000-U4X, 20X lensler ve bir lazer sistemi ile donatılmıştır.
LazerAraştırma Cihazları7-47-500Satürn 5 Aktif lazer.
MikrodispenserDrummond3-000-105Mikrodispenser embriyoları hareket ettirmek için kullanılır. Bir p10 pipeti de kullanılabilir, ancak mümkün olduğunca minimum hacimde yükleme yapılabilir.
100 x 15 mm kültür kabıFalcon351029Enjeksiyon plakasını yapmak için çanağın kapağını kullanın, çünkü daha alçak duvarlara sahiptirler ve mikromanipülatörün konumlandırılmasını ve hareket etmesini kolaylaştıracaktır. 60 mm'lik bir kültür kabının kapağı da kullanılabilir.
35 mm kültür kabıCorning430165Bu kaplar 50 & mu'daki embriyoları kültürlemek için kullanılır; l mineral yağ ile kaplı damlalar. Alternatif olarak, 4 kuyulu bir tabak da kullanılabilir. Embriyoları kültürlemek için seçilen çanak ne olursa olsun, embriyoları onlara transfer etmeden önce her zaman en az 4 saat inkübatörde dengelenmeleri gerekir.
Kuluçka MakinesiSanyoMCO-19AIC38.5 &�'ye ayarlanabilen herhangi bir kuluçka makinesi; C,% 5 CO2< / sub> koşulları kullanılabilir.
StereomikroskopNikonSMZ800Kültür damlalarında ve yıkamalar sırasında embriyoları görselleştirmek için kullanılır. 10X büyütmeli herhangi bir stereomikroskop kullanılabilir.
Kontrol Ünitesi HTMinitube12055/0400Stereomikroskoba bağlı ısıtma sistemi.
Isıtmalı Mikroskop AşamasıMinitüp12055/0003Stereomikroskoba bağlı ısıtma sistemi.
Dextran-RedThermo ScientificD1828Enjekte etmek için steril 10 mg / ml çözelti kullanılır.
Mineral OilsigmaM8410Mineral yağı oda sıcaklığında tutun ve  folyo kağıt kullanarak ışıktan koruyun.
KSOMaa EvolveBovine ZenitZEBV-1004 mg / ml BSA ile desteklenmiştir. Embriyo kültürü için KSOM plakaları, kullanımdan önce en az 4 saat inkübatörde dengelenmelidir.
FBSGemini-Bio100-525Kök hücre nitelikli bir FBS kullanın.
ZigotlarZigotlara 17-20 hpf enjekte edilir ve in-vitro- veya in-vivo türevi olabilir.
NaClSigmaS5886Nihai konsantrasyon: 107.7 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
KClSigmaP5405Nihai konsantrasyon: 7.16 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
KH2PO4SigmaP5655Nihai konsantrasyon: 1.19 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
MgCl2< / sub> 6H2< / sub>OSigmaM2393Nihai konsantrasyon: 0.49 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
Sodyum DL-laktatSigmaL4263Nihai konsantrasyon: 5.3 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
CaCl2-2H2O SigmaC7902Nihai konsantrasyon: 1.71 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
D-(&eksi;)-Fruktoz SigmaF3510Nihai konsantrasyon: 0,5 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
HEPES SigmaH4034Nihai konsantrasyon: 21 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
MEM-NEAASigmaM7145Nihai konsantrasyon: 1x. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
BME-EAASigmaB6766Nihai konsantrasyon: 1x. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
NaHCO3SigmaS5761Nihai konsantrasyon: 4 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
Sodyum piruvatSigmaP4562Nihai konsantrasyon: 0.33 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
GlutamaxGibco35050Nihai konsantrasyon: 1 mM. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
BSASigmaA-3311Nihai konsantrasyon: 1 mg / ml. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
GentamisinSigmaG-1397Nihai konsantrasyon: 5 & mu; g/ml'dir. SOF-HEPES ortamının bileşeni.
Embriyo transferi için suSigmaW1503SOF-HEPES ortamının bileşeni.
SOF-HEPES ortamıLaboratuvardapH 7.3 - 7.4, 280 & 10 mO. 22 & mu ile sterilize edilmiş filtre; M filtre buzdolabında 4 ° C'de saklanabilir; 1 ay boyunca C. 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.
üretilmiştir

Kaynaklar

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lazer destekli mikroenjeksiyonsitoplazmik enjeksiyonzona pellucidaküt uçlu mikropipetplazma membranı rüptürüembriyo enjeksiyonumikroforge tekniğisolüsyon iletimiblastokist gelişimi
Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.