Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

16K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54468

⸱

14 Eylül 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health Center, 2Department of Computer Science and Engineering, University of Connecticut, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, 4Department of Orthopaedics, University of Rochester

Bu makalede

Özet

Bu el yazmasında, mineralize dokuların donmuş kesitleri üzerinde birkaç tur floresan görüntülemeden çoklu yanıt ölçümlerinin hizalanmış kompozit görüntülerini üretmek için yüksek verimli, yarı otomatik bir kriyohistoloji platformu sunuyoruz.

Özet

Çeşitli dokuların etkin fenotiplemesi ve histopatolojisine artan bir ihtiyaç vardır. Bu fenotipleme ihtiyacı, fare genomundaki her geni bozmaya yönelik iddialı projelerle belirgindir. Araştırma topluluğu, histoloji yoluyla dokuları fenotiplemek için hızlı ve ucuz araçlara ihtiyaç duymaktadır. İskelet dokularının histolojik analizleri genellikle zaman alıcıdır ve en iyi ihtimalle yarı kantitatiftir ve düzenli olarak eğitimli bireylerden alınan slaytların öznel olarak yorumlanmasını gerektirir. Burada, mineralize dokuların verimli ve ucuz fenotiplemesi için kriyohistolojik bir paradigma sunuyoruz. İlk olarak, mineralize dokuların morfolojisini koruyan yeni bir bant stabilize kriyoseksiyon yöntemi sunuyoruz. Bu bölümler daha sonra cam slaytlara sağlam bir şekilde yapıştırılır ve birkaç tur boyama boyunca tekrar tekrar görüntülenir. Elde edilen görüntüler daha sonra manuel olarak veya bilgisayar yazılımı aracılığıyla hizalanır ve birkaç katmanlı görüntüden oluşan bileşik yığınlar elde edilir. Protokol, belirli bir bölümdeki belirli hücrelere çok sayıda moleküler sinyalin birlikte lokalizasyonuna izin verir. Ek olarak, bu floresan sinyaller bilgisayar yazılımı aracılığıyla objektif olarak ölçülebilir. Bu protokol, mineralize dokuların histolojisi ile ilişkili birçok eksikliğin üstesinden gelir ve kas-iskelet dokularının ilerlemesi için yüksek verimli, yüksek içerikli fenotipleme için bir platform görevi görebilir.

Giriş

Biyolojik araştırmalar genellikle sık histolojik analiz 1-3 çeşit ile ilişkili verimli fenotiplendirilmesini gerektirir. Bu ihtiyaç, fare genomuna 4 her genin bozmaya daha da belirgin iddialı projelerle olduğunu. Bu histolojik analizler tek tek hücrelere spesifik genlerin veya proteinlerin eşleme ifadesi hücre morfolojisi ve / veya anatomik özellikleri değerlendirmek arasında olabilir. Aslında, genomik alana histoloji temel katkılardan biri, belirli bir bölge ya da hücre tipine özel bir moleküler sinyali ilişkilendirmek yeteneğidir.

Özellikle kas-iskelet dokular için histoloji geleneksel yöntemler, genellikle zaman alıcı ve zahmetli, bazen düzeltmek için hafta gerektiren vardır, decalcify, bölüm, leke ve görüntü numune daha sonra insan yorumuna aracılığıyla görüntüleri analiz. In situ hybridizat edip, immünohistokimya ile, çoklu moleküler sinyallerin incelenmesiiyon ya da özel lekeleri, uygun gerçekleştirmek için birden çok bölüm ve hatta birden fazla örnekleri gerektirir. Ayrıca, bu çoklu tepkiler verilen bir örnekten içinde belirli bir bölgeye eş lokalize edilemez bazen aynı hücreye birlikte lokalize ve olamaz. genomik ve epigenomics alan dijital çağa hareket ettikçe, histolojik alanı da verimli, yüksek verim ve tek histolojik bölüm içinde moleküler sinyallerin çeşitli otomatik analizini sağlamak için davayı takip gerekir.

Gerçekten de, belirli bir numune içindeki belirli hücrelere birden fazla moleküler sinyalleri ilişkilendirmek geliştirilmiş histolojik teknikler için bir talep vardır. Son zamanlarda, mineralize dokusundan 5-14, belirli bir bölüm içinde birkaç yanıt tedbirleri değerlendirmek için yeni bir yüksek verimli cryohistological yöntemi yayınlamıştır. işlem, bir mikroskop lamı katı bantlanmış bölümüne yapışan, dondurulmuş cryotape ile cryosection stabilize içerir veHer bölümünde boyama ve görüntüleme birkaç tur yürütülmesi. Görüntülerin bu tur daha sonra elle veya görüntü analiziyle önce bilgisayar otomasyon (Şekil 1) ile hizalanır. Burada, bu sürecin ayrıntılı protokolleri sunmak ve bu tekniklerin değişik biyolojik süreçlerin anlayışımızı geliştirdik örnekler sunmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Connecticut Sağlık Merkezi kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi Üniversitesi, tüm hayvan prosedürleri onayladı.

1. Sabitleme ve katıştırma

  1. CO 2 boğulma veya onaylanmış diğer yöntemlerle hayvan Euthanize.
  2. Düzgün bir şekilde monte kadar 4 ° C'de% 10 nötr tamponlu formalin ilgi doku (örneğin, bacak, omurga, vb) ve yer Hasat. önce fiksasyon tutarlı anatomik yerleşimi korumak için özel dikkat gösterin. Örneğin, tutarlı fleksiyon, iç rotasyonda eklemler ile bacaklarda düzeltmek ve dış rotasyon 11 açıları. 3 gün - Tipik olarak, 1 bütün fare uzuvların düzeltmek.
    Dikkat: Formalin toksik ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek bir davlumbaz ele alınmalıdır.
    Not: tespitin zaman dilimi numune büyüklüğüne bağlıdır. Deney izin veriyorsa, kemik açık kesme iliği bölmesinin tespit artıracaktır.Bazı örnekler (kemik iliği içinde, örneğin, soluk floresan sinyalleri) floresan arka plan en aza indirmek için perfüzyon fiksasyon 15 gerektirebilir.
  3. 4 ° C'de 24 saat - Transfer 1x PBS içinde yapılan 12 boyunca inkübe,% 30 sakaroza formalin gelen örnekleri.
    Not: Bir kere 12 inkübe - 24 saat, daha sonra numuneler, uzun süreli depolama için -80 ° C 'de yerleştirilebilir. Depolama Bu yöntem, araştırmacılar aynı blokta çok sayıda örnek gömmek niyetinde ama aynı zamanda, bu örneklerin her hasat olabilecek olan deneyler için tavsiye edilir (örneğin, çoklu zaman noktalarında olan deneyler).
  4. sukroz gelen örnekleri çıkarın ve herhangi bir aşırı doku uzak teşrih.
  5. Bir cryomold doldurun cryo gömme orta ile yol parçası (kalıbın büyüklüğü numune boyutuna bağlıdır). ilgi bölgesi uçağı kesme kalıp zemine paralel olduğu şekilde kalıp içinde örnek yerleştirin.
    Not: Belirli doku yerleştirme ve oryantasyon bir örnekŞekil 2A bulunabilir - B.
  6. kriyo gömme ortamı donar ince bir tabaka kadar bir kuru buz parçası üzerine cryomold yerleştirin ve daha sonra yerine numune giderir. Kuru buz pelet üzerine cryomold korurken cryo gömme orta ile cryomold kalan hacmi doldurun.
  7. 2-metil-butan kuru buz ile önceden soğutulmuş ihtiva eden bir kap içinde cryomold yerleştirin. Numuneler tamamen donmuş sonra, cryomolds kaldırmak ve fazla 2-metil-bütan silkeleyin. -20 ° C olarak selofan ve yerine cryomolds Wrap veya -80 depolama ° C sıcaklıkta dondurucuya.
    Not: Özellikle -20 ° C sıcaklıkta, kriyo gömme ortamı içinde depolandığında numuneler, zaman içinde kuruyabilir. (Adım 1.3) -80 ° C ya da -80 ° C'de% 30 sukroz içinde gömme orta kriyo 2 ay - daha uzun süreli 1 numunelerinin muhafaza önerilir.

2. Bant stabilize Doku Kesit

  1. dondurucudan örnek blokları kaldırmak ve cryosta yerleştirmek-20 Ve -25 ° arasında bulunan sıcaklık T.
  2. cryomold blok çıkarın ve bir jilet ile gömme orta aşırı kriyo uzak trim.
  3. numune diske bazı cryo gömme ortamı yerleştirin ve sonra numune disk yüzeyi ve böylece ilgi bölge için uygun kesme düzlemini kuran bloğun alt yüzeyine paralel olacak şekilde blok hizalayın.
  4. kriyostat Numune disk yerleştirin ve dondurmak için gömme orta cryo için izin verir.
  5. numune kafasına üzerine numune disk yerleştirin ve bıçak keser numune bloğunun yüzeyine paralel şekilde kafasını ayarlayın.
  6. ilgi bölge içinde bir seviyeye blok aşağı trim ve blok yüzeyinden herhangi bir talaşı savmak.
  7. kriyostat ilgi ve pre-soğuk bölgesini kaplayacak kadar büyük cryotape bir parça kesin.
    Not: Birden adet cryost içinde tutarlı boyutlarda kesilmiş ve saklanabilirKesit sırasında.
  8. sonra aşağı blok yapışkan tarafı üzerine bant yerleştirmek forseps kullanılarak yapışkan olmayan gümüş / altın tırnaklarından bandı tutarak cryotape gelen yapışmayan desteğini çıkarın.
  9. Makarayı (Şekil 2C) kullanarak cryotape basınç uygulayın.
  10. Otomatik motor veya kriyostat elle kesme tekerleği kullanarak - (8 mikron 5) bir bölüm yapın.
    Not: O bölüm (Şekil 2D) kesit sırasında sahneden düşmez şekilde sahneye geldiği gibi cryotape kenarına tutmak için iyi bir uygulamadır.
  11. Kriyostat içinde plastik bir mikroskop lamı üzerine bölüm doku tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
  12. kriyostat plastik slayt çıkarın ve kriyo gömme ortamı bölümü sürgünün yüzeyine yapışan şekilde eritmek için izin verir.
  13. seri bölümleri veya ilgili diğer bölgeler için kesit tekrarlayın.
  14. bitmiş kez, bir slayt kutusu a bölümleri saklamakt 4, -20 veya -80 ° C gerekli depolama uzunluğu ve alt tepki önlemleri bağlı. 4 ° C'de depolandığında bir ay içinde - örneğin, enzimatik aktivite için lekeli olacak slaytlar kullanın (5.3 5.2).

Mikroskop Slaytlar Bölüm 3. yapışması

  1. UV vulkanize edilebilir bir yapışkan yöntemi.
    1. mikroskop lamı etiketleyin.
      Not: artan otomasyon, örnekler ve slaytlar barkod ile etiketlenmiş olabilir için.
    2. İki cam slaytlar UV aktif optik yapıştırıcı bir damla uygulanır ve cam slaytlar yüzeyi boyunca daha ince bir yapışkan tabakası yayıldı için plastik bir slayt kenar kullanımı.
    3. gümüş / altın sekmesini kesti ve ilk slayt yapıştırıcı bantlanmış bölüm doku tarafı yukarı yatıyordu. bant altında tutulmuş kabarcık oluşumunu en aza indirmek için diğer bir kenarından bir yuvarlanma hareketi bölümü uygulanır.
      Not: ilk kayar t önceden ıslatılması alt için kullanılırönce ikinci (kalıcı) slayt (adım 3.1.4) üzerine yerleştirerek o kaset.
    4. İlk slayt bantlanmış kısmını çıkarın ve ikinci slayt (Şekil 3A) yapışkan tabaka üzerine yerleştirin. Yine, kabarcıkların sıkışmasını önlemek için özen gösterin.
      Not: Bu adım usta pratik gerektirir.
    5. Verilen deney için bölümlerin uygun sayıda, her slaytta yerleştirildikten sonra, çevresinde aşırı yapışkan siliniz.
    6. bant altında kabarcıkların veya liflerin yakından her bölüm kontrol edin. Bir mikroskop ya da büyüteç altında inceleme yapın. engel varsa, bireysel bölümünü kaldırmak engelleri kaldırın ve sonra cam slayt yeniden uygulayın.
    7. yapışkan çapraz bağlanması için 10 dakika - bantlanmış bölümleri altında herhangi bir engel olmadığı belirlendikten sonra, 5 UV siyah ışık altında mikroskop slaytlar yerleştirin.
  2. Kitosan yapıştırma yöntemi.
    1. th hazırlayıne% 1 kitosan yapışkan. 100 ml Dİ su içinde konsantre asetik asit, 0.25 ml eritilmesi asetik asit solüsyonu hazırlamak (% 0.25 hac / hac). asetik asit çözeltisi, 100 ml çitosan tozu, 1 g çözülür ve çözelti O karışmaya / N ya da kitosan tozu eriyene kadar.
      NOT: Çözelti oda sıcaklığında stabildir.
    2. slayt üzerine yerleştirilmiş olan her bir bölüm için çitosan solüsyonu damla bırakın.
    3. Bant gümüş / altın sekmesini kes ve yapıştırıcı (Şekil 3A) üzerine kadar her bantlanmış bölüm doku tarafını yerleştirin. kabarcıkların sıkışmasını önlemek için büyük özen kullanın.
    4. Bir kez tüm bölümleri slayt yerleştirilir, uzun kenarlarından birinde slayt yukarı eğin ve forseps kullanılarak alt kenarına aşırı kitosan sürükleyin.
    5. Bir slayt kutusunda bir kağıt havlu üstüne bu yönde slaytlar yerleştirin. Yerçekimi sonra kitosan düz ve düzgün bir tabaka verimli, aşırı kitosan havlu üzerine aşağı düşmesine yol açacaktır.
    6. Plabuzdolabı O açık sütyen, kapağı slayt kutusu ce / N kitosan kuruması için.
      NOT: İki yapışkan yöntemler arasında bir karşılaştırma için Tablo 1'e bakınız.

Slaytlar Referans belirteçlerinin 4. Uygulama

  1. Yeşil 50 ul su ve 100 ul Kırmızı mikrosferler 50 ul çözülmesiyle bir referans işareti çözeltisi hazırlayın. 4 ° C'de karanlıkta çözelti saklayın.
  2. Microsphere solüsyon içine 10 ul veya 20 ul pipet ucu yerleştirin. Ilgi bölgesi (Şekil 3C) bitişik her bölüm için mikro küre çözeltisi küçük bir damla ekleyin. ilgi bölge içinde mikro kürecikler alamadım için dikkatli olun.
  3. O gün slaytlar işleme durumunda, 30 dakika boyunca (ışıktan korunmuş olarak) oda sıcaklığında slaytlar kurutun. Değilse, 4 ° C de bir slayt kutusuna slaytlar yerleştirin.
    Not: Microsphere çözüm slaytları sulandırılması önce kurur Sürece, microspheres boyama / görüntüleme birden turda slaytlar yapıştırılır kalacaktır.

Boyama 5. Çoklu turlar

NOT: görüntüleme, boyama ve Yeniden görüntüleme başlıyor adımları uyumlu dizisi seçerek, tespit ve aynı doku bölümünde pek çok biyolojik sinyaller ko-lokalize etmek mümkündür. görüntüleme / boyama / Yeniden görüntüleme başlıyor Her yuvarlak, özellikle histolojik soru için geliştirilmelidir. Görüntüleme / boyama / Yeniden görüntüleme başlıyor dizisi, tipik olarak, floresan çoklamalı immün ve enzimatik aktivite lekelerin çok turlu ardından görüntüleme ilk turunda endojen floresan sinyalleri (örneğin, hücresel, GFP, mineralizasyon boyalar, in vivo görüntüleme sondaları) elde içerir. Son olarak, bölüm mimari dokusu vurgulamak için kromojenik boyalar (O safranin örneğin, H & E, mavi toluidin, vb) kullanılarak boyandı. uyarlanan bu bölümde bulunmaktadır sunulan özel yöntemleriticari olarak temin edilebilir protokolleri.

  1. Birikmiş mineral için Calcein mavi boyama
    NOT: Calcein mavi boyama karanlık alan ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme aksine otomatik görüntü analizi için uygun olan tutarlı bir mineral yüzeyini verir. Kalsein mavi boyama ile sorun örneği bu mineral etiketleri, görüntü kalsein mavi ile boyanmadan önce görüntüleme ilk turda etiketler içeriyorsa floresan spektrum nedenle. Tetrasiklin ve demeklosiklin etiketleme ile örtüşür olmasıdır.
    1. doku içinde endojen sinyalleri bu boyama aşamasından önce görüntülü Eğer kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar, 1xPBS dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları daldırın. Çıkarın ve kapak fişleri kurutun.
    2. NaHCO 3% 2 kalsein mavi çözelti 30 mg / ml hazırlama (100 mi, H 2 g NaHCO 3 çözülmesiyle yapılan 2 O ve ayarlamak) HCI ile 7.4 pH'a ing. Kısım ve -20 ° C'da, çözelti saklayın.
    3. Zaten önceki turdan hidrate değilse, bölümleri hidrat için 15 dakika boyunca 1x PBS içeren bir coplin kavanoza slaytlar daldırın.
    4. slaytları çıkarın ve kağıt havlu ile arka ve kenarları kurur.
    5. Slayt başına kalsein mavi çözeltisi 500 ul ve oda sıcaklığında bir nem odası içinde 10 dakika süreyle inkübe - 100 uygulanır.
    6. 3 değişikliklerle, 10 dakika boyunca 1 x PBS içinde slaytlar durulayın.
    7. Her bir slayt için 1x PBS içinde% 50 gliserol ~ 200 ul uygulayın ve kapak kayma monte edin.
    8. Fazla gliserol çıkarın ve slaytlar alt kurutun.
  2. Tartarat-dirençli asit fosfat (TRAP) enzimatik aktivitesi boyama
    Not: TRAP osteoklastlar dahil olmak üzere hematopoetik soy çok hücre tipinde ifade edilmektedir. Burada yer alan TRAP boyama sarı floresan asit fosfataz substratı kullanılır. Bazı flüoresan sinyalleri ov olacaktetrasiklin / demeklosiklin mineralizasyon etiketleri, mavi leke Calcein ve DAPI counterstain dahil olmak üzere özel sarı filtre seti ile erlap.
    1. kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar 1x PBS ile dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları Batmak. Çıkarın ve kapak fişleri kurutun.
    2. sodyum asetat susuz 9.2 g, su içinde sodyum tartrat dibazik dihidrat 11.4 g çözülmesi ve 1.000 ml nihai hacim getirerek Tamponu 1 hazırlayın. Konsantre buzlu asetik asit (- 2 mi ~ 1.5) ile 4.2 pH ayarlayın. 4 ° C'de çözüm Mağaza 12 aya kadar için ° C.
    3. su içinde sodyum nitrit, 40 mg eritilmesi ve 1 ml nihai hacim getirerek Tamponu 2 hazırlayın. 1 hafta kadar 4 ° C'da, çözelti saklayın.
    4. boyama gününde, tampon 1 7.5 ml ve tamponun 2 150 ul karıştırılarak reaksiyon tamponu hazırlayın.
    5. slayt substrat olmadan reaksiyon tamponu uygulamak10 s - 15 dakika daha düşük pH değerlerinde doku dengelenmesi.
      NOT: Tipik hacim ~ 200 ul ama tüm bölümleri kapsayacak kadar geniş olması gerekir.
    6. 100 reaksiyon tamponu: 1:50 ve 1 arasında sarı floresan asit fosfataz substratı sulandırmak.
      Not: seyreltme örnek içinde TRAP aktivitesi ile belirlenecektir.
    7. slaytlar kapalı reaksiyon tamponu dökün ve slaytlar sarı floresan substrat ile reaksiyon tamponu uygulanır.
    8. substrat etkinleştirmek için UV siyah ışık altında 5 ~ için min slaytlar yerleştirin.
      Not: İnkübasyon süresi örnek içinde TRAP aktivitesi ile ilgili olarak değişebilir.
    9. 3 değişikliklerle, 10 dakika boyunca 1 x PBS içinde slaytlar durulayın.
    10. Her bir slayt için 1x PBS içinde% 50 gliserol ~ 200 ul uygulayın ve kapak kayma monte edin.
    11. Fazla gliserol çıkarın ve slaytlar alt kurutun.
      NOT: Asidik TRAP tampon bölümleri kirecini olacaktır. decalcifica yararıyon bazı renkler aşağı boyama (örneğin, mineralizasyon etiketleri) için yeniden kullanılabilir olmasıdır. Örneğin, Calcein mavi boyama TRAP boyama esnasında silinecektir. Bu nedenle, DAPI counterstain bir sonraki turda bu kanalda görüntülü olabilir.
  3. Alkalin fosfataz (AP) enzimatik aktivitesi boyama
    NOT: mineralizasyon osteoblast dahil ve demineralize kondrositler AP ifade ile ilgili birden çok hücre tipleri. Bu protokolde kullanılan Hızlı Kırmızı substrat hem floresan kırmızı ve kromojenik kırmızı sinyal ortaya çıkarır. Bu nedenle, alt-tabaka alt-tabaka kromojenik çökelir bölgelerde floresan sinyalleri gidermek olacak. Bu nedenle, AP substrat tarafından söndürüldü edilebilir floresan sinyalleri görüntüleme sonra bu lekeyi yapmak en iyisidir.
    1. kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar 1x PBS ile dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları Batmak. RemoA.Ş. ve kapak fişleri kurutun.
    2. 100 ml su Tris 12.1 g çözülmesiyle 1 M Tris hazırlayın. 1 M NaOH ile 9.5'e pH ayarlayın.
    3. Iyonu giderilmiş su, 100 ml MgCl2 20.33 g çözülmesiyle 1 M MgCI2 heksahidrat hazırlayın.
    4. iyonu giderilmiş su, 100 ml 11.68 g NaCl çözülmesiyle 2 M NaCl hazırlayın.
    5. iyonu giderilmiş 50 ml su içinde 1 g toz çözülmesiyle Fast Red TR Tuz 100x hazırlanması (20 mg / ml) stok çözeltisi. -20 ° C'de 100 ul alikotları ve mağaza sağlayın.
    6. N, N-dimetilformamid içinde 50 ml 500 mg tozunun çözülmesiyle 100x (10 mg / ml) Naftol AS-MX fosfat stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de 100 ul alikotları ve mağaza sağlayın.
    7. 100 mm: boyama gününde, 2 M NaCl MgCl2, 0.5 ml 1 M Tris, 1 ml, 1 M, 0.5 mi ekleyerek AP tamponu hazırlamak ve (deiyonize su ile 10 ml nihai konsantrasyonlar son hacim getirmek Tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCI).
    8. AP b yerleştirinHer bir slayt Uffer ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle bir nem odasında inkübe edilir.
    9. AP tamponunda 1x Fast Red TR Tuz ve Naphthol AS-MX 100x stokları seyreltilmesi ile AP substrat tamponu hazırlayın.
    10. slaytlar kapalı AP tampon dökün ve AP substrat tamponu ile değiştirin. Oda sıcaklığında bir nem odası içinde 10 dakika - 5 için slaytlar inkübe edin.
      Not: Kuluçka süresi örnek AP aktivitesi tarafından dikte edilir.
    11. Yıkama 5 dakika her biri için 1x PBS 3x slaytlar.
    12. (: 1x PBS içinde% 50 gliserol DAPI 1000 seyreltme 1) Dağı kapak DAPI counterstaining çözümü ile sığar.
  4. Toluidin mavisi O (TB) kromojenik boyama
    NOT: Önceki tüm adımları% 50 gliserol / PBS çözüm geçici sulu montaj altında görüntülenmiş Çünkü, kromojenik adım, aynı zamanda sulu koşullar altında görüntülü. Ancak, boyama çözüm zamanla dışarı sızma eğiliminde olabilir. Bu nedenle, mümkün olan en kısa şekilde boyama sonrası görüntü toluidin mavisi önerilmektedir.
    1. Kapak fişleri uzakta slaytlar düşene kadar deiyonize su ile dolu bir coplin kavanoza önceki görüntüleme turda slaytları Batmak. Çıkarın ve kapak fişleri kurutun.
    2. Kapak fişleri çıkardıktan sonra, tatlı su ile değiştirin ve PBS tuzlar yeterince dokudan uzaklaştırılır, böylece en az 10 dakika süreyle slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
    3. deiyonize su içinde% 0.025 TB çözeltisi hazırlayın.
    4. 5 dakika - 1 TB çözeltisi slaytlar yerleştirin.
      NOT: İnkübasyon süresi kullanıcı tercihine bağlıdır ancak tüm örneklerin tutarlı tutulmalıdır.
    5. deiyonize su ve yıkama kaydıraklı coplin kavanozun içine yerleştirin slaytlar 5 dakika her biri için 3x.
    6. Deiyonize su içinde çözülmüş% 30 gliserol Mount kapak kayma (bu leke dokusundan süzülmeye neden olacağından PBS 1x DEĞİL). Not: Gliserol montaj orta dokusundan leke difüzyonunu engeller fruktoz şurubu, ile sübstitüe edilmiş olabilir. için, Fruktoz şurubu hazırlanması çözülene kadar 60 ° C'de deiyonize su ve ısı 10 ml fruktoz 30 g çözülür.

Görüntüleme 6. Çoklu turlar

  1. Mikroskop tepsiler (Şekil 3D) içine slaytlar yükleyin.
    Not: tepsiler yaylı bulunmaktadır.
  2. Sürgülü tarama mikroskobu (Şekil 3E) ve tepsisi içine tepsileri yerleştirin.
  3. Her fluorofor için uygun pozlama süreleri ile her slayt için bir profil yüklemek için profil listesinde tıklayın. her slaydı el adlandırmak veya yazılım slayt etiketi üzerinde sağlanan barkod okuma için slayt adını tıklayın. slayt bir önizleme görüntüsü çekmek için başlangıç ​​önizleme tarama düğmesine tıklayın.
  4. Doku algılama sihirbazında ilgi alanları ayarlayın ve görüntüleme sonraki tur için saklayın. Her slayt ayarlandıktan sonra, başlangıç ​​tarama düğmesine tıklayarak tarama işlemini başlatmak.
    Not: Sistem 100 sli tutabilirAynı anda des.
  5. Görüntüleme bittikten sonra, görüntü montaj ve analizi için her .tif gibi bireysel kanal ve görüntüleme yuvarlak veya .jpg dosyaları görüntüleri ihracat.

7. Görüntü Meclisi

  1. Photoshop kullanarak Manuel yöntemi (veya katmanlı görüntü üretme yeteneğine sahip benzer bir resim düzenleme yazılımı).
    1. Her bir görüntüleme turda her tek kanal görüntüyü açın.
    2. bir kompozit görüntü içinde katmanlar olarak bireysel görüntüleri birleştirin. Bunu yapmak için, bir görüntüden katman paletinin içinde katman üzerinde tıklayın. Sonra başka bir görüntü üzerine tabaka sürükleyin. Bu sürükle ve bırak işlemi görüntüde yeni bir katman oluşturur. Diğer tüm görüntüler için bunu yapın. Alternatif olarak, bir görüntü yığını katmanların gibi birden fazla görüntü dosyalarını yükleyerek bu işlemi otomatik hale getirmek için (Stack ... içine Dosya> Komut> Load Files) bir komut dosyası kullanabilirsiniz.
    3. Her resim kompozit görüntüde tek bir katman olarak listelenir sonra, katman adının üzerine çift tıklayın la yeniden adlandırmakyers olarak farklı kanalları ayırt etmek gerekiyordu.
    4. Her bir katmanın aracılığıyla görmek ve gerçekten kompozit görüntü oluşturmak için katman paletinin içinde "Screen" için "Normal" her katman için karışım modunu değiştirmek için.
      Not: Bu adımı hızlandırmak için ekrana tek bir katman değiştirmek sonra katman üzerinde sağ tıklayın, ardından diğer tüm katmanları vurgulamak, "kopya katman stili" seçmek ve diğer ekran stilini uygulamak için "hamur katman stili" seçeneğini katmanlar.
    5. Daha iyi kromojenik katmanı sayesinde floresan sinyalleri görselleştirmek için kromojenik katmanın (yani, toluidin mavi) - İstenirse, donukluk (% 40 10 değişiklik değeri) azalır.
      Not: Bu protokolde kullanılan kiremitli tarama mikroskobu ve böylece görüntüleme her turda slayt oluşabilir dönme miktarını en aza indirerek, 3 kenarlarında slaytlar tutar. Nedenle, elde edilen görüntüleri döndürmek zorunda kalmadan kullanıcı görüntüleri elle hizalamak için çok daha kolaydırgörüntüleme farklı mermi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yüksek Verim, Çok Görüntü Cryohistology için Genel İş Akışı

Şekil 1, bu teknik için kullanılan genel akışını gösterir. Bu görüntüleme ve nihayet görüntü hizalama / analiz birkaç tur aracılığıyla tespit edildiği yerden birkaç adım içerir. Haftada o örneklerin bu tür kirecini için gereken daha az zaman görüntüleme 4 mermi yoluyla numune sabitleme gitmek için süreç biraz alabilir. Görüntüleme düz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada birlikte lokalize ve tek bir bölüm üzerinde lekelenme / görüntüleme birden mermi görüntüleri hizalayarak çeşitli biyolojik önlemlerin ölçmek için detaylı bir cryohistology protokolü sundu. Bu bölüm, dokuya güç morfolojisi (örneğin, mineralize edilmiş kemik ve kıkırdak) muhafaza etmesi cryotape kullanılarak belirtilen yöntem özellikle faydalıdır. Buna ek olarak, kesit doku, aynı bölümün boyama / görüntüleme sanmı için izin cam slayt sıkıca yapıştırılır; seri bölümlerde her bir farklı bir protokol ile boya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarına teşekkür etmek ister: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 ve T90-DE021989.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 nötr tamponlu formalinSigma AldrichHT501128-4LBirden fazla tedarikçi mevcuttur. Zehirli. % 4 paraformaldehit ile ikame edilebilir.
SucroseSigma AldrichS9378Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
PBSSigma AldrichP5368Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
CryomoldsFisher ScientificFisherbrand #22-363-554Dokuya bağlı olarak farklı boyutlar kullanılabilir
CryomatrixThermo Scientific6769006Diğer kriyomatrislerle ikame edilebilir. Bununla birlikte, PVA/PEG bazlı reçineler elimizde en iyi sonucu verdi.
2-metil-bütanSigma AldrichM32631Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
CryostatLeica Biosystems3050sDiğer marka/modellerle değiştirilebilir.
Numune diskiLeica Biosystems14037008587Diğer markalar/modeller ile değiştirilebilir.
Kriyostat bıçaklarıThermo Scientific3051835Diğer marka/modellerle değiştirilebilir.
KriyobantBölüm LaboratuvarıKriyofilm 2C
Silindir ElektronMikroskobu Bilimleri62800-46Diğer markalar/modeller ile değiştirilebilir.
Plastik mikroskop slaytlarıElektron Mikroskobu Bilimleri71890-01Diğer markalar/modeller ile değiştirilebilir.
Cam mikroskop slaytlarıThermo Scientific3051Diğer marka/modellerle değiştirilebilir.
Norland Optik Yapıştırıcı, 61Norland OptikNorland Optik Yapıştırıcı, 61
UV Siyah IşıkGeneral ElectricF15T8-BLB
Buzlu asetik asitSigma AldrichARK2183Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
KitosanSigma AldrichC3646Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
InSpeck kırmızı mikroskoplarThermoFisher ScientificI-14787
InSpeck yeşil mikro kürelerThermoFisher ScientificI-14785
Calcein BlueSigma AldrichM1255Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
CalceinSigma AldrichC0875 Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
Alizarin kompleksiSigma AldrichA3882 Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
DemeklosiklinSigma AldrichD6140 Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
NaHCO3Sigma AldrichS5761Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
GliserolSigma AldrichG5516Birden fazla tedarikçi mevcut.
ELF 97 sarı floresan asit fosfataz substratThermoFisher ScientificE-6588
DAPIThermoFisher Scientific62247Birden fazla tedarikçi mevcuttur. Hoechst 33342 veya diğer nükleer boyalarla ikame edilebilir.
TO-PRO-3 (Cy5 nükleer karşı boya)ThermoFisher ScientificT3605
Propidium İyodürThermoFisher ScientificR37108Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
Sodyum asetat susuzSigma AldrichS2889Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
sodyum tartrat dibazik dihidrat Sigma AldrichT6521Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
Sodyum nitritSigma AldrichS2252Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
TrisSigma Aldrich15504Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
MgCl2 hekzahidratSigma AldrichM9272Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
NaClSigma AldrichS7653Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
Hızlı Kırmızı TR TuzSigma AldrichF8764Birden fazla tedarikçi mevcuttur. Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX Sigma AldrichN4875Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
N, N dimetilformamidSigma AldrichD158550Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
Toluidin mavisi OSigma AldrichT3260Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
Axio Scan.Z1Carl Zeiss AGAxio Scan.Z1Diğer doğrusal veya döşemeli tarayıcılar da kullanılabilir.
DAPI Filtre SetiChroma Technology Corp.49000
CFP Filtre SetiChroma Technology Corp.49001
GFP Filtre SetiChroma Technology Corp.49020
YFP Filtre SetiChroma Technology Corp.49003
Özel sarı (ELF 97) Filtre SetiChroma Technology Corp.töre; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filtre SetiChroma Technology Corp.49004
Cy5 Filtre SetiChroma Technology Corp.49009
CryoJane Bant Transfer Sistemi ElektronMikroskobu Bilimleri62800-10Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
CryoJane Bant Windows ElektronMikroskobu Bilimleri62800-72Birden fazla tedarikçi mevcuttur.
CryoJane Yapıştırıcı Slaytlar ElektronMikroskobu Bilimleri62800-4XBirden fazla tedarikçi mevcuttur.
gibi diğer substrat kitleri ile de kullanılabilir;

Kaynaklar

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Bantla Stabilize Edilmiş KriyoseksiyonUV ile Kürlenebilir YapıştırıcıSeri Kesit GörüntülemeFloresan Sinyal KantifikasyonuLam Tarama MikroskobuReferans İşaretleyici HizalamaYüksek Kapasiteli FenotiplemeKas-İskelet Sistemi Dokusu Analizi
Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.