Yöntem makalesi

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

DOI:

10.3791/54518

⸱

9 Aralık 2016

 ,  , 
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Affinity yakalama fazla çalışma için endojen protein kompleksleri izole etmek için etkili bir tekniktir. bir antikor ile birlikte kullanıldığında, bu yöntem, aynı zamanda sık sık immüno olarak adlandırılır. Afinite yakalama bir laboratuvar ölçekli ve yüksek verimli bir çerçevede uygulanabilir. Protein kütle spektrometrisi ile birleştiğinde, afinite yakalama interaktom analizi bir beygir olduğu kanıtlanmıştır. ilgili sayısız adımlar yürütmek için potansiyel birçok yolu olmasına rağmen, aşağıdaki protokoller bizim tercih yöntemleri uygulamak. İki özellik ayırt edici: eğilim aracı olarak hücre ekstreleri ve antikor-bağlı paramanyetik taneler oluşturmak için cryomilled hücre tozun kullanımı. Bir çok durumda, daha geleneksel bir afinite yakalama uygulamaları ile elde edilen üstün sonuçlar elde edilmiştir. Cryomilling hücre kopması diğer formları ile ilgili çok sayıda sorun önler. Denat kaçınarak Bu malzemenin verimli kırılma içerirIsıtma veya köpük ilişkili doyma sorunları. Bu makromoleküler ayrışma hafifletici, çıkarma noktasına doğal protein konsantrasyonu yukarı korur. Bu ekstre proteinler zararlı enzimatik aktiviteleri sınırlar çözelti içinde harcadığı zamanı azaltır ve afinite ortamı tarafından proteinlerin spesifik olmayan adsorpsiyon azaltabilir. Mikron ölçekli manyetik afinite medya giderek geleneksel agarose- ve Sefaroz tabanlı medya yerine, son birkaç yıl içinde daha yaygın hale gelmiştir. manyetik ortamda İlköğretim faydaları genellikle daha düşük spesifik olmayan protein adsorpsiyonu arasında; protein kompleksi bağlama çünkü hiçbir boyut dışlama sınırı yerine gözenekleri içinde daha boncuk yüzeyinde meydana gelir; ve manipülasyon kolaylığı ve mıknatıslar kullanılarak taşıma.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prosedürlerde tipik bir uygulaması, interactomic karakterizasyonu 1 ilgi endojen protein kompleksleri, yüksek verim ve saflıkta stabilize etmek ve elde etmektir. Esas olarak proteinlerden müteşekkildir hem stabil ve geçici olarak ilişkili olan makromoleküler kompleksler, dinamik ağlar, hücresel süreçleri 2,3 orkestra anlaşılmaktadır. Protein-protein etkileşimlerini belirlemek için çok sayıda deney yaklaşım olsa da, afinite yakalama izole edilmesi ve fizyolojik protein kompleksleri 4-6 kesme için en yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında yer alır. Ayrıca, bu teknik, bir görüntü-okuma veri noktaları olarak sadece fiziksel kişiler gibi makromoleküler kompleksler üretme avantajına sahiptir; Avantajlı olarak, elde edilen kompleksler böylece ek alt biyokimyasal, enzimatik ve yapısal deneyleri 7-9 bir dizi de kullanılabilir. sunulan protokoller protein, harita ihtiyacına yanıt olarak geliştirilmiştirn-protein etkileşim ağları hücre biyolojisi efektör molekülleri olarak kendi rollerini makromoleküler kompleksleri karakterize ve. Bunlar doku kültüründe yetiştirilen memeli hücreleri için kendi uygulama ile ilgili olarak detaylı bir, ama uygun sistem özel ince ayarlar belirli bir biyolojik numune bir yelpazede aynı şekilde uygulanabilir.

afinite yakalama tarihi ilk immünoafinite kromatografisi deneyleri ile geri yirminci yüzyılın uzanan - yaygın immunoprecipitation olarak günümüzde adlandırılan benzeyen (IP) - 1950'lerin başında literatürde görünen. Tekniğin ana kullanım, mevcut 10-13 Bu yüzyılın geliştirilecek. Çeşitli hücre ve moleküler biyolojik çalışmalar, en azından son kırk yıl 14-19 için kriyojenik sıcaklıklarda öğütülmesi ile hücrelerin mekanik kırılmasını kullanmış olması; ve (süper) paramanyetik boncuk kullanılarak moleküler ayrımları bec varSon yirmi yıl 20'den fazla giderek daha yaygın ome. Kendimiz tarafından üretilen işin geniş bir gövde ve daha geniş araştırma topluluğu tarafından kanıtlandığı gibi, sinerjik protein kompleksi afinite yakalama deneylerinde 1 elde edilebilir sonuçları iyileştirmek için hizmet vermiştir bu farklı teknolojileri birleştirerek 7,9,11,18,19,21 -23. Destekleyici sonuçları Şekil 1'de sunulmuştur.

Uyarılar ve etkili afinite yakalama deneyleri yürütme için geçerli hususlar koleksiyonu referansı 1 bulunabilir. Örneğin, ilgi konusu bir protein inter aktörlerin katalog şimdiye kadar bilinmeyen copurifying proteinleri (keşif analiz) tespit etmek için protein kütle spektrometrisi (MS) (I) e;: Tipik haliyle, bu yaklaşımın en uygun olan Belirli bir karşılıklı etkileşim eşinin mevcudiyetinde (II) deneyi, örneğin, içinde olduğundan şüphelenilen bir protein, özellikle protein veya sınırlı sayıda tespit etmek için, MS veya Western blot kullanımıfaiz (hipotez testi) protein ile teract; ya da (III) Ek teknikler ile daha fazla çalışma ile (hazırlama muamele) için ilgi konusu proteini ihtiva eden endojen monte edilmiş protein kompleksleri hazırlamak. bir afinite yakalama deney rejimine başlamadan önce, hedef proteinin, ilgilenilen doğal hedef proteinine karşı veya bir füzyon proteini eklenmiş bir etiket karşı, tipik olarak, bir IP-kompetan antikora bağlanan bir yüksek kaliteli afinite reajanı için kesinlikle gereklidir. tüm yaygın afinite yakalama ile birlikte kullanılan, Western blotting, ve protein MS (örneğin Coomassie mavisi, SYPRO Ruby veya gümüş aşağıdaki SDS-PAGE), genel protein lekeleme: yerinde yapılan deneysel okuma uygun yöntem için de önemlidir 1. sunulan protokolleri için eğilim aracı olarak bir antikor konjuge manyetik boncuklar kullanmaktadır. Iken afinite orta işlevi başlangıçta, birkaç deneysel parametreleri kullanan testlerde doğrulanabilirHer deney ampirik 1,11,24 optimize edilmelidir iyi sonucu elde. protokolleri üç ayrı faza ayrılır: donmuş hücre malzemesinin (1) hazırlanması; (2) çok düşük bir sıcaklıkta katı halde öğütme hücre kopması; ve (3) ekstraksiyon ve antikor-bağlı para-manyetik boncuklar kullanılarak afinite yakalama.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Hasat ve Donma

  1. Çevrede 25,26 hücre hattı için uygun kültür koşulları kullanılarak, hücre materyalinin 1-8 g büyütün. Bu protokol referanslar 19,27,28 değiştirilmiş hücrelerin en fazla 8 gram (~ 10 9 hücreleri) için optimize edilmiştir. Tipik haliyle, ~ HEK-293 veya HeLa hücrelerinde 5 g yetiştirilen sekiz 500 cm2 kültürü plakalarına ~% 90 konflüansa elde edilebilir.
    DİKKAT: Bu protokoller ciddi kriyojenik yanıklara neden olabilecek sıvı azot (LN 2), kullanın. Don koruyucu giysi ve egzersiz uygun taşıma önlemleri.
  2. Büyük bir behere büyüme ortamı (atık) dökünüz.
  3. büyük dikdörtgen bir buz tavada buz üzerinde kültür çanak yerleştirin.
  4. kültür tabağına buzla soğutulmuş 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile 20 ml ilave edilir ve büyük bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak hücreleri serbest; 50 ml'lik bir tüpe hücreleri transferi, önceden buz üzerinde soğutulmuştur; Buz tüpü tutun.
    NOT: Tüm hücre için taşıma adımları transferi manipülasyonlar sırasında hücrelerin aşırı kesme önlemek için bir elektro-pipet seti için "düşük" ve 25 ml'lik pipet kullanın. 50 ml toplama tüpleri düzenleyin ve önceki işlemleri başlatmadan bir buz kovasının içinde PBS 1x.
  5. Aynı çanak buz soğukluğunda 1x PBS ilave 10 ml. Kalan hücreleri toplamak ve 50 ml tüp aktarabilirsiniz.
  6. Her yemek için tekrarlayın; farklı yemekler hücre süspansiyonları örnek sayısı ve plastik atıkları azaltmak için kombine edilebilir.
    Not: hücrelerin kendileri süspansiyon hacminin büyük bir bölümünü teşkil etmez, çünkü hücre süspansiyonu değerinde üç tabak, iki 50 ml'lik tüp içine birleştirilebilir. 50 ml'lik tüpler aslında nominal hacmi daha fazla tutun, çünkü sekiz tabak genellikle beş tür tüpler yayılmış olabilir.
  7. 1,000 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje.
  8. Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde, her pelletini. resu birleştirinspended peletler, 5 ila 50 ml başına tüpüne kadar, örnek sayısını azaltmak için.
  9. 1,000 x g'de, 4 ° C'de santrifüje 5 dak.
  10. Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde pelletini
  11. 20 ml şırınga pistonu çıkarın ve bir kenara koyun. şırınga meme Cap ve buna hücre süspansiyonu aktarın.
  12. 1,000 x g'de, 4 ° C'de, 50 ml bir tüp ve santrifüj 5 dakika içinde şırınga yerleştirin.
  13. Hücrelerin sadece üst tabakası kadar bir vakum tuzak sistemine bağlı bir ince uçlu pipet ile süpernatant aspire kadar emilmesini başlar. Bu ıslak hücre peleti ile sonuçlanır.
  14. , Şırınga kapağını açmak piston yerleştirin ve bir strafor kutu içinde bir LN 2 banyosunda tutulan LN 2 ile dolu büyük bir plastik beher, doğrudan hücreleri damla. Zorla şırınga kalan hücrelerin dalma.
  15. dökerek 50 ml tüpler için donmuş hücreleri aktarın. Gevşek fazla LN 2 buharlaşmasına izin tüpler kap; t tutun-80 ° C 'de hem gece boyunca karıştırıldı. Ertesi gün tam kapaklarını sıkıştırın. Dondurulmuş hücre cryomilling kadar -80 ° C 'de bu şekilde depolanabilir.
    NOT: sıkıca aksi takdirde aşırı basınç tüpü patlamasına neden olabilir, LN 2 gözle görülür buharlaştı öncesi tüm tüpleri kapatmayın. LN 2 fazla su ağırlık ekleyerek, hücreler malzeme üzerinde don birikimi neden olabilir harcanmış ve etkin öğütme üzerine protein konsantrasyonu azaltan sonra tüpleri kapanan değil.

Dondurulmuş Hücre 2. kriyojenik bozulması

NOT: freze ve manipülasyonlar için tüm araçlar LN 2 ile ön soğutulması gerekmektedir. Küçük bir dekanter kavanoz içinde LN 2 eklemek için kapalı freze kavanozun üstünden LN 2 dökme için gerekli olacaktır. Ev yapımı bir araç referansı 19 gösterilmiştir. Kriyojenik eldivenler LN 2 freze cihazı soğutmalı işlemek için gerekli olacaktır. değirmencilikBurada kullanılan kavanoz kapakları genellikle yüklü bir lastik conta ile birlikte (Malzeme Tabloya bakınız); Bu güvenilir aşağıdaki protokol yürütmek için piyasada mevcut olan teflon kapaklı conta ile değiştirilmesi gerekir. Gaz N2 basınç öğütme sırasında kavanoz içinde yüksek seviyelere kadar inşa edebilirsiniz, çünkü Dahası, biz bir güvenlik önlemi bırakma 28 olarak piyasada mevcut 5 bar / 500 kPa basınç valfi yüklemenizi öneririz.

  1. -80 ° C depolama hücre boncuk çıkarın ve bir LN 2 banyosunda 50 ml'lik bir tüp tutucu tutun.
  2. LN 2 içeren bir temiz dikdörtgen buz kovası, 50 ml kavanoz, iki adet 20 mm'lik topları ve kapağı ön serin. birini kullanarak, eğer politetrafloroetilen (PTFE) yalıtkan önceden soğutmak; Ya diskleri bir dizi (27 referans bakınız) ya da bir kol ve-cin (bakınız Şekil 2). Ön soğutma işlemi tamamlandığında LN 2 yatıştırır şiddetli kaynama.
  3. Set uygun dengedeğirmen.
    NOT: Bu kavanoz, kavanoz kapağı kütlesine eşit olacaktır, freze topları kullanılan ve hücrelerin miktarı kavanoza eklenecek. herhangi bir PTFE izolatörler kullanılması halinde, kitlesel de dahil edilmelidir. Biz kavanoz, kapağın kitleleri kayıt ve önceden (kullanılan herhangi izolatör dahil ve bunların kombine kütlesi) ve değirmen yakın saklanan bir bilgi kağıda bunları kayıt topları öneririz.
  4. forseps kullanarak, önceden soğutulmuş freze kavanoz içinde iki önceden soğutulmuş 20 mm freze topları ve donmuş hücreleri yerleştirin.
    Not: nedeniyle öğütme sırasında kavanoz ve top yüzeylerde malzemenin küçük kayıpları artar öğütülmüş hücrelerin kütlesi olarak geri malzeme artar yüzdesi. tarif edilen yöntemle, malzeme kayıpları ~ 0.3 g ıslak hücre ağırlığı (WCW) sırasına olmak, çok mütevazı. Üreticinin kurallar numunenin maksimum hacim kavanoz hacmi ~ 1/3 olmalıdır yüklenen gösterir. 29 topları toplam hacmi ~ 1/3 ve r olmalıdıremaining ~ 1/3 boş alan topları serbest dolaşımı içindir.
  5. ~ ½ tam kavanoz up LN 2 Ekle, kavanozun kapağı yerleştirin ve değirmene aksamını aktarın.
    NOT: birini kullanarak Öncelikle seçilen izolatörü yükleyin.
  6. ters-rotasyon yönünü her dakika, hiçbir aralık sonu, 400 rpm, 3 dakika: yerinde montajını Kelepçe ve aşağıdaki programı kullanarak öğütme üç kür gerçekleştirin. Her çevrimde arasında LN 2 ile freze kavanoz soğutun.
    NOT: topları gezegensel hareket kavanoz içinde çarpışır olarak ayrı bir clunking gürültü oluşturulur freze sırasında. Bu sesler duydum değilseniz, freze meydana gelmiyor. Kavanoz içeriğini, bu döngüyü saymak geri LN 2 kavanoz düzeneğini taşımak ve incelemek değil, freze döngüsünü sona erdir. kurdu hayır buz sağlamak ve varsa, önceden soğutulmuş spatula ile uzak kavanoz duvarlarından onu çip. Adım 2.5 den tekrar başlayın.
    Hiçbir izolatör veya yalıtkan diskleri kullanıyorsanız, geri kavanoz düzeneğini taşımak LN 2 serin yeniden ve tam her zaman ½ ~ için LN 2 ekleyin. LN 2 öğütme sırasında kavanoz sıcaklığı arttıkça kavanoz içinde buharlaşır ekledi. Bu kavanoz içindeki basınç birikmesi ile sonuçlanır. değirmen kavanozu boşaltırken, bu nedenle, çok yavaş kelepçe bırakın. kelepçe hızla bırakılırsa, hücre toz hızlı basıncın ile kaçabilir. kelepçenin yavaş salgılanan yumuşak, kontrollü bir şekilde kavanozdan kaçmasına basıncın ve hücre malzemesinin kaybını önler. Bu normaldir - gazlı N2 nazik kaçış genellikle kelepçe yavaşça serbest olarak tıslama duyulabilir.
    Bir kol-ve-cin yalıtkan kullanıyorsanız, kavanoz montaj değirmende sol ve LN 2 yerinde izolatör / kavanoz montaj eklenebilir.
  7. Geri LN 2 kavanoz taşıyın ve soğutmak için bir an dinlendirin. Bir manşon ve-diski yalıtkan kullanılıyorsa, kavanoz kol W çıkarılabilirher iki tarafta kaldıraç sağlayan iki spatula yardımıyla, i. Kavanoz LN 2 dinlenme sonra, dikkatlice forseps kullanarak topları kaldırmak, kapağı kaldırmak ve önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak önceden soğutulmuş 50 ml tüp toz transferi. Açık kavanoz / toz biraz LN 2 ekleme kaldırmadan önce, topları üzerine fırıncı olan toz çıkarmak için yardımcı olabilir.
    NOT: Kavanoz açıldıktan sonra, topları çıkarmadan önce ona LN 2 küçük bir miktar ekleyin. Bu yüzeylerde fırıncı toz kurtarmak için yardımcı olacaktır. Hücre tozu -80 ° C veya altında, kullanılıncaya kadar tutulmalıdır. Deneyimlerimize göre, hücre toz performansı etkilemeden, esas olarak sonsuza kadar bu şekilde saklanabilir.

Hücre özleri Protein Kompleksleri 3. Affinity Yakalama

NOT: Aşağıdaki protokol faiz, eş protein ile etkileşime afinite bir afinite ligandı oluşan medya, yem ya da antikor uygularparamanyetik boncuk ölçekli mikron için upled. Bu ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, in-house 19,30 hazırlanabilir ya da hazır reaktifler olarak satın alınabilir.

  1. Hücre ekstresi hazırlanması
    NOT: Hücre tozu tutarken, mutfak eşyaları ve tüpler LN 2 ile önceden soğutulmuş kullanmayı unutmayın. Hücre tozu içeren tüpler her zaman değil -80 ° C'de LN 2 tutulmalıdır. 50 ml tüp (ler) LN 2 plastik bir kap içinde, tüp raf hücre tozu içeren yerleştirin.
    1. 1.5 ya da 2 mi mikrofüj tüpe, hücre tozu 100 mg tartılır.
      NOT: hücrelerin bu miktar genellikle nanogram yüzlerce onlarca hedef proteini verecektir iyi bir başlangıç ​​noktasıdır başına kopya binlerce, bir orta ifade protein (~ 50 kDa kitle için afinite yakalama sonra mevcut aralığı olduğunu gözlemledim hedefin çıkarma ve yakalama verimliliği küstah hücresi), ≳70% bulunmaktadır. Bu tür verimler doğrudan visualiz sağlamakSDS-PAGE ve protein boyama ile saflaştırılmış fraksiyonunun yapımı.
    2. Boş mikrofuge'de tüp ile dara analitik terazi. Bir LN 2 kaşık veya spatula soğutmalı kullanarak bir tüp içine hücre tozu dağıtın. analitik terazi üzerinde tüp içinde dağıtılan toz kütlesini kontrol edin.
      NOT: Hücre tozların dışarı ağırlığında, küçük hacimsel ölçüm kaşık kullanılabilir kolaylaştırmak için. Bunlar (19 referans bakınız) tekrarlanabilir sonuçlar verdiği bulunmuştur. Biz vidalı kapak ya da 'güvenli kilit' mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak en iyi sonuçları bulduk. Potansiyel olarak örnek kaybı ile sonuçlanan - Standart mikrosantrifüj tüpleri hemen önce ekstre çözeltisine ilave edilmesinden sonra ısıtma sırasında açık pop neden olabilir tüpleri girebilir LN 2 buharlaştırma Basınç.
    3. tüp açın (veya vidalı kapağı gevşetin) hücre tozu ile ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bu tüp içindeki basıncı serbest bırakmak ve ekstraksiyon hemen donmaması olacakÇözelti, tozun ilave edildi. Hiçbir çözülme bu 1 dakika inkübasyon sırasında görülmektedir.
    4. 3.1.5 adımına geçilmesi sırasında kısa bir süre için, daha sonra buz üzerinde tutmak proteaz inhibitörleri ve vorteks ile takviye özümleme 400 ul ekle. Numuneler elüsyon kadar daha sonraki tüm manipülasyonlara arasında buz üzerinde tutulmalıdır.
      Not: özütleyici iyi bileşim olup protein kompleksi (ES) bağlıdır arıtılacak. Bazı genel bilgi, Tablo 1 ve destek referanslarda verilmektedir.
    5. örnek, herhangi bir agrega dağıtmak için kısa bir düşük enerji darbe vermek için bir mikrotip ultrasonikatör kullanın. 4 bakliyat (2 saniye her 2 A; toplam enerjinin yaklaşık 15-20 J) ile (Ultra) sonikasyon.
      NOT: Vorteks özümleme içine hücre tozu dağıtır, ama çözüm karakterine bağlı olarak, bazı büyüklükler görülebilir. Biz bu agrega dağıtma sonraki afinite çekimi sırasında en iyi verimi sağladığını bulmuşlardır. Kısa bir mikro uçlu sonikatyon kolayca bu agrega dağılır. Çözüm açık agrega olmadan, yarı saydam, ancak homojen görünmelidir. Su banyosu sonicators verimli önemli ölçüde daha uzun numune alma süreleri olmadan bu tür agrega dağıtmak için çok düşük güç olma eğilimindedir, ancak uygun ayarlarla uygun olabilir.
    6. Santrifüj ile özü netleştirmek (örneğin, 20,000 xg, 10 dakika, 4 ° C).
      Not: berraklaştınlmış hücre Özütün bir alikotu, pelet, post-afinite yakalama yüzer içeriğine karşılaştırma için kaydedilebilir ve afinite ortamının elüsyonundan sonra, elde edilen fraksiyonlar, hedef proteinin ekstre etkinliğini ve yakalama belirlenmesi örneğin, Western blot ile (tartışma).
    7. süpernatant (açıklık ekstresi) çıkarın ve afinite yakalama geçin.
      Not: pelet, hedef protein D'salım derecesini belirlemek için, 70 ° C 'de, SDS-PAGE numune yükleme tamponu içinde yeniden ekstre edilebilirAşama 3.1.6 'de elde edilen ekstrakt ile karşılaştırıldığında, başlangıç ​​denatüre edici olmayan ekstraksiyon uring.
  2. Affinity Yakalama
    1. Manyetik afinite orta ön yıkama. Hücre ekstreleri santrifüj edilirken bu yapılabilir.
    2. mıknatıs tüpü (ler) yerleştirin. boncuklar kaldırılacak depolama çözümü izin, saniyeler içinde tüpün tarafında birikir.
    3. tanelerine ekstraksiyon çözeltisi 500 ul ekle. orta hızda Kısaca vorteks karışımı (tekrar süspansiyon için yeterli). alt tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Aksi takdirde çözümler asgari taşınmasını sağlar. mıknatıs tüpler yerleştirin ve çözüm aspire.
      NOT: ayırt edici özelliklere sahip Manyetik medya ticari tedarikçiler geniş bir yelpazede temin edebilirsiniz. Sonuçlar boncuk büyüklüğü, bütünlüğü, yüzey kaplama ve antikor birleştirme kimyası da dahil olmak üzere, bu özelliklere bağlı olarak değişebilir. Side-by-siuygulamanızda de çalışmalar bir seçim ayıracı yerleşmeden önce tavsiye edilir.
    4. tekrar süspansiyon kısaca önceden yıkanmış afinite orta ve vorteks içeren bir 1.5-2.0 ml tüp açıklık hücre ekstresi aktararak afinite yakalama başlatın.
    5. çevirici tekerlek sürekli hafifçe karıştırılarak, 4 ° C 'de 30 dakika boyunca inkübe edin; boncuk inkübasyon boyunca asılı kalmalıdır.
    6. tüpün dibine tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Süpernatant aspire ve aşama 3.2.3 de tarif edildiği gibi, soğuk ekstraksiyon çözeltisinin 1 ml'si ile boncuk üç kez yıkayın. mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. çözüm çıkarın. sonraki çözümü eklemek ve tekrar devam edin. 2. Yıkama sırasında, pipetleme yeni bir mikrofüj tüpe birlikte boncuklar ve yıkama solüsyonu aktarın. Bu T ile inkübasyon için kullanılan tüpün duvarlarına adsorbe rastgele proteinleri tarafından, elüsyon noktada numune kontaminasyonu azaltıro özü hücre. 3. yıkamadan sonra, boncuklar altına tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj darbe bükülmüş kısaca olmalıdır. geri mıknatıs tüp yerleştirin ve kalan sıvı kaldırmak. Bu, elüsyon homojen hacimli olacaktır elüt örnekleri sağlanması önce çözeltinin son birkaç ul kaldırılmasını mümkün kılar. Aynı zamanda elüsyon çözümü artık yıkama seyreltilmiş olmayacak gibi sağım, etkili olacak sağlar; bu kalıntılar, aynı zamanda bir tuzu etkilerine katkıda (aşağıya bakınız), SDS-PAGE protein göçünü değiştirebilir.
      Not: sonrası bağlayıcı Yüzer kısımdan bir şişe 3.1.6 oluşturulan açıklık ekstresine karşılaştırma için kaydedilebilir. western blot ile. Sonuç hücre özütünden hedef proteinin tükenmesi derecesini gösterir.
    7. ya bir doğal veya denatüre edici bir şekilde elüte; alt uygulama 1 için en iyi strateji düşünün.
      NOT: Yerli elüsyon Strategie ayrıntılarıs kullanılan afinite etiketi (Tartışma bakınız) bağlıdır. Protein lekeleme 31 SDS-PAGE ile numunenin analizi ile takip edilen SDS-PAGE örnek tamponu ile elüsyon denatüre çoğu kullanıcı için, en pratik ilk yaklaşım olacaktır.
      NOT: elektroforez sistemi bağlıdır örnek tampon bileşimi kullanılır. Birçok laboratuarları süreksiz elektroforez ve Laemmli tampon sisteminin 32-34 yararlanarak, kendi Tris-glisin jeller attı. Ortak bir örnek tampon tarifi (1x) içerir:% 10 sukroz, 50 mM DTT,% 2 Blue SDS (w / v), 62.5 mM Tris-CI pH 8.8,% 0.0004 (ağırlık / hacim) bromofenol 31 (w / v) . Biz DTT atlar bir 1.1x stok hazırlanıyor öneririz. 500 mM DTT hacmi SDS-PAGE önce örnek eklenmelidir inci 1/10 (aşağıya bakınız). Pek çok ticari olarak temin edilebilir, SDS-PAGE sistemi de mevcuttur; Bu sistem özel numune tamponları içerebilir.
    8. serbest azaltmak için (indirgeme maddesi SDS-PAGE numune tampon eklemeboncuklardan antikor zincirlerinin) ve çalkalama ile oda sıcaklığında 5-10 dakika süreyle inkübe edin.
      NOT: Bu süpernatant içine çekilen proteinleri serbest, çoğu afinite bazlı etkileşimleri müdahale edecek. Daha kalıcı etkileşimler serbest bırakılması için yüksek sıcaklık yararlanabilir (tipik olarak 70 ° C yeterlidir).
    9. Toplamak ve süpernatant kaydedin. Numuneler kısa bir depolama için -20 ° (birkaç gün) dondurulabilir veya -80 uzun depolama ° C Analiz istendiği kadar.
    10. Standart teknikler 31 kullanılarak protein boyama ile takip edilen SDS-PAGE numune, öznenin. MS numune bileşimi 1 karakterize etmek için kullanılabilir. Bağımsız protein bantları tanımlanması için eksize edilebilir ya da tüm örnek, yalnızca kısa bir süre için (jele 4-6 mm) örnek elektroforeze ve bir araya numunedeki tüm proteinlerin işlenmesi tek bir analizde, özelliği edilebilir "jel yatağından. '
      NOT: inisiyatif önce DTT ekleting elektroforezi. Planlama MS geçmek için, numuneler elektroforez 35 sonra alkillenebilir; Bununla birlikte, önceden elektroforez 36 alkillemek için sıklıkla daha uygundur.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, panel ben cryomilling ve manyetik boncuk örnek kalitesini artırmak için birlikte çalışabilir olduğunu göstermektedir. Paneller IA-Cı afinite yakalama için kullanılan çözünmeyen bir ortam ihtiva eden malzemenin geri Proteomun 19 etkileyebilir göstermektedir. İlgili protein saflaştırılmış FLAG-etiketli bakteriyel alkalin fosfataz (BAP), insan hücre ekstreleri halinde spaykı. BAP özel etkileşim insan proteinleri copurify beklenmemektedir. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile değerlendirildiği copurifying proteinlerin imzası kullanılan akışkana bağlı olarak değişmektedir. Mikron ölçekli manyetik boncukları spesifik olmayan protein adsorpsiyon nispeten düşük bir seviyesini gösteren, en temiz profili gösterdi. Paneller numarası ve IE hücre parçalama yöntemi, aynı zamanda geri Proteomun etkileyebilir göstermektedir. Resim örnekte, bir endojen protein sitesini (37 kompleks), afinite captu tabi tutuldu vecyromilled veya sonike hücreden yeniden 19 ayıklar. Hücre ekstresi cryomilled hücre tozundan üretilen zaman daha az yüksek kütle kirleticiler gözlendi.

endojen protein kompleksleri incelemek için afinite yakalama kullanarak bir meydan okuma yanlış pozitif (FP) ilgi proteinin iyi niyetli fizyolojik inter aktörlerin ayırt etmek zor olabilir olmasıdır. FP ve / veya ilgi duyulan kendisinin proteine ​​spesifik olmayan tüpler ve kaplar adsorpsiyon, afinite ortamı antikor veya afinite ligandı dahil olmak üzere birçok kaynaktan ortaya çıkabilir. Sonuç olarak, kayda değer çaba yakalama işlemi optimize tahsis edilmelidir. FP tespiti farklı araçlar çok sayıda deneysel 38-40 ve hesaplamalı farklı artıları ve eksileri ile 41-43, her yaklaşımları da dahil olmak üzere, geliştirilmiş edildiği için merkezi bir sorun olmaya devam etmektedir. Kendi deneylerde daha önce F bir model belirtildiğiP proteini kontrol hücre özleri ile α-FLAG manyetik ortamın kuluçkadan sonra elde edilen, bu 3xFLAG-etiketli proteinlerinin varlığında elde edilen model farklı olduğu bağlanma. Bundan başka, bu FP 3xFLAG peptid 7 ile inkübasyon yoluyla ortamdan serbest olabilir. Bu gözlem, fırsatçı aynı kökenli epitopunun yokluğunda α-FLAG paratop fps bağlanması ile tutarlıdır. birçok çalışma afinite yakalamak için sahte bir kontrol olarak etiketsiz 'ebeveyn hücre hattı' kullanmak beri bu FP kökenli doğasını anlamak önemlidir; bu kontroller nedenle etiketli protein ile etkileşimleri özgünlüğünü belirlemek için uygun olmayabilir. arka plan belirlemek için antikor paratoplar işgal bizim afinite ortamı katkıda ya da değil, biz 3xFLAG ve α-BAYRAK manyetik ortam ve varlığında HEK 293T hücre özleri (hiçbir takılı protein ifade) veya yokluğunun kullanarak sahte afinite yakalama deneyler yaptılar bağlanmapeptid başak-in. Sonuçlar, Şekil 1, panel II'de gösterilmiştir. Kısaca, α-FLAG manyetik ortam hücre özütlerinde inkübe edildi, 30 dakika boyunca, pH 7.4, 20 mM HEPES-Na Triton X-100 V ila 500 mM NaCl ve% 1 v / ihtiva eden (≳10 mg / ml toplam protein). Ortam daha sonra rekabetçi bir denatüre edici elüsyon elde etmek α-FLAG paratop yerel olarak veya SDS-PAGE numune tampon maddesi ile bağlı olan herhangi bir protein yer değiştirmesi için 1 mg / ml 3xFLAG peptidi ile enkübe edilmiştir. Hücre ekstreleri ml 1 ug / ve 3xFLAG peptid 10 ug / ml ile tutturuldu ek olarak, aynı deney gerçekleştirildi. Yıkanarak ayrılan bütün fraksiyonlar, SDS-PAGE ve gümüş lekeleme tabi tutuldu. Bu kendi aynı kökenli epitopa yokluğunda, α-FLAG ortamı 3xFLAG peptidi ile elüte edilebilir plan proteinleri taranabilir düzeyde bir yakalama yok olduğu görülmektedir - Şekil 1-II ile verilen örnekte, baskın türler 37 ile gözlenmiştir 50 kDa. ile elüt desenSDS-PAGE örnek tamponu ilave belirgin türleri ile, karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, 1 ug / ml 3xFLAG peptid varlığında AP için eğilim aracı bağlanma tespit seviyesinin altında elimine edildi ve ya doğal ya da denatüre elüsyon fraksiyonlarında gözlenmedi. Bu sonuç, 3xFLAG / α-Flag M2 olduğu gibi, boş antikor paratoplar kendi aynı kökenli epitopunun yokluğunda seçici olmayan olabilir ve hatta yüksek afinitede epitop bağlanan antikorların afinite yakalama sırasında elde edilen proteomu önemli ölçüde katkıda düşündürmektedir eşleştirme. Ayrıca, çoğunlukla, spesifik olmayan azaltmak için seçilen yüksek tuz kullanılarak, çok katı koşullar, antijen / antikor etkileşimi olmadan etkili olabileceğini suggestd. Takip biz SDS-PAGE yanı sıra nicel MS (Şek. S1) tarafından benzer bir deney de dahil olmak üzere analizi yapıldı. sayısal 347 Proteinlerin, her proteinin bir (yanlış disko kaydetmek görülmektedirÇok oranı =% 1; Bir 3xFLAG peptid kontrol örneği çivili ile karşılaştırıldığında Tablo S1) 3xFLAG etiketli yem protein ile ilişkili bulunmuştur. Bu sonuçlar, deneylerde proteinlerin çoğunluğu etiketli protein ile birlikte saflaştırmak için muhtemel olan veya boş α-FLAG paratoplar yan ürünlerinin hedef dışı olduğunu gösterir. Deneyimlerimize göre, yüksek sinyal-gürültü afinite yakalama sonucu, keskin, bol ve yaklaşık stoikiometrik bantlar gibi diğer sönük bant arka plan boyaması bir yetersizlik ayrık bir modeli ile SDS-PAGE ve protein boyama örneklenmiştir; Bu prensibin bir çok örneği, referans 11'de görülebilir.

Cryomilling zaman (önerilir) PTFE yalıtkan kullanmak için güdü, öğütme sırasında kavanozun ısınma oranını azaltmak öğütme işlemi sırasında tekrarlanan LN 2 soğutma yükünü hafifletmek ve buz derecesini azaltmak içinkavanoza oluşumu. Bu tutarlı bir freze performansı kolaylaştırır ve hücre tozu işleme kolaylaştırır. Örnek yalıtkanlar referans 27 (diskleri) bulunan ve Şekil 2, aşağıdaki (kol ve-diski) tasvir edilebilir.

figure-results-1
Şekil 1: Temsilci Sonuçlar seçin. (I) 'in bu panel referans 19 modifiye edilmiştir. Coomassie Blue SDS-poliakrilamid jel boyandı. (SOL) Mikron ölçekli manyetik boncuk hedef dışı agaroz tabanlı medya daha bağlayıcı düşük gösteriyor. (A), manyetik boncukları; (B) geleneksel agaroz; (C) demir emdirilmiş (manyetik) agaroz; Her anti-FLAG M2 antikorlara bağlı olan ve FLAG etiketli bakteriyel alkalin fosfatazı yakalamak için kullanılan (BAP; etiketli) cryomilled HEK-293 hücrelerinden üretilen özler içerisine arttı. Agaroz bazlı saflaştırmaspesifik olmayan adsorpsiyon (etiketlenmemiş grupları) daha yüksek seviyeleri göstermişlerdir. endojen protein kompleksi saflaştırmak için kullanıldığında cryomilled HeLa hücrelerinden üretilen (sağ) özler sonikasyon ile üretilen daha antikor bağlanmış manyetik boncuk üzerine düşük hedef dışı adsorpsiyonu sergiler. LAP-etiketli 44 RBM7 SONRAKİ kompleksi 19,37 (D) saflaştırmak için poliklonal anti-GFP antikorlara bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak çekilen afinite cryomilled bir toz elde edilen ekstre olmuştur; (E) ekstreler sağlam hücrelerinin sonikasyonu ile üretilir. dikey siyah çubuk yüksek kitle non-spesifik interaktörler sonication tarafından hazırlanan numunede zenginleştirilmiş bir biçimde gözlenir jel bölgesini vurgular. siyah oklar beklenen spesifik inter aktörlerin belirtilen (etiketli). şerit D ve E ~ 50 kDa gözlenen bantlar lama IgG ağır zincirlerine bağlanabilir. (II) gümüş SDS-poliakrilamid jel boyandı. (Std.) Bir sahte afinite yakalama HEK-293 üzerinde yapılanT hücresi standart bir şekilde ayıklar. yakalanmasından sonra, bağlanmış malzeme elüsyon (N) 1 mg / ml 3xFLAG peptit veya SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde elüsyon denatüre (D), denatüre edici olmayan elüsyon yoluyla elde edilmiştir; Std olarak (PB 1). ancak 3xFLAG peptid afinite ortamı üzerinde α-FLAG paratoplar engellemek için 1 ug / ml ekstraksiyon çözeltisi dahil edilmiştir; PB 1 Ama 10 ug / ml 3xFLAG peptid varlığında (PB 10). IgG ilgili bantları ve 3xFLAG peptid etiketli. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: Kol-ve-pak PTFE yalıtkan. 250 ml'lik bir PTFE kavanoz gösterilir (1). 50 ml'lik paslanmaz çelik öğütme kavanoz (2) PTFE kavanoz (3) içinde uyuyor ve sağlarfırsat döngüleri arasındaki değirmen içinde yüklü freze kavanozu bırakmak. Bir üst PTFE yalıtkan cin (2) kelepçe montaj ve kavanoz kapağının arasında kullanılır. Yüklü kavanoz ve yalıtkan düzeneğini (3) soğutmak için, LN 2 kavanoz çevreleyen izolatör gövdesine doğrudan ilave edilir. freze sonraki döngü sonra başlatılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

reaktif önerilen Konsantrasyon notlar
Sodyum klorit 0.1-0.5 M Yüksek konsantrasyonda (> 300 mM) total protein çıkarılmasını artırmak ve düşük arka plan tutmak eğilimindedir, ancak bazı başka türlü istikrarlı Inter uzaklıkta şerit olabiliraktörler. 150 mM altındaki konsantrasyonlar spesifik olmayan arka plan azaltılması tipik olarak etkili değildir.
amonyum asetat 0,2-2 M İki tampon oluşan bir tuz, bir nötr pH değeri çözelti 57 elde edilir. Daha yüksek konsantrasyonları bazı protein kompleksleri stabilize eder. Asidik çözümler amonyak kaybı nedeniyle eski, yanlış depolanan kristalin stoklarından neden olabilir. Ek pH tamponu ya da tuzlar, amonyum asetat içeren ekstraksiyon gereklidir. Elde edilen sonuçlar modüle NaCl ile kombine edilebilir.
Tween 20 % 0.1 h / h Bir non-iyonik bir deterjan 58; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi.
Triton X-100 0.5-1% h / h Bir non-iyonik bir deterjan 58; tipik olarak NaCl veya NH4 CH3 CO 2H ile kombine
CHAPS 5 mM Bir zvitteryonik deterjanın 58 </ Sup>; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi.
Sarkosyl 1 mM Arka plan azaltır ve potansiyel olarak ikili bağlantı açığa kararlı kompleks bileşenler kapalı şerit olabilir anyonik deterjan 58; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi.
Tris-CI 20 mM pKa, 4 ° C, 25 ° C 'de 8.1 8.8.
(PH 8.0) içinde
HEPES-Na 20 mM pKa, 4 ° C, 25 ° C 'de 7.5 7.8'e a. Veya NaOH KOH tuzuna bağlı olarak, pH dengeleme için (örneğin NaCl, KCI, veya CH3 CO2 K) özümleme kullanılır.
(PH 7.4)

Tablo 1: protein kompleksleri saflaştırılması için önerilen bir kaç reaktifler yararlı. Bu tablo, lTavsiye edilen çalışma konsantrasyonlarda insan hücre çizgilerinden saflaştırılması protein kompleksleri için yararlı olan bazı reaktifler, ists. Tipik bir özütleyici formülasyon bir pH tamponu, bir tuz ve bir deterjan 1,11,24,45-48 içerir. En iyi uygulama istenen sonucu verir reaktiflerin az karmaşık kombinasyonunu tespit etmektir.

figure-results-3
Şekil S1: Mix yanlış pozitiflerin saflaştırılması (harita görüntüleme) SILAC analizinden sonra. I. Şematik: Bu deneyde sırasıyla Ağır ve hafif etiketli HEK-293T hücreleri 7 saflaştırılmıştır (pLD401 eksprese) ORF2p protein kompleksleri 3xFLAG etiketli. Işık etiketli hücre ekstraktı rekabetçi inhibe ederek 3xFLAG etiketli ORF2p afinite yakalama önlemek için 3xFLAG peptid ile çivili edildi; Bu olmayan öz dirençli oluşabilir protein bağlanmasını bloke beklenmemektedirManyetik orta ya da antikorun olmayan paratopic yapılar ile otomatik. Manyetik boncuklardan yıkanmasından sonra, ağır ve hafif örnekleri karışık sonrası saflaştırma ve kantitatif MS ile analiz edildi numune ya da bağlantılı proteinler parçasını belirlemek için, (39-SILAC MAP); Tablo S1 bulunan başka metodolojik ayrıntı. II. Gümüş hafif ve ağır etiketli malzeme benzer sonuçlar (H L karşılaştırın) elde olduğunu gösteren jelini ve 3xFLAG başak in (II) varlığında gerçekleştirilir saflaştırma rekabetçi inhibe oldu. Aşağıda, Tablo S1 de tarif edildiği gibi, karışık H ve önceden jel bazlı proteomik analizi LI kısımları kapsayan Coomassie Mavi G-250 ile renklendirilmişlerdir jel yatağından. Bu rakamın büyük bir sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.

Tablo S1:MAP-SILAC. Bu levha Şekil S1 açıklanan MAP-SILAC deney yürütülmesi üzerine elde edilen veriler içeriyor. Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu üç protokol (1), cryomilling katı hal kırılması için hücreleri hazırlamak (2) bir planeter bilyalı değirmende kırılma elde etmek ve (3) ile kompleks yakalama ilgili bir proteini afinite hücre toz özler üretmek için birlikte çalışır fizyolojik Uygulayıcılar. Birçok farklı hücre parçalama teknikleri kırma etkisi, kesme ve / veya basıncı kullanılarak mekanik / fiziksel yaklaşımlar, yanı sıra kimyasal / enzimatik yaklaşımlar, farklı artıları ve eksileri 49,50 ile her dahil mevcuttur. Her araştırmacı hücre kırılması ve protein ekstraksiyonu için seçilen herhangi bir yaklaşım (aşağıda açıklanmıştır) ampirik optimizasyonu gerektiren önyargıları 51,52 tanıtmak için muhtemel akılda tutarak, onların analizleri için en uygun yöntemler keşfetmek için teşvik edilmektedir. Mekanik yöntemler protein kompleksleri bozabilir yüksek ısı ve / veya kesme kuvvetlerine neden olabilir. Cryomilling t örneklerin LN 2 soğutma istihdam sayesinde ısıtma etkilerini önlersürecin kendisi süresi. Planet bilyalı değirmenler parçacık büyüklüğü azaltma 53,54 bileşenleri olarak, kesme stresi dahil olmak üzere etki ve sürtünme kuvvetleri, dayanmak anlaşılmalıdır. ayarlarda biz protein komplekslerinin dejenerasyonu gözlenen değil bildirdi. Nitekim biz çıkarılan ve 'yumuşak' deterjan bazlı lizis 7 kullanan hazırlıkları daha yüksek spesifik aktivite sergileyen görünüşte sağlam ~ 50 MDa nükleer gözenek kompleksleri 11 ve enzimatik olarak aktif retrotranspozonlar erişebilirsiniz. Hücre lizizi kimyasal / enzimatik yöntemler hücre içeriği, bir in vitro ortamı hücre zarları ve yapısal makromoleküllerin bozulması destekler ancak protein kompleksinin bütünlüğünü korumak için uygun olmayabilir (ES salınan ama bunlarla sınırlı muzdarip ) ilgi. Sık sık, ne komplekslerinin bileşenleri ilgi protein ile oluşturulan, ne de koşullar hedef kompleksleri stabilize etmek için gerekliönceden bilinen. Katı hal öğütme en büyük yararı, kırılması ve çıkarma kaynağı malzeme yönlendirilir, bağlanmamış olan, ilave sıvının serbest hazırlanabilir (veya aşağıdaki -80 ° C'de) içinde saklanarak, topladığı ve uygun isteğe bağlı deney için alınacak olduğu; örneğin, afinite yakalama in vitro koşullarda optimize araştırmak için. Protein etkileşimleri dolayısıyla özütleyici hacmini fizyolojik etkileşimlerini muhafaza etmek için avantajlı olabilir en aza indirerek, yüksek konsantrasyonda 55,56 en stabildir. Öte yandan, pratik hususlar vardır - protein kompleksleri afinite ortamı ile hedef kompleksleri karıştırmak için, hücre dışına ve çözünmez agregaların ücretsiz ağdalı olmayan sulu fazda, içine bölümlenmiş gerekiyor. Ayrıca, in vitro ortamda (pH, tuz konsantrasyonu, vb) üzerinde bir miktar standardizasyon ve kontrol sistemli ve yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Biz pr özler bulmakseyreltme aralığında oduced 1: 4-1: 9 (w: v) kaliteli sonuçlar veren pratik ve teorik endişeler, tatmin. Buna ek olarak, orta ihtiyaçlarını afinite hücre ekstresi uygun oranı belirlenir. Bu yakınlık ortamın değişen miktarlarda özler titrasyon ile deneysel olarak yapılır ve aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınan, deney sinyal-gürültü oranı saptanabilir etkiler olabilir. Hedef proteinin mükemmel tükenmesi tipik haliyle, hedef proteinin eriyebilen fraksiyonunun ≥70%, ancak>% 90 tercih edilir ve ekstraksiyon şartlarına dikkatli parametre ile elde olabilir. Gibi pek çok pratik hususlar referans 1 kaplıdır. Ev yapımı alternatifler canlı olmasına rağmen paramanyetik boncuklar, özel bir mikrosantrifüj tüp tutucu neodimyum mıknatıslar kullanılarak manipüle. tutucu içine yerleştirilen tanecikler manyetik alanın etkisi altında lastiğin yan toplanır. Çözümler sonra di olmadan kaldırılmış olabilirboncuk sturbing.

Burada kullanılan planet bilyalı değirmen ile geliştirilen sunulan cryomilling protokolünün bir sınırlama, (Malzeme tabloya bakınız) malzemenin minimum miktarda etkili bir tesis için gerekli olan bu cihaz (> 1 g) kullanılarak hücre tozu geri olmasıdır. Bu gibi miktarlar, kolayca çok sayıda mikrop, hücre çizgileri ve model organizmalar ile elde edilir, ve aynı zamanda sık sık laboratuar hayvanları eksize dokuları ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bazı hücre çizgileri az olabilir bolluğu ve hayvan dokularında büyümesi çok zor olabilir. malzemenin daha küçük miktarları nispeten elde edilen bir toz incelik kurban olmasına rağmen, potansiyel olarak daha küçük kaplar kullanılarak diğer aygıtları kullanarak öğütülebilir. Buna ek olarak, mekanik öğütme cihazların maliyeti, bazı laboratuarlarda için çok pahalı olabilir olabilir. Bir haşere kullanarak el ile en ekonomik bir de dahil olmak üzere, alternatif kurulumları 14-19 bir dizi kullanılarak elde edilebilir Cryomillingle ve harç, kırılma verimliliği önemli ölçüde düşer rağmen. Afinite yakalama protokoller genellikle bu nedenle maksimum protein çözeltisi içine ekstrakt edildikten ve hedef protein kompleksleri yakalanması için maksimum potansiyel kolaylaştırmak için hücre lisis oluşumunun bir yüksek verim için amaçlanmıştır. Diğer yandan, bu tüp ekleme maya için gösterilmiştir maksimum liziz nitro biyokimyasal etki 57,58 maksimal ile eşit olmayabilir ayıklar. Biz şu ana kadar test edilen sistemlerde bu tür sorunları görülmez ve cryomilling bu nedenle kasıtlı eden hücre kopması sınırlamamaktadır. In vitro enzimatik tahliller için optimize Yine de, bu olasılığı akılda tutulmalıdır. cryomilling hücrelerinin kırılması için çok etkili bir yöntem olmasına rağmen, homojen olmayan agrega zaman görsel muayene ile gözlemlenen, çünkü, sonication sınırlı bir miktarda, genellikle memeli dokularında üretim homojen bütün hücre hülasaları yarar: tipik haliyleekstraksiyon koşulları tuzu (100-300 mM) ve iyonik olmayan bir deterjan (% 0.1-1 h / h) konsantrasyonları düşük-orta kullanılmıştır. bu agregaların varlığı sonraki afinite yakalama verimini ve / veya kalitesini düşürebilir görülmektedir, çünkü biz rutin (onlar çıplak gözle görülmez bile) onları dağıtmak için sonikasyon uygulamak. Agrega önce öğütülmüş maya hücreleri 58 özütlerinde bildirilenlere benzer aglomere membran fragmanları ile tutarlıdır. Sonikasyon için de aynı şekilde bu protokolü uygulanan sonikasyon derecesi parçası DNA kayda değer değildir, DNA kesme ve çözelti içine kromatin parçaları serbest bazı protokoller kullanılır. ilgi konusu proteinine karşı mükemmel bir afinite ligandı veya antikorun sınırlı sayıda (ya da yüksek maliyet) başka engel olabilir. piyasada mevcut afinite reaktifler geniş bir dizi model organizma genomik etiketleme ya da tr mükellef olduğunda kaldıraçlı olabilirafinite etiketli füzyonları olarak ilgi konusu olan proteinlerin ekspresyonunu ektopik ifade vektörleri ile ansfection. Ancak, özel antikorların üretimi artan mümkün hale gelmiştir ve her ikisi de poliklonal ve monoklonal antikorlar, afinite yakalama uygulamalarda mükemmel gerçekleştirebilir. Bunlar pek çok unsuru da referans 1 daha detaylı olarak ele alınmıştır.

Afinite ortamın hücre parçalama yöntemi ve bir seçim sonuçları nasıl etkilediğini örnekleri, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Farklı ekstraksiyon ile sağlanan etkilerin örnekleri, referans 1,11,24 görülebilir. Bu ve diğer deney parametrelerinin zor hekimlerini ayırt hale afinite yakalama kalitesini etkileyebilir, çünkü "kordon proteomlarda" ve hesaplama yaklaşımlar depoları spesifik olmayan kirletici FP 40-43 belirlemeye yardımcı geliştirilmiştir ortadan kaldırmak için. Bununla birlikte, bu tür yaklaşımlar sadece substitSınırlı ölçüde 59 optimal numune hazırlama ute. en iyi uygulamaları gözlemlemek ve ampirik afinite yakalama deneyi, aşağı analizler için daha aşağıda tartışılan en kaliteli örneklerini sağlayacaktır optimize. örnek saflığı artırabilir kolay uygulanabilir pratik yerli ayırmaktır. Ana yıkama en çok fazla deney için sağlam afinite izole edilmiş bir protein kompleksi elde etmek için kullanılır; sık sık örnek saflığı artırır gibi, aynı zamanda bu nedenle tek başına kullanılabilir. Şekil 1, panel II gösterildiği gibi, ancak, Örnek saflığını geliştirmek için ana elüsyon kabiliyeti, hücre özü hedef proteinin bolluk afinite ortamın miktarına doğru titrasyon bağlıdır - Orta fazla olduğunda , boş paratoplar doğal akıtılan fraksiyonları gözlenebilen AP proteinlerinin dışı hedef birikimini izin verebilir. Burada açıklanan reaktifler ve prosedürler kullanılarak, bu HBizim deneyim olarak deneylere FP tek en büyük katkıyı bir kez canlı hücrenin bağlamında kaldırılır takılı protein kendisi olduğunu. (Şek. 1.II ve Şek. S1). Bu gibi durumlarda, antijen yokluğunda alakasız Proteomlar elde parental hücre hattı kontrol pratik değere sahip; aynı şekilde hedef antijen şey ama yoksun olan etiket okunur veya başak-denetimler için. Bu nedenle, doğrudan sayısal MS kullanarak post-lizis protein etkileşimleri birikimini ölçen I-KİR 7,38, ne zaman pratik uygulama. protokol Aşama 3.2.7 belirtildiği gibi, ana elüsyon için prosedürler kullanılmıştır afinite sistemi detayları ile değişecektir. Ana yıkama en çok eğilim aracı kompleksin serbest, etiketin etiketli protein kompleksi ya da proteolitik yarılma rekabetçi şekilde çıkarılması ile elde edilir. küçük epitop etiketleri oluşan çeşitli afinite sistemleri fo, mevcutR epitop kendisi etiketlenmiş protein kompleksleri 60 rekabet elüsyon için yararlı bir peptid olarak mevcut olduğu. Aynı şekilde, birçok proteazlar füzyon proteinleri 61 özel stratejik afinite yerleştirilen soydaş siteleri yarmak için kullanılabilir etiketli vardır. seçilen afinite sistemlerinin özelliklerine bağlı olarak, uygun bir yıkama düzeni kabul edilebilir.

Genellikle, elde edilen sonuçların kalitesi önemli ölçüde numune hazırlama kalitesi ile etkilenecektir. Bakım ve hassasiyet korurken mümkün olduğu kadar çabuk bu protokollerin her adımda dikkatli ve hassas çalışmak ve önemlidir. Her manipülasyon etkinliğini anlamak için her adımda ilgilenilen proteinin bölümleme izlemek için tavsiye edilir. Örnek: söz konusu hücre ya da dokuda ilgili protein kadar bol? Belki çalışmada (ve kompleksleri) kapsamında, protein kütlece karakterize zor olacakDüşük bolluk nedeniyle spektrometresi. Saflaştırılmış Kompleksi (yaklaşık aralığı nanogram), genel protein lekeleme ile tespit ise, kütle spektrometrisi başarılı muhtemeldir. ilgi yakalanan proteinin, sadece duyarlı geliştirilmiş kemiluminesans batı lekeleme (yaklaşık pikogram aralık) tarafından tespit edilebilir varsa, kütle spektrometresi etkili olabilmesi için daha az olasıdır. İlgili protein hücre içinde bol miktarda olsa bile, hücre özü ne kadar bol üretilir? çözüm protein bölümü mı yoksa pelet var? İkincisi ise, yeni bir çıkarma çözüm düzeltebilir bu icat edilebilir. Hücre ekstresi için eğilim aracı ile birleştirilir sonra, ne kadar etkili proteinin yakalanır? Protein sonraki yıkar bağlı kalacağı mu? Peki ya diğer copurifying proteinler hakkında? protokol uygun adımları her numunenin bir bölümünde kaydederek Bu sorular havaalanı protein karşı Western blotting ile tipik haliyle, cevap olabilirya da genel bir protein boyama, ancak diğer deneyler de uygun olabilir. bir trade-off bir özelliği ya da diğer maksimize yapılacak olabilir ancak her adımı en iyi duruma getirme, yakalanan komplekslerin verim ve saflık artıracaktır.

Birçok araştırmacı için afinite yakalama tipik bir uygulaması, ilgi konusu olan proteinlerin az sayıda in vivo uygulayıcılara adayı tespit etmektir; Bu adaylar genellikle fiziksel interactors biyolojik önemini göstermek için in vivo dik yaklaşımlarla doğrulama tabi tutulur. Affinity yakalama ayrıca, bir (neredeyse) proteom çapında gözlenen proteinleri copurifying in vivo komplekslerinde varsayılan ilişkin hesaplama çıkarımlar kolaylaştıran listeleri oluşturmak için yüksek verimli çalışmalar tarafından istihdam edilmektedir. Bu tür çalışmalar, çok sayıda örnek literatürde bulunabilir. Bu yaklaşım keşfetmek insanın lehine verilen herhangi bir hedef için yakalama koşullarının optimizasyonu foregoesy hedefler; Böyle, olayla kompleksleri olarak kendilerini nadiren herhangi bir numunede tamamen sağlam ve son derece saf alınır. Bunun yerine, bir çok farklı afinite çekilen örnekler arasında görülen bileşimler kısmi örtüşmeler çıkarımlar 42 bir temel olarak kullanılır. Her iki yaklaşım da interaktom anlayışımıza değerli verileri katkıda bulunur. Bununla birlikte, afinite yakalama biri büyük yararı sık sık, sağlam ve yüksek derecede saflaştırılmış çabalar prosedürünü optimize etmek için yapılması kaydıyla kompleksleri elde etmek için fırsat sunuyoruz olmasıdır. Biz, yaklaşım geleceği fizyolojik interactors ve daha aşağı biyokimyasal, enzimolojik daha sık kullanılması ve yapısal çalışmaların gamının daha doğru değerlendirilmesi için kolay ve endojen protein kompleksleri 11 yakalanmasını optimize verimliliğinin arttırılması yatıyor inanıyoruz örneğin, 7,9,23 başvuruyor.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz mükemmel teknik destek için yaptığı paha biçilmez MS enstrümantasyon tavsiye, destek ve erişim yanı sıra Bayan Kelly R. Molloy Profesör Brian T. chait teşekkür ederim. Biz kopya düzenleme ile destek için Sayın Kelly Çıplak teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe P41GM109824, P41GM103314 ve P50GM107632 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Büyüme ortamı ve hücre kültürleme aletleriDondurulmuş hücreler üretmek için (I)
500 cm2 kültür kaplarıCorning431110Dondurulmuş hücreler üretmek için (I)
Büyük beher (1-2 L)Donmuş hücreler üretmek için (I)
Dikdörtgen buz tavası Fisher Bilimsel 13-900-747Dondurulmuş hücreler (I) ve kriyofrezeleme (II)
Fosfat tamponlu salin (PBS)Donmuş hücreler üretmek için (I)
Büyük hücreli sıyırıcılarFisher Scientific 08-100-242Donmuş hücreler üretmek için (I)
Sıvı azot Dondurulmuş hücreler (I), kriyofrezeleme (II) ve afinite yakalama (III) üretmek için
50 ml konik tüplerCorning352098Dondurulmuş hücreler (I) ve kriyofrezeleme (II) üretmek için
20 ml Luer kilit şırıngasıDonmuş hücreler üretmek için (I)
Leur kilit şırınga kapaklarıwww.dymax.comT11182Donmuş hücreler üretmek için (I)
Soğutulmuş Dondurulmuş hücreler üretmek için (I)
50 ml tüp rafı, 4 pozisyonDondurulmuş hücreler (I), kriyofrezeleme (II) ve afinite yakalama (III) üretmek için
Strafor kutuDonmuş hücreler (I), kriyofrezeleme (II) ve afinite yakalama (III) üretmek için
Planet bilyalı değirmen, PM 100 Retsch20.540.0001 Kriyofrezeleme için (II)
Paslanmaz çelik freze kavanozu, 50 ml Retsch01.462.0149Kriyofrezeleme için (II)
Paslanmaz çelik freze bilyaları, 20 mm & Oslash;  Retsch05.368.0062Kriyofrezeleme için (II)
Kapak contası: PFA kapsüllü yaylı enerjili conta, 2,62 mm 44,63 mm   www.marcorubber.comT1044-2.62x44.63Kriyofrezeleme (II)
mini-LN2 sürahiyapımıiçin bakınız Ref 19Kriyomilling için (II)
250 ml PTFE kavanoz izolatörü (isteğe bağlı)ev yapımıThe Rockefeller UniversityCryomilling (II) için; Rockefeller Üniversitesi Yüksek Enerji Fiziği Enstrüman Mağazası tarafından üretilebilir veya istek
üzerine sağlanan tasarım planlarıPTFE disk izolatörü (isteğe bağlı)ev yapımıRockefeller ÜniversitesiKriyomilling için (II); Rockefeller Üniversitesi Yüksek Enerji Fiziği Enstrüman Mağazası tarafından üretilebilir veya istek üzerine sağlanan tasarım planları olabilir.
5 bar/500 kPa basınç tahliye vanası (opsiyonel)http://www.leeimh.com/558 serisi çek valfKriyofrezeleme için (II)
1.5-2 ml mikrofüj tüpleriAfinite yakalama için (III)Afinite yakalama için
(III)
EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl tabletleriRoche Uygulamalı Bilimler11873580001Afinite yakalama için (III)
Vorteks karıştırıcıAfinite yakalama için (III)
Buz kovasıAfinite yakalama için (III)
Mikrotip sonikatörü, Q700QsonicaQ700Afinite yakalama için (III)
düşük yoğunluklu 1/16" mikro uçlu probQsonica4717Afinite yakalama için (III)
Tezgah üstü soğutmalı mikrosantrifüjAfinite yakalama için (III)
Dynabeads M-270 Epoksi ThermoFisher14302DAfinite yakalama için (III)
Dynabeads ev yapımına bağlı antikor veya afinite ligandıAfinite yakalama (III) için; referans 19'a bakın
Afinite yakalama için (III)
Neodimyum mıknatısYaşam Teknolojileri123-21D Benzeşim yakalama için (III)
SDS-PAGE numune tamponu (indirgeyici ajan yok)Afinite yakalama için (III)
DTTAfinite yakalama için (III)
SDS-PAGE sistemiAfinite yakalama için (III)
SDS-poliakrilamid jelAfinite yakalama için (III)
Protein LekesiAfinite yakalama için (III)
santrifüj ev Komple Örnek döndürücü 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
  2. Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
  3. Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
  4. Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  5. Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
  6. Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
  7. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
  8. Liu, J. -J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -Y., Ke, A., Wang, H. -W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
  9. Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
  10. Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
  11. Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
  12. Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  13. Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  14. Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
  15. Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
  16. Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
  17. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
  18. Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
  19. Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. 0 (0), 1-6 (2012).
  20. Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
  21. Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
  22. Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
  23. Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
  24. LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
  25. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells. , John Wiley & Sons. (2011).
  26. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Basic Cell Culture Protocols. 946, Humana Press. (2013).
  27. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
  28. Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
  29. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. , 1–3at Retsch GmbH. http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/ (2014).
  30. Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  31. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
  32. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
  33. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
  34. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A. N., Padovan, J. C., Zhang, W. MALDI Sample Preparation. , Available from: rockefeller.edu at http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html (2006).
  37. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  38. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
  39. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
  40. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
  41. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
  42. Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
  43. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
  44. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1(2005).
  45. Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839(1999).
  46. Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
  47. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
  48. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
  49. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
  50. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
  51. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
  52. Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679(2016).
  53. Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
  54. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201(2012).
  55. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345(1982).
  56. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  57. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, City of Hope. (2003).
  58. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , Retsch GmbH. (2005).
  59. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
  60. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
  61. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells
Posted by JoVE Editors on 1/20/2017. Citeable Link.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:

  1. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  2. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  3. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  4. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  5. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  6. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  7. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  8. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  9. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  10. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  11. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  12. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  13. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  14. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  15. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  16. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  17. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  18. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  19. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  20. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  21. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  22. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  23. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  24. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  25. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  26. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  27. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  28. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
  29. Williams, R. J., & Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911–1912 (1932).
  30. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).
  31. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  32. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  33. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  34. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).

to:

  1. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1–3at <http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/> Retsch GmbH (2014).
  2. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  3. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  4. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  5. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  6. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  7. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  8. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  9. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  10. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  11. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  12. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  13. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  14. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  15. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  16. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  17. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  18. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  19. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  20. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).
  21. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  22. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  23. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  24. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  25. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  26. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  27. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  28. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  29. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  30. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  31. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  32. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  33. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).

Etiketler

Antikor Ba l Paramanyetik BoncuklarH cre Ekstrakt Haz rlamamm nopresipitasyon Tekni iMikron l ekli Manyetik BoncuklarProtein K tle SpektrometrisiEndojen Protein KompleksleriH cre Lizis Y ntemleriAfinite Ortam Y kama

İlgili makaleler