Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

12.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54532

⸱

9 Aralık 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Özet

Hipoksi, klinik gözlemler ve in vitro verilerle Ewing sarkomunun (ES) metastazında rol oynamıştır, ancak pro-metastatik etkisine dair doğrudan kanıtlar eksiktir ve etkisinin kesin mekanizmaları belirsizdir. Burada, tümör hipoksisinin ES yayılımı üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve ilgili altta yatan yolların araştırılmasına izin veren bir hayvan modeli sunuyoruz. Bu yaklaşım, ES hücrelerinin ortotopik ksenogreftlenmesi ve arka bacak iskemisini indükleyen femoral arter ligasyonu (FAL) olmak üzere iki iyi bilinen deneysel stratejiyi birleştirir. İnsan ES hücreleri, SCID/bej farelerin gastroknemius kaslarına enjekte edildi ve primer tümörlerin 250mm3 boyutuna kadar büyümesine izin verildi. Bu aşamada ya tümörler eksize edildi (kontrol grubu) ya da hayvanlar tümör hipoksisi oluşturmak için FAL'a tabi tutuldu, ardından 3 gün sonra tümör eksizyonu yapıldı. FAL'ın etkinliği, tümör dokusunda hipoksiprob-1'in bağlanmasında önemli bir artış, ciddi tümör nekrozu ve primer tümör büyümesinin tam inhibisyonu ile doğrulandı. Daha da önemlisi, iskeminin bu doğrudan etkilerine rağmen, hipoksik tümörlerden tümör hücrelerinin daha iyi bir yayılımı gözlenmiştir. Bu deneysel strateji, aynı büyüklükteki primer tümörlerin metastatik özelliklerinin karşılaştırmalı analizini, ancak önemli ölçüde farklı hipoksi seviyelerini mümkün kılar. Ayrıca, in vivo metastatik tümör ilerlemesi sırasında meydana gelen hipoksi kaynaklı değişikliklerin mekanik temelini daha fazla değerlendirmek için yeni bir platform sağlar. Ek olarak, bu model ES hücreleri kullanılarak kurulmuş olsa da, bu deneysel stratejinin, diğer sarkomlarda ve ayrıca iyi tanımlanmış bir kan tedarik yoluna sahip bölgelere ortotopik olarak implante edilen tümörlerde hipoksinin etkisini test etmek için kullanılabileceğini tahmin ediyoruz.

Giriş

Ewing sarkomu (ES) çocukları ve ergenleri etkileyen agresif bir kanseridir. 1 tümörler genellikle bacaklarda, yumuşak dokular ve kemikleri de gelişebilir. metastaz varlığı ES hastalar için tek ve en güçlü kötü prognostik faktör iken, onların gelişimini altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. 2 tümör hipoksi ES ilerlemesinde rol birkaç faktörlerden biridir. ES hastalarda, tümör dokusu içinde perfüze olmayan alanlarının varlığı kötü prognoz ile ilişkilidir. 3 in vitro, hipoksi ES hücrelerinin invazivliğini artırır ve pro-metastatik genlerin ifade tetikler. 4-6 Bununla birlikte, kanıt bu satırları rağmen, hipoksi kaynaklı ES ilerlemesi ve yayılması için doğrudan kanıt var. Ayrıca, bilinmeyen hipoksi şu anda bu tür etkiler uygular hangi mekanizmalar. Dolayısıyla, biz in vitro verileri ve klinik glikozu mevcut arasındaki boşluğu doldurmak için bir in vivo model oluşturdukyenilikçiliklere. Bu model sistemi, ex vivo olarak, patolojik ve moleküler analizleri (Şekil 1) ile kombinasyon halinde, in vivo olarak tümör ilerlemesi ve metastaz takip manyetik rezonans görüntüleme (MRI) kullanılarak, doğal ortamında oluşan tümör üzerindeki hipoksiye doğrudan test sağlar.

ES yerleşik bir transgenik modeli mevcut olduğundan, bu tümörlerin metastatik özelliklerine in vivo çalışmalar immün sistemi baskılanmış farelere insan hücrelerinin enjeksiyonu güveniyor. immünolojik engelli hayvanların kullanımı hastalığın ilerlemesi üzerinde bağışıklık sisteminin etkisini hafife olsa da, insan hücrelerini kullanma yeteneği bu tür çalışmaların çevirilebilirlik artırır. Farklı ksenograft modelleri arasında, kuyruk damar içine sistemik enjeksiyonlar gerçekleştirmek için en kolay, henüz onlar tümör hücre intravazasyonunda ilk adımları ihmal ve büyümenin birincil sitesinden kaçmak. Öte yandan, 7-12, orthoto kemikler (femur, kaburga) ya da kas içine tümör hücrelerinin enjekte içeren pic Xenografting, biyolojik olarak daha insan kanser ile ilgili daha teknik açıdan zorlayıcı, ama aynı zamanda. Metastaz gelişmeden önce 13-16 Bununla birlikte, geçmişte, primer tümörlerin hızlı büyüme ile ilişkili yüksek morbidite genellikle gerekli kılmıştır hayvan ötenazi. Bu çalışmada, biz MRG ile metastatik ilerlemesi boyuna izlenmesi ile birlikte ortaya çıkan primer tümörün eksizyonu takiben gastroknemius kasının içine hücre enjeksiyonu, önceden belirlenmiş bir model kullandı. Kaslar ve kemikler - - tibia yakın gastroknemius kas içine 17,18 tür enjeksiyonlar iki doğal ES ortamlarında tümör büyümesi için izin ve tipik insanlarda etkilenen yerlere uzak metastaz ile sonuçlanır. 18 Böylece, bu model doğru hastalığın ilerlemesi sırasında ES hastalarda görülen metastatik süreçleri tartışıldı.

tert "> düşük hindlimb birincil tümörlerin lokalizasyonu, tümör dokusuna kan akımı hassas kontrolünü kolaylaştırır. femoral arter ligasyonu (FAL) uzak bölgelere kan akışını engellemek için anjiyojenez araştırmada kullanılan iyi bilinen bir tekniktir ayak ve iskemi tepki doku vaskülarizasyonu araştırılması. 19,20 Önemli olarak, kan akımının başlangıç damla yaklaşık olarak 3 gün FAL sonra gözlenen kollateral açma ve reperfüzyonun takip etmektedir. 20 Bu durumda, bir tümör taşıyan ekstremitede yapıldığında, Bu model, hızla büyüyen tümörlerde doğal olarak hipoksi / reperfüzyon olayları yeniden ve yeni açılan kollateral damarlar yoluyla alt hindlimb için perfüzyon restorasyon nedeniyle metastatik tümör hücrelerinin kaçmasını sağlar. 21 önemlisi, tümör boyutu olduğunda bu işlem yapılmalıdır tipik olarak tümör taşıyan buzağı VOL'de kontrol tümörlerinin aşırı hipoksi (önleyecek kadar küçükKontrol ve FAL tedavi edilen gruplar arasında, tümör hipoksi düzeylerinde anlamlı farklılıklar sağlanması 250 mm3), - 150 ume.

ES süresi için hipoksi etki ve metastaz frekans uzunlamasına izlenmesine ek olarak, bu model, doku toplanması ve primer tümörler ve metastazlar, hem yeni hücre çizgilerinin geliştirilmesine izin verir. Önemli bir şekilde, önceki çalışma metastaz türetilmiş hücre çizgileri, tümör yayılması, tümör sürekli hücre fenotipinde değişiklikler ve böylece metastatik işlemleri deşifre bu hücre çizgilerinin kullanımını geçerli ile ilişkili olduğunu gösteren hayvanlara yeniden yerleştirilmesi sırasında gelişmiş metastatik potansiyelini gösteren karar vermişlerdir. 18. Toplu olarak, bu model artık hipoksi kaynaklı metastatik yollarının tanımlanması için gerekli olan genetik ve moleküler analiz için kullanılabilir.

hipoksi gibi çeşitli t malignite arttırıcı yanlısı metastatik faktördürumors, bizim model, osteosarkom ve rabdomyosarkomu doğal olarak bacaklarda geliştirmek diğer tümör türleri, hipoksi rolünü araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir. 21-23 Ayrıca, benzer bir yaklaşım, kan akışının iyi tanımlanmış bir yol ile anatomik yerle artan maligniteleri de uygulanabilir. Sonuçta, model modifiye edilebilir ve onun yarar daha bireysel araştırma ihtiyaçlarına bağlı olarak, genişletilmiş.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm işlemler, Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Ortotopik Enjeksiyonluk 1. Hücre Hazırlanması

  1. standart koşullar altında kültür, insan ES hücreleri. değil 5 farelerin enjeksiyon için confluency% 70 aşan yaklaşık bir 15 cm hücre kültürü plakası kullanın.
    NOT: Bu çalışma için, SK-ES1 hücreleri,% 10 FBS ve% 1 4- (2-hidroksietil RPMI kolajen kaplı plakalar ve TC71 hücreleri% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlenmiş McCoy'un 5A ortamı içinde kültüre edildi ) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES). Her iki ortam antibiyotik ile takviye edilmiştir - penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve fungizon (1 ug / ml).
  2. 5 dakika için% 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile% 70 izdiham fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) trypsinize ES hücreleri yıkayın.
  3. Hücre kültürü medi plakadan ES hücreleri çıkarınA, daha sonra oda sıcaklığında, 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj. Yeniden askıya soğuk PBS, 10 ml ES hücreleri ve daha sonra hücre sayısı.
  4. Daha sonra santrifüje ES oda sıcaklığında 200 x g'de 5 dakika boyunca hücreler ve askıya tekrar 2 x 10 7 (SK-ES1) ya da soğuk PBS, ml başına 10 7 (TC71) hücre. enjeksiyonları yaparken buz üzerinde nihai bir hücre süspansiyonu tutun.

Gastrocnemius Muscle içine ES hücrelerinin 2. Ortotopik Enjeksiyon

  1. 4-6 haftalık dişi SCID / bej fareler kullanın.
  2. Embriyonik kök hücrelerin enjekte etmek, nazikçe alt hindlimb medial tarafını açığa fare tuşunu basılı tutun ve dördüncü ve beşinci parmakları arasında sol bacak stabilize.
  3. Bir 28 G ½ iğne kullanarak ya gastroknemıus kasına 2 x 10 6 (SK-ES1) ya da 10 6 (TC71) ES hücreleri (Şekil 2A) içeren, daha önce hazırlanan hücre süspansiyonu, 0.1 ml enjekte edilir.
    NOT: Her ne kadar kas içi inj için maksimum sesections enjekte edilen, yüksek hücre sayısı, bu özel işlem için, tipik olarak 0.1 mL gerekli olduğu için hacim artışı 0.05 ml'dir. Bu prosedür Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
    1. tibia tepe / tübero- yönünde 45 derecelik bir açı - gastroknemius kas içine öne yaklaşık 30 iğne takın.
    2. tibial tepe / tuberositas dokunduğunda hafifçe iğneyi çıkartın. Yavaşça basıncı kademeli serbest bırakmak için iğne çekilmesi, hücre süspansiyonu çözümü enjekte edilir.
  4. sıkıntı belirtileri önümüzdeki 24 saat boyunca enjekte fareler izleyin.
    NOT: Hayvan işlemede daha az deneyime sahip Müfettişler tümör hücresi enjeksiyonları için fareler anestezi düşünmelisiniz. Bazı kurumlar güvenlik nedeniyle anestezi gerekebilir.

3. Birincil Tümör Büyüme İzleme

  1. d birincil tümörlerin büyümesini izlemekünlük tümör boyutu istenilen hacim ulaşıncaya kadar.
    NOT: Bu çalışmada, 250 mm 3 buzağı hacmi deney (Şekil 2B) bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. tümörler bu büyüklüğe ulaşması için 2 hafta - Tipik olarak, yaklaşık 1 sürer.
    1. onun-medial lateral ve ön-arka uzunlukları yoluyla dijital kumpas ile günlük buzağı boyutunu ölçmek.
    2. D uzun çapı ve d tümör taşıyan düşük hindlimb kısa çapı 3.14 x, formül (D xD 2/6) ile dana hacmini belirler.
      NOT: - 50 mm 3 normal erişkin fare buzağı boyutu yaklaşık 40 olduğunu. Hacim tümörün büyümesi ve baldır esas olarak tümör dokusu oluşacak sonraki aşamalarında artacaktır.

Tümör taşıyan hindlimb hipoksi Başlatmaya 4. Femoral Arter Ligasyonu (FAL)

  1. Bu işlem için gerekli cerrahi aletler hazırlayın: curved veya sivri ince forseps, forseps, cerrahi makas ve iğne tutucu çekti. Bir otoklav veya sıcak-boncuk sterilizatör kullanılarak cerrahi öncesi bu araçları sterilize edin. Ayrıca, bu ameliyat için hazır ince pamuklu çubuklarla var.
    NOT: Bu araçlar işlem sırasında gerektiği gibi ucunda yeniden sterilize edilmesi tavsiye edilir.
  2. Analjezik ajan (Carprofen 5 mg / kg) deri altından (SQ) enjekte edilir. algılamak ve hipoksi doğrulamak için, hypoxyprobe-1 (pimonidazol, 60 mg / kg) enjekte edilir.
    NOT: Bu doz fare başına 1.5 mg eşittir ve intraperitonal PBS (IP) 'de 15 mg / ml hypoxyprobe çözeltisi 0.1 mL püskürtülmesiyle elde edilir. hypoxyprobe sonra immünohistokimyasal olarak hayvan dokularında saptanabilen postmortem olduğunu.
  3. 1 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 5 izofluran - 3 ihtiva eden bir anestezi indüksiyonu odasında fare yerleştirin.
  4. dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra i hayvan kaldırmaknduction odası. İşletim yüzeyinde bir ısınma pad üstüne yerleştirilen steril bir örtü üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. 0.8 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 3 izofluran - 1, sürekli bir akış bağlamak için bir burun konisi kullanın.
    1. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün. iyice cerrahi alan atmaktadır için en fazla 10 saniye boyunca cilt üzerinde bırakarak, epilasyon kremi uygulayın. Sonra bir etanol hazırlık takımını kullanarak epilasyon kremi silin.
  5. Uzatın ve yaklaşık 45 derecelik fare orta hattan bant parçası ile hindlimb sabitleyin. hindlimb güvenli sonra iki kez daha her tekrarlayarak, etanol, ardından% 10 povidon / iyot çubukla / çözeltisi ile maruz cildinizi silin. cerrahi işlem geri kalanı için, arka bacak bölgesinin büyütülmüş bir görünümünü elde etmek için bir stereo mikroskop kullanımı.
  6. sivri forseps ve cerrahi makas kullanarak, sk bir kesi yapmakyaklaşık 1 cm uzunluğunda, içinde, kasık bölgesine doğru orta uyluk. tuzlu ıslatılmış ince pamuklu çubuklarla kullanarak, yavaşça uyluk kas çevreleyen deri altı yağ dokusu uzak fırça.
  7. Dikkatle cilt altı yağ dokusu ile künt diseksiyon ile yatan femoral arter ortaya koymaktadır. orta üst adduktor kas damarsal maruz yara ve cerrahi alan stabilize.
  8. yavaşça delip membranöz femoral kılıf sayesinde, ince forseps kullanarak nörovasküler demet ortaya çıkarmak. Ince forseps temiz bir set kullanarak incelemek ve inguinal ligament distal kasık yakın proksimal yerde femoral ven ve sinir femoral arter ayırın. femoral ven duvarını delici kaçınmak için dikkatli kullanın.
  9. diseksiyon ardından, lateral sirkumfleks femoral arter (LCFA) şubesine femoral arter ve distal altında 6-0 ipek sütür bir iplikçik geçmektedir. Çift düğüm (Şekil 3) kullanılarak femoral arter tıkamak.
  10. 6-0 polipropilen sütür ile kesi kapatın. kesi kapattıktan sonra, sıvı dengesi tedavisi için sıcak tuzlu su SQ, 0.5 ml enjekte edilir. kurtarma kafesine bir dökümlü sıcak ped üstüne hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
  11. Analjezik ajan ameliyat sonrası ilk 6 saat boyunca hayvanlar izlemek ve enjekte (Carprofen 5 mg / kg, SQ) 3 gün süre ile her gün. Dikişler steril makas kullanarak 10 gün sonrası ameliyat çıkarın.

Bacak Amputasyon tarafından 5. Birincil Tümör eksizyonu

NOT: buzağı boyutu kontrol grubu için 250 mm 3 veya hipoksik grup için FAL sonra 3 gün ulaştığında tümör taşıyan alt hindlimb organını.

  1. nazikçe hayvanı tutarken saç kesme makineleri ile pelvik bölgeye distal tibia tümör taşıyan uzuv saç tıraş. İşlemden önce analjezik ajan (Carprofen 5 mg / kg, SQ) enjekte edilir.
  2. Bir anestezi indüksiyon ch içine fare yerleştirin1 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 5 izofluran - sarı 3 ihtiva etmektedir. dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra indüksiyon odasından gelen hayvan çıkarın.
  3. İşletim yüzeyinde bir ısınma pad üzerinde yerleştirilen steril bir örtü üzerinde sağ lateral yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. 0.8 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen içinde% 3 - izofluran 1 sürekli bir akış bağlamak için bir burun konisi kullanın. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün
  4. 3 kez tekrarlayarak etanol, ardından% 10 povidon / iyot bezi / solüsyonu kullanılarak cerrahi siteyi, hazırlayın. Steril cerrahi alanında elde etmek için fare üzerinde bir steril gazlı bez (örneğin, cerrahi drape) uygulayın.
  5. Künt diseksiyon ve proksimal cildin geri çekilmesi ardından orta femur çevresel cilt kesisi, emin olun. bacağın ortalama tarafında medial femoral nörovasküler pedikül Açığa ve ardından Arter4-0 kaplamalı (Polyglactin 910) emilebilir sütür materyali kullanarak inguinal ligament yakın.
  6. koksofemoral eklem yumuşak doku künt diseksiyon ardından makas ile kas gruplarının, bir orta-femoral kesiye gerçekleştirin. Bir kemik kesici kullanarak, orta femoral osteotomi gerçekleştirin. steril ince pamuklu bir bez veya bir emilebilir jelatin sünger kullanarak, yavaşça en aza indirmek ve kanamayı önlemek için osteotomi sitesini basın.
  7. cerrahi yara klipleri kullanarak örten cilt kapatın ve sıvı dengesi tedavisi için ılık tuzlu su SQ 0.5 ml enjekte edilir. kurtarma kafesine bir dökümlü sıcak ped üstüne hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
  8. cerrahi üzerine, RNA, DNA veya protein izolasyonu için primer tümörlerden doku örnekleri toplamak -80 ° C'de sıvı nitrojen ve mağaza dondurma oturtun. Aşağıdaki bölümde 9'da tarif edildiği gibi, birincil hücre kültürü için, bu aşamada, doku örnekleri toplamak. histoloji ve immunochemis için% 10 nötr tamponlu formalin kalan uzuv doku Fixhypoxyprobe-1 tespiti de dahil olmak üzere, deneyin.
  9. 3 gün boyunca sonra her gün, ameliyat sonrası ilk 6 saat içinde hareket, ağrı ve gıda tüketimi için hayvan izleyin. 3 gün süreyle günlük olarak analjezik madde (Carprofen 5 mg / kg, SQ) enjekte edilir. Bir yara klip çıkarıcı kullanarak amputasyon sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın.

Metastazlarının Varlığı 6. İzleme Fareler

  1. günlük fareler gözlemlemek ve haftada en az iki kez metastaz klinik belirtileri için onları değerlendirmek.
    1. çeşitli yerlerde, genellikle omuz, kontralateral bacak ve çene geliştirmek kitleler olarak ortaya makrometastazı varlığını hayvanları gözlemlemek. Bu amaçla, dikkatlice baş, boyun ve koltuk altı bölgeleri ve kontralateral hindlimb palpe. MR tarama ile birlikte karın şişliği yoluyla iç organ metastazları kontrol edin.
    2. inde ile xiphoid süreci (sternum alt ucu) tuşuna basarak akciğer metastazlarının varlığı için kontrol edinx parmak. 24
      NOT: Bu basınç diyafram solunum kapasitesini azaltır. ileri evre akciğer metastazları ile Fareler zahmetli nefes alarak kendini solunum sıkıntısı belirtileri gösteriyor.
    3. Böyle merkezi sinir sistemine metastaz düşündüren bacak felç ve ataksi gibi nörolojik semptomların, hayvanları gözlemlemek.
    4. Potansiyel hastalık ilerlemesinin bir göstergesi olarak, kilo kaybı için en az haftada bir kez fareler izleyin. işlem öncesi ağırlığının% 15 aşan vücut ağırlığı kaybı insancıl son nokta olarak kabul edilir.

7. Manyetik Rezonans Görüntüleme algılama Metastazına (MRG)

  1. İstenilen zaman noktalarında metastaz MRI gerçekleştirin. 18
    NOT: Bu çalışmada, 7 Tesla yatay spektrometre kullanıldı. MR günlerde 15 gerçekleştirilen ve SK-ES1 hücreleri ve TC71 hücreleri için günde 15 35 sonrası amputasyon oldu.
  2. Bir anestezi indüksiyon Chambe içine fare yerleştirin% 30 oksijen ve% 70 azot oksit bir gaz karışımı içinde% 3 izofluran - 1 içeren R.
  3. dış uyaranlara tepkisiz kadar indüksiyon odasında fare bırakın. Sonra indüksiyon odasından gelen hayvan çıkarın.
  4. % 1.5 izofluran sürekli yönetim ve% 30 nitröz oksit ile solunum ve sıcaklık monitörizasyonu ile bir stereotaksik tutucu üzerine anestezi fare aktarın. kornea kurumasını önlemek için her gözün steril olmayan ilaçlı oftalmik merhem sürün. Görüntü hayvan ya sırasıyla tüm vücut ya da beyin görüntüleme için 40 veya 23 mm Bruker fare hacmi bobin.
  5. TR = 3.000 msn, TE = 24 msn, matris = 256, FOV = 4.35 x 3,0 cm, dilim kalınlığı = 0.5 mm, NADİR faktörü = 4 ve ortalamalar = 4. 18: iki boyutlu, T2 ağırlıklı NADİR sırasını kullanmak
  6. Sıcak bir kurtarma kafeste hayvan koyun ve uyanık kadar sürekli izlemek.
    NOT: anestezi sığ bir düzlem kullanıldığından dolayı fareler hızla iyileşir.
  7. anestezi hiçbir yan etkisi olmadığından emin olmak için görüntüleme sonraki ilk 6 saat boyunca hayvan izleyin.

8. Ötanazi ve Nekropsi

  1. MR ve / veya hastalığın ilerlemesi klinik semptomlarla saptanabilir metastaz mevcut hayvanların kez fareler Euthanize.
    NOT: Bu çalışmada, fareler günde 50 kurban ve sırasıyla, SK-ES1 ve TC71 ksenograftları taşıyan hayvanlar için 25 sonrası amputasyon. Bazı durumlarda, daha önce ötanazi nedeniyle yüksek metastaz yükü için gerekliydi.
  2. (- Ötenazi odası hacim / dk% 30 10'da CO 2) / dk 1.5 L CO 2 maruz fareler Euthanize. Hayvan ölümü sağlamak için, CO 2 maruz kaldıktan sonra servikal dislokasyon gerçekleştirin.
  3. % 70 etanol ile tüm fare Sprey ve laminer akış kaputu içine yerleştirin. Bir kan toplama tu için 1 ml şırınga ve transfer 25 G ½ iğne kullanılarak kalp delme yoluyla kan toplayınEDTA, 2 mg olması.
  4. humeri ve omurga yanı sıra başka yerlerde mevcut makroskobik metastaz hem dalak, böbreküstü bezleri, yumurtalıklar, böbrekler, karaciğer, akciğer, beyin, sağ bacak, kemik iliği: Aşağıdaki dokuları toplayın. 25,26
  5. hypoxyprobe-1 tespiti de dahil olmak üzere histoloji ve immünokimyanın için% 10 nötr tamponlu formalin her doku yarısını sabitleyin. Ek bileşen daha sonra RNA, DNA ya da protein izolasyonu için -80 ° C'de saklayın, sıvı nitrojen içinde, diğer yarısı dondurma. Aşağıdaki bölümde 9'da tarif edildiği gibi, birincil hücre kültürü için 25,26 doku örnekleri toplamak.

9. Primer Hücre Kültürü

  1. Primer hücre kültürü gerçekleştirmek için, bir laminer akış kaputu steril koşullar altında nekropsi (yukarıdaki bölüm 8) sırasında ampute ekstremitenin (yukarıdaki bölüm 5) veya dokuların teşrih.
  2. penisilin ortotopik enjeksiyon için kullanılan hücre hattı (200 birim / ml), hücre kültür ortamı uygun olan hazırlanması,streptomisin (200 ug / ml), fungizon (1 ug / ml) ve% 0.2 Mycoplasma profilaktik antibiyotik. 6 cm hücre kültür plakasına primer kültür ortamına 2.5 ml yerleştirin.
  3. Primer tümör veya metastaz gelen canlı tümör dokusu alanları seçin ve ardından steril makas kullanılarak her 2-3 mm iki üç segment izole.
    NOT: Canlı tümör dokusu genellikle tümörün kenarlarında bulunan ve pembemsi veya kırmızımsı renkte, belirgin parlaklık ve genel ıslak görünüşü nekroz ayırt edilebilir. Buna karşılık, nekrotik doku yaygın tümör merkezinde görülür ve donuk, sevimsiz bir görünüme sahip bir beyazımsı / krem ​​rengi kitle şeklinde ortaya çıkar. 27
  4. Adım 9.2'de tarif edilen primer kültür ortamı içeren bir 6-cm hücre kültürü plakasının izole segmentleri aktarın.
  5. standart koşullar altında kültür hücreleri gibi bölüm 1 (NOT) ve 9.2 tarif. 18,28 wh doku parçaları, kaynaklanan hücresel akıbet için kültür edinIch birkaç gün içinde gözlenmelidir. Hücreler izdiham ulaştıklarında, trypsinize ve standart hücre kültür tekniklerine göre bunları yaymak.
    Not: Birincil hücre kültürü, daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi, büyüme ve kontrolü ve hipoksik tümör, hem de moleküler özellikleri elde edilen hücrelerin metastaz özelliklerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir. 18

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Gastrokinemius kası içine ES hücrelerinin enjeksiyonundan sonra, primer tümörler 250 mm3 bir baldır boyutu büyümesine izin verilir (Şekil 1, 2). sırasıyla, SK-ES1 xenogreftler için TC71 20-25 gün 15 gün - tümörler için gerekli zaman bu hacim genellikle 10 arasında değişmektedir ulaşmak için. 250 mm3 sergi endojen hipoksi, nispeten düşük düzeyde bir buzağı hacminde tümörleri hypoxybrobe-1 (pimonidazole) göre, (tümör dokusu yaklaşık% 3) (Şekil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bizim modelimiz iki deney gruplarında metastaz karşılaştırılmasını içerir - tümörler 250 mm 3 bir buzağı hacmine ulaşmıştır üzerine amputasyon ardından hindlimb geliştirmek için izin verilen bir kontrol grubu, ve bir hipoksi maruz grubu, hangi tümöre içinde taşıyan arka bacak 3 gün sonra amputasyon, ardından aynı hacimde FAL tabi tutulur. Kontrol tümörlerine kıyasla bu deneylerde FAL-tedavi edilen tümörler, küçük bir gecikme ile ampute olsa da, onların büyüklük ligasyonu ve amputasyon arasında 3 günlük süre b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibeleri tarafından desteklenmiştir: Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülleri Programı aracılığıyla UL1TR000101 (daha önce UL1RR031975), 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 ve JK'ya 1R21CA198698. MRG, Georgetown-Lombardi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin Klinik Öncesi Görüntüleme Araştırma Laboratuvarı'nda (PIRL) ve Georgetown-Lombardi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin Histopatoloji ve Doku Paylaşılan Kaynağı'nda doku işleme, her ikisi de NIH / NCI hibe P30-CA051008 tarafından desteklendi. Yazarlar, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi Hücre Biyolojisi ve Fizyolojisi Bölümü'nden Dan Chalothorn ve James E. Faber'e ölüm sonrası röntgen anjiyografisine yardımcı oldukları ve kollaterogenez konusunda içgörü ve uzmanlık sağladıkları için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SK-ES1 İnsan Ewing sarkomu (ES) hücreleriATCC
TC71 İnsan ES hücreleriDr. Toretsky
McCoy'un 5A (değiştirilmiş) Orta Gibco'sundanTechnologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBS'densağlanmıştırSigma-AldrichF2442-500mL
%0.25 Tripsin-EDTA (1x)Gibco Yaşam Teknolojileri tarafından25200-056
Penisilin-StreptomisinGibco Yaşam Teknolojileri tarafından15140-122
Fungizone® YaşamTeknolojileri15290-018
MycoZap ve ticaret tarafından Antimikotik Gibco; ProfilaktikLonzaVZA-2032
Kollajen Tip I Sıçan kuyruğu yüksek konsantrasyonBD Biosciences354249
SCID / bej farelerHarlan veya Charles River250 (Charles River) veya 18602F (Harlan)
1 ml İnsülin şırıngaları kalıcı olarak bağlı 28  G & frak12; iğneBD329424
Salin (% 0.9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, USP)Hospira, INCNDC 0409-7984-37
Dijital kumpaslarWorld Precision Instruments, Inc501601
Cerrahi AletlerGüzel Bilim Araçları
Rimadyl (Carprofen) Enjekte Edilebilir Zoetis
Hipoksiprob-1 (Pimonidazol Hidroklorür katı)HPI, IncHP-100mg
hipoksiprob-2 (CCI-103F-250 mg)HPI, IncCCI-103F-250mg
Povidon-iyot SwabstickPDIS41350
Steril alkol hazırlama pediFisher HealthCare22-363-750
LubriFresh PM (göz yağlayıcı merhem) Başlıca PharaceuticalsNDC 0904-5168-38
VWR Su Geçirmez Nem Bariyerli Emici Alt PedlerVWR56617-014 
Oster Golden A5 Tek Hızlı Veteriner Makası, 50 numara bıçaklıOster078005-050-002 (kesme makinesi), 078919-006-005 (bıçak)
Bebek yağı içeren NairLosyonu Kilise & Dwight Co., Inc.
İpek 6-0Surgical Specialties Corp752B
Prolene (polipropilen) sütür 6-0Ethicon8680G
Vicryl (Polyglactin 910) sütür 4-0 EthiconJ386H
Fisherbrand Aplikatörleri (Saflaştırılmış pamuk)Fisher Scientific23-400-115
GelFoam Emilebilir Diş Süngerleri - Boyut 4Pfizer İlaç9039605
Autoclip Yara Klipsi UygulayıcıBD427630
Stereo MikroskopOlympusSZ61
Autoclip sökücüBD
Aound klipBD427631
MRI 7 TeslaBruker Corporation
Paravision 5.0 yazılımıBruker Corporation
CO2 Ötenazi sistemiVetEquip
25 G 5/8 İğne (kalp ponksiyonu için)BD305122
0.1 ml şırınga ( kalp ponksiyonu)TerumoSS-01T
K3-EDTA Mikro tüp 1.3 mlSarstedt41.1395.105
%10 Nötr Tereyağlı FormalinFisher ScientificSF100-4
Life 427637

Kaynaklar

  1. Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
  2. Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
  3. Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
  4. Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
  5. Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372(2010).
  6. Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
  7. Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
  8. Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
  9. Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
  10. Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
  11. Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
  12. Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
  13. Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128(2014).
  14. Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
  15. Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
  16. Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
  17. Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
  18. Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
  19. Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
  20. Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
  21. Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
  22. Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
  23. Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
  24. Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
  25. Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
  26. Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
  27. Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
  28. Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
  29. Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
  30. ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tümör HipoksisiFemoral Arter LigasyonuOrtotopik XenogreftlemeEwing Sarkom HücreleriHypoxyprobe-1 BoyamasıMetastaz AnaliziPrimer Tümör BüyümesiArka Ekstremite İskemisiSCID Beige Fareler
Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.