Yöntem makalesi

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray'ler Üretimi

DOI:

10.3791/54543

⸱

15 Eylül 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insanlardan ve farelerden serum IgG ve IgM otoantikorlarının aynı anda tespiti için kullanılabilecek özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu diziler, ilgilenilen herhangi bir antijene veya epitopa karşı antikorların yüksek verimli ve kantitatif tespitine izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kendi antijenlerine karşı antikorlar olan otoantikorlar, birçok hastalık durumunda bulunur ve hastalık aktivitesi için belirteç görevi görebilir. Spesifik antijenlere karşı otoantikor seviyeleri tipik olarak enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tekniği ile tespit edilir. Bununla birlikte, ELISA ile çoklu otoantikorların taranması zaman alıcı olabilir ve büyük miktarda hasta örneği gerektirir. Antijen mikroarray tekniği, otoantikorları multipleks bir şekilde taramak için kullanılabilecek alternatif bir yöntemdir. Bu teknikte antijenler, robotik bir mikroarrayer ile özel olarak kaplanmış mikroskop lamları üzerine dizilir. Slaytlar hasta serum örnekleri ile incelenir ve daha sonra serum otoantikorlarının antijenlere bağlanmasını tespit etmek için floresan işaretli ikincil antikorlar eklenir. Otoantikor reaktiviteleri, slaytların floresan sinyalleri algılayabilen bir tarayıcı ile taranmasıyla ortaya çıkarılır ve ölçülür. Burada, özel antijen mikrodizileri oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Mevcut dizilerimiz 9 katı pim ile basılmıştır ve çift olarak tespit edilmiş 162 adede kadar antijen içerebilir. Diziler, mikroarrayer tarafından kullanılan kaynak plakasındaki antijenler değiştirilerek kolayca özelleştirilebilir. Aynı slayt yüzeyi üzerinde IgG ve IgM reaktivitelerini ayırt edebilen iki renkli bir ikincil antikor tespit şeması geliştirdik. Tespit sistemi, insan ve murin otoantikorlarının bağlanmasını incelemek için optimize edilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otoantikorlar birçok hastalık durumunda bulunur ve sıklıkla doğrudan patojenik aktiviteyesahip olabilir 1. Otoantikorların tanımlanması bazı hastalıkların tanısı, hastalık sonuçlarının prognozu ve spesifik tedavilerden fayda görebilecek hastaların sınıflandırılması için önemlidir2. Otoantikorlar tipik olarak ELISA tekniği kullanılarak hasta serumunda tanımlanır; Bununla birlikte, bu teknikle çoklu antijenlerin taranması zahmetlidir ve büyük miktarda hasta örneği tüketir. Bu nedenle, otoantikorları daha büyük ölçekte profillemek için yeni teknolojilere ihtiyaç vardır.

Antijen mikroarray tekniği, otoantikorların multipleks bir şekilde profillenmesine izin veren proteomik bir teknolojidir3. Bu işlemin ilk adımında, bir antijen kütüphanesi, robotik bir mikroarrayer kullanılarak bir slayt yüzeyine dizilir. Slaytlar seyreltilmiş serum ile incelenir ve daha sonra floresan işaretli ikincil antikorlar eklenir. Antikor reaktiviteleri, slaytların bir mikroarray tarayıcı ile taranmasıyla görselleştirilir ve floresan yoğunlukları ile ölçülür. Antijen mikrodizileri, otoantikorların taranmasında ELISA tekniğine göre birçok avantaj sunar: 1) otoantikorları aynı anda birden fazla antijene karşı profillemek için sadece mikrolitre seruma ihtiyaç duyarlar, 2) antijeni idareli kullanırlar, çünkü dizilerde sadece nanolitre antijen tespit edilir, 3) ELISA'ya kıyasla gelişmiş duyarlılığasahiptirler 3 ve 4) eşzamanlılığa izin verirler, Birden fazla antikor izotipinin ayrı ayrı tespiti. Antijen mikrodizileri, romatoid artrit, multipl skleroz ve sistemik lupus eritematozus4-6 gibi otoimmün hastalıklarda otoantikorların profilini çıkarmak için kullanılmıştır. Bu hastalıkların her üçünde de, otoantikorların dizilerle büyük ölçekte profillenmesiyle hastalık patogenezine ilişkin yeni bilgiler elde edildi.

Burada, nitroselüloz kaplı slaytlar kullanarak antijen mikrodizileri oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Proteinler, peptitler ve hücre lizatları dahil olmak üzere çeşitli antijenler, bu teknik kullanılarak slaytlar üzerine dizilebilir. Diziler, antijen kütüphanesini tutan kaynak plakasına ilgilenilen antijenleri dahil ederek kolayca özelleştirilebilir. Ek olarak, aynı slayt yüzeyi üzerinde IgG ve IgM reaktivitelerini ayırmak için bir çift ikincil antikorun nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Şimdi bu tekniği hem insanlarda hem de farelerde otoantikorları ölçmek için optimize ettik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sulandırma antijen ve Yaratma Antijen Mikroarray'ler

  1. 0.2 mg / ml'lik bir son konsantrasyona PBS içinde antijenleri seyreltilir. 9 iğneli bir mikro-dizici konfigürasyonu ile iki nüsha halinde 162 kadar benzersiz antijenleri yazdırın. antijen kitaplık olarak pozitif kontrol IgG ve IgM antijenleri ekleyin. Yalnızca bir negatif kontrol olarak PBS içerir.
  2. 384 gözlü bir kaynak plaka her bir antijenin 20 ul ekle. Kafasının kurulumu ayna gruplar halinde kaynak plakasına antijenleri ekleyin (9 pimleri baskı için kullanıldığında, örneğin, 9 kişilik gruplar halinde antijenleri düzenlemek).
  3. diziler yazdırmak için hazır olana kadar -80 ° C'de folyo ve dondurma ile kapak kaynak plakası.
  4. 3 x 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile, bir sonikasyon banyosu içinde onları kuluçka katı mikro-dizici işaretçilerini temizleyin. rafa yerleştirin pimleri kurutun ve daha sonra mikroarray yazıcı kafasındaki işaretçilerine düzenlemek için. 9 pin için, 3 x 3 yapılandırmayı kullanın.
  5. kafasının sayı işaretçilerine ayarlayarak tarafından işletilen baskı için program mikro-dizici,slaytlar sayısı her slaytta, pedleri numarasını yazdırmak ve her bir antijen için çoğaltmak lekelerin sayısı için. Tipik olarak, 9 işaretçilerine, 70 kaydırak, 2 pedleri / slayt ve her bir antijen için 2 suret noktalar kullanın. Program mikro-dizici antijenlerin farklı gruplar arasında suda işaretçilerine ses dalgalarına maruz için.
  6. Çözülme kaynak plakası 100 x g, 1 dakika daha sonra santrifüj plaka. mikro dizicinin belirlenen noktada kaynak plaka koyun. Basılacak antijenlerin ilk grubu kapsayan folyo bölümünü kaldırın.
  7. arrayer yüzeyi ve çalıştırma baskı programı baskısız slaytlar düzenleyin. Dizi makinesinin nemlendirici inşa ile% 60 - nem oda sıcaklığında baskı slaytlar 55 de arrayer ayarlanır.
  8. antijenlerin her grup her slaytlarda basıldıktan sonra, mikro-dizici duraklatmak. sadece folyo ile basıldı antijenleri Kapak (buharlaşmasını önlemek için) ve antijenlerin sonraki grup basılacak ortaya çıkarmak. Baskı programına devam edin.
  9. Tüm antijenler yazdırıldıktan sonra, kapak kaynak pl-80 ° C folyo ve dondurma yeni bir parça ile yedi. slayt kutu ve vakum mühür basılmış slaytlar yerleştirin. Slaytlar ertesi gün kullanılan veya en fazla bir ay sonra olabilir.

2. Seyreltik Sera ile Antijen mikrodizileri Probing

  1. Kuluçka odaları kullanarak çerçevelerin içine slaytlar yerleştirin. Her bir dizi yüzey engelleme tamponu (% 2.5 [hacim / hacim] fetal buzağı serumu (FCS), PBS içinde Tween 20,% 0.1 [/ hacim: hacim]) 700 ul ekle.
  2. Islak bir doku parçası ile kapalı bir kapta çerçeve ve yerde yapışkan film yerleştirin. bir rocker 4 ° C'de O / N inkübe edin.
  3. Serum örnekleri 1 sulandırmak: 100 tampon engelleme. Aspire dizilerden engelleme çözümü ve her dizi yüzeyine seyreltilmiş örnek 500 ul ekleyin.
  4. yapışkan film ile örtün ve sallanan 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir.
  5. tampon engelleme ikincil antikorlar seyreltilir. İnsan deneyleri için, 0.33 mg / ml ve Cy5 bir Cy3 etiketli keçi anti-insan IgG antikoru seyreltilmiş keçi anti-Huma etiketli0.25 ug / ml IgM antikoru n. Fare çalışmaları için, bir Cy3 mi 0.38 ug / keçi anti-fare IgG antikoru etiketlenmiş ve bir Cy5 / ml 0.7 ug keçi anti-fare IgM antikoru etiketli seyreltin.
  6. dizileri aspire örnekler ve dizi yüzeyleri durulama tamponu (PBS içerisinde% 0.1 Tween 20) ile 4 kez yıkayın. slaytlar üzerine tampon ve çabuk fiske dökün.
  7. sallanan oda sıcaklığında her dizi yüzeyini yıkamak ve 10 dakika inkübe etmek blokaj tamponu 700 ul ekle. Tekrarlayın yıkama adımı iki kez daha.
  8. Her slayt yüzeyine seyreltilmiş ikincil antikor 500 ul ekleyin ve yapışkan film ile kaplayın. sallanan 4 ° C'de 45 dakika inkübe edin.
  9. Aspire ikincil antikor slaytlar gelen karışım ve yukarıdaki gibi 4 kez yıkayın. Yıkama yukarıdaki gibi engelleme / seyreltme tamponu 700 ul ile 3 kez kayar.
  10. PBS batırılır metal slayt raf çerçeveleri ve yerden slaytları çıkarın. yörünge çalkalama ile oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkalayın. PBS yeni kapta koyun ve başka bir 20 m inkübesallayarak ile.
  11. deiyonize su 15 saniye bir kap içine koyun slayt raf. su, yeni bir kapta raf yerleştirin ve başka bir 15 saniye kuluçkaya yatmaktadır.
  12. Kuru slaytlar, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 220 xg'de santrifüj ve spin bir ELISA plakası adaptörü üzerindeki yeri slayt rafa.
  13. tarama için hazır olana kadar ışık geçirmez kutu slaytlar yerleştirin.

3. Tarama Antijen Mikroarray'ler ve İhracat Verileri

  1. Cy3 ve Cy5 floresan sinyalleri algılayabilen bir mikrodizi tarayıcı kullanarak tarama slaytlar. Tarayıcının photomultiplier tüp (PMT) seviyesini ayarlamak için, sadece sekonder antikor ile problanmıştır bir slayt önceden tarayın.
    Not: Bu slayt tam pozitif (IgG ve IgM) de dahil olmak üzere basılmış antijen kütüphanesi yanı sıra negatif (PBS) kontrolleri olmalıdır. ön tarama optimum PMT ayarlarını bulmak için hızlı bir şekilde kullanıcı sağlayan bir düşük çözünürlüklü tarama olduğunu.
  2. PMT değerlerini ayarlayın, böylece (Cy3 kanalında) insan IgG özellikleri ve uğultu(Cy5 kanalında) bir IgM özellikleri benzer medyan floresan eksi arka plan (MFI-B) (tipik olarak 40.000) var. PMT düzeyleri "donanım" düğmesine basarak ayarlanır. ayarlandıktan sonra, sabit bu PMT ayarları korumak.
  3. "Tarama" tuşuna basarak iki kanal deneysel slaytlar tarayın. Her taramadan sonra slayt görüntüleri (iki kanal) kaydedin.
  4. slayt yükle "Dosya" düğmesini kullanarak mikroarray yazılımı içine analiz edilecek.
  5. "Dosya" düğmesini kullanarak gen dizisi listesi (GAL) dosyasını yükleyin. GAL dosya dizisi özellikleri kimlikleri ile dizinin düzeni vardır.
  6. diziler özellikleri mümkün olduğunca yakından şablonu eşleşecek şekilde taranan görüntünün üzerine dizi şablonu yerleştirin.
  7. "Hizalama" düğmesine basarak şablonu ile tüm bloklarda özellikleri aynı hizaya getirin. Program genellikle dairesel özellikleri anahat bulacaksınız ama bazı manuel ayarlamalar gerekebilir. Bu ayarlamalar özellik moduna girerek yapılabilir. Yazılım daha sonra antijenlerin her biri için bir MFI-B hesaplar.
  8. Bir metin dosyası olarak bu sonuçları ihracat "dosya" düğmesini kullanın.

Mikroarray'ler Önemi Analizi ile 4. Analiz Dizi Verileri (SAM)

  1. excel içine tek metin dosyaları yüklemek ve Cy3 ve Cy5 kanalları için MFI-B var sütunları belirlemek.
  2. yinelenen özellikler için ortalama hesaplayın.
  3. herhangi bir olumsuz MFI-B, 10 ile negatif sayı günlük tabanı 2 hesaplayarak sonra 100 ile ham MFI-B bölünmesi ve verileri Transform değiştirin.
  4. Daha önce 7 açıklandığı gibi Mikroarray'ler (SAM) Önemi Analizi ile günlük dönüştürülmüş verileri analiz edin.
  5. Iki grup (örneğin, sağlıklı kontrol vs hasta), etiket bir grup "1" ve grup kullanarak bir çalışma için "2." ler vardır antijenler reaksiyonlarını belirlemek için SAM iki sınıf, eşleşmemiş analizini kullanınHer iki grup arasında önemli ölçüde farklıdır (q <0.05).
  6. Sunum 8 görüntüleri yapmak için kümeleme ve ısı haritası üreten yazılımını kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1'de gösterildiği gibi antijenler bir robot mikro dizicinin tarafından Slaytlarınıza 384 plaka olarak düzenlenmiş ve yazdırılır. 2 inkübasyon odaları ve işlenmesinden sonra taranmış bir slayt ile bir çerçeve içinde yerleştirildi slaytlar göstermektedir. 3 pozitif ve negatif kontrol slaytlar göstermektedir. Negatif bir slayt, sadece sekonder antikor ile incelendi ve pozitif kontrol slayt sistemik lu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol antijen mikrodizi tekniği kullanılarak otoantikorlann ölçümü sağlar. Antijen mikrodizileri otoantikorlar için eleme testi esnasında klasik ELISA göre birçok avantajı vardır. Her şeyden önce, nükleik asitler, proteinler, peptidler ve hücre lizatları dahil çeşitli antijenlere ve böylece oto antikorların çoğaltılmış çok katlı taranması için izin nitroselüloz kaplı slaydlar üzerine dizilmiş olabilir. antijen nanolitre Her bir slayt üzerine fark vardır Ek olarak, antijenin yalnızca mikrogram diziler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AC, Kanada Kalp ve İnme Vakfı ve Rejeneratif Tıp Eğitim Programı'ndan (Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri) doktora sonrası bir burs ile desteklenmiştir. F.Y.Y.H. Rejeneratif Tıp Eğitim Programı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma Astellas Pharma Canada'dan bir hibe ile finanse edilmiştir. Ayrıca Dr. Mark Menenghini'ye (Toronto Üniversitesi) Axon mikroarray tarayıcısını kullandığı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ribozomal P0Diarect14100
insan IgG JacksonImmuno009-000-003'te0.2 mg / ml'ye seyreltilir, PBS insan IgM'sinde 0.2 mg / ml'ye seyreltilir
Jackson Immuno009-000-012PBS faresinde 0.2 mg / ml'ye seyreltilir
IgGSigma-AldrichI5381PBS fare IgM'de 0.2 mg / ml'ye seyreltilir
Biolegend 401601PBS
çift sarmallı DNASigma-AldrichD1626'da0.2 mg / ml'ye seyreltin PBS
tek sarmallı DNASigma-AldrichD8899'da0.2 mg / ml'ye seyreltin PBS mikroarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro'da 0.2 mg / ml'ye seyreltin
birçok arrayer türü uygundur
katı baskı pimleriArrayit CorporationSSP015
robotik mikroarrayer VirtekChipwriter Pro için yazılım 
HIZLI slaytlar (2 Ped)GVS Northa America10485317
HIZLI çerçeveGVS Northa America10486001
HIZLI inkübasyon odaları (2 Ped)GVS Northa America10486242
384 kuyulu plakalarWhatman7701-5101
plaka kapatıcılarVWR60941-062
folyo plaka kapaklarıVWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Fetal buzağı serumuInvitrogen12483020
Cy3 keçi anti-insan IgGJackson Immuno109-165-09650 glyercol
Cy5 keçi anti-insan IgMJackson Immuno109-175-12950 glyercol Cy3 keçide çalışma stoğu kullanın
anti-fare IgG JacksonImmuno115-165-071%50 glyercol
Cy5 keçi anti-fare IgM'deJackson Immuno115-175-075%50 glyercol'de çalışma stoğu kullanın
Mikrodizi TarayıcıMoleküler CihazlarAxon 4200A
Mikroarray yazılımıMoleküler CihazlarGenepix 6.1
Kümeleme yazılımıeisenlab.orgCluster: 3.0
Isı haritası yazılımıeisenlab.orgTreeview 1.60
Microarray istatistik yazılımıStanford ÜniversitesiSAM 4.0 (Mikrodizilerin Anlamlılık Analizi)
, PBS , , % % çalışma stoğu kullanın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224(2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555(2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Antigen MicroarrayAutoantibody DetectionTwo color DetectionIgG IgM DetectionMicroarray PrintingSerum ProbingFluorescent ScanningPBS BlockingSecondary AntibodySlide Alignment

İlgili makaleler