küçük moleküller ile antikorlar için etiketleme üzerine boncuk yöntem doğrudan hücre ortamından antikorlar, az miktarda etiketleme sağlar. Bu yöntem amin ve tiyol kimyası ile uyumlu ve paralel olarak çoklu örnekleri, elle veya otomatik platformları kullanarak işleyebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Floresan Boyalar ile Antikor Etiketleme Manyetik Protein A ve Protein G Boncuk kullanma
Bu makalede
Özet
Özet
Floresan boyalar, sitotoksik ilaçlar ve radyoaktif iz gibi küçük moleküller ile işaretlenmiş olan antikorlar, esas biyomedikal araştırmalarda araçları, bağışıklıkla ilgili tanı ve daha yakın olarak terapötik maddelerdir. küçük moleküller ile markalama antikorlar için geleneksel yöntemler, nispeten yüksek bir konsantrasyonda antikor saflaştınldı birden diyaliz adımları içerir ve veri akışını sınırlı gerektirir. Ancak, Antikor İlaç Eşlenikleri (ADC) alanında olmak üzere çeşitli uygulamalar, hücre ortamından doğrudan antikorların etiketleme sağlayacak yeni yöntemler yararlanacaktır. Bu tür yöntemler antikorlar örneğin, biyolojik olarak uygun deneylerde taranabilir izin verebilir, ADC'ler halinde reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme deneyi. Burada, doğrudan hücre ortamından antikorlar küçük miktarlarda etiketleme sağlayan bir yöntem olup (on-boncuk yöntemi) tarif eder. Bu yaklaşım antikorları yakalamak için yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G afinite boncuklar kullanıramin veya tiyol kimya ve etiketlenmiş antikorlar daha sonra elüsyon kullanılarak küçük moleküller ile etiketleme ve ardından hücre ortamından. küçük moleküller için suretler olarak floresan boyalar alırsak, biz doğrudan amin ve tiyol etiketleme kimyası her ikisini de kullanarak hücre medyadan üç farklı fare antikorları on-boncuk etiketleme göstermektedir. Protein A ve Protein G antikorların yüksek bağlanma afinitesi, yüksek geri kazanımlar olarak etiketlenmiş antikorların yüksek saflıkta sağlar. Buna ek olarak, manyetik boncuk kullanımı çoklu numuneler önemli oranda markalama verimliliği arttırır, elle kullanılmasına izin verir.
Giriş
Küçük moleküller ile etiketli antikorlar, belki de biyoloji 1,2 en yaygın olarak kullanılan reaktiflerdir. Floresan boyalar ve biyotin ile etiketlenmiş antikorlar yoğun diğer uygulamalar 3-6 arasında sitometrisi Western blot ve immüno-çökeltme, akış görüntüleme, bağışıklık kullanılır. Radyoaktif işaretli antikorlar 3,7 kanserlerin tedavisi için yeni seçenekler sunuyoruz, ve iki ADC zaten terapötik kullanım 8 için onaylanmıştır görüntüleme ve tedavi, sitotoksik ilaçlar (ADK) ile etiketlenmiş antikorlar yaygın kullanım bulmaktadır. Bunların yaygın kullanımı olmasına rağmen, etiketleme antikorlar için yöntemler şaşırtıcı değiş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Yüksek Kapasiteli Manyetik Protein A veya Manyetik Protein G Boncuk üzerine 1. Antikor Yakalama
- Düzgün nazik sallayarak manyetik boncuk yeniden askıya. boncuk aliquoting Süspansiyon üniforma tutun.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne boncuk çamuru 50 ul ekle. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun. Dikkatle depolama tamponu çıkarın.
- Antikor bağlama tamponu, 250 ul ekleyin.
- Mix ve 10 saniye manyetik stand koyun. Dikkatle bağlayıcı tampon kaldırmak.
- tanelerine antikorun 50-100 ug ihtiva eden numune 1.0 ml ilave edilir. Numuneler, hücre ortamında antikorlar ya da antikor arıtılabilir.
- vorteksli bir mikserde veya son ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanılarak küçük moleküller ile antikor etiketleme için bir şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Antikorlar etiketler amin kimyası kullanılarak, örneğin flüoresan boyalar, G boncuklar küçük moleküller ile etiketlenebilir manyetik Protein çekilen lizin amino asitler ya da antikor menteşe bölgesindeki düşük tiyoller etiketler, tiol kimya kullanılarak birincil aminlerdir. Antikorlar ve Protein G arasındaki bağ.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmanın amacı, küçük moleküllerin çeşitli, düşük konsantrasyonlarda, hücre ortamı içinde mevcut antikorları etiket için bir yöntem geliştirmektir. Antikor keşif erken safhalarında antikorların çok sayıda olanak sağlayacaktır bir yöntem olup, küçük moleküller ile işaretlenmiş olan bir biyolojik ilgili deneyi kullanılarak taranabilir için. Böyle bir deney, içselleştirme da benzer bağlanma afinitelerine sahip antikorlar arasında değişebilir reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme deneyidir. Bu nedenle, .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar Promega Corporation'ın çalışanlarıdır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Magne Protein A Boncuk | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Boncuk | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Süksinimidil Ester) | Yaşam Teknolojileri | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Yaşam Teknolojileri | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimid) | Yaşam Teknolojileri | A20347 | |
| Floresein-ME (Maleimide) | Yaşam Teknolojileri | F-150 | |
| Manyetik Stand | Promega | Z5332 |
Kaynaklar
- Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
