Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

Özet

RNA parçalayan DNAzime, üreaz ve manyetik boncuklardan yararlanan modifiye bir turnusol testi kullanarak E. coli'nin kolorimetrik tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Bakım noktası veya saha uygulamaları için belirli patojenleri tespit etmek için kullanılabilecek basit ama yine de etkili yöntemlere yönelik artan talepler var. Bu tür yöntemlerin kullanıcı dostu olması ve hem uzmanlar hem de profesyonel olmayanlar tarafından kolayca yorumlanabilecek güvenilir sonuçlar üretmesi gerekir. pH için turnusol testi, bir test numunesinin pH'ını basit bir renk değişikliği yoluyla bildirdiği için basit, hızlı ve etkilidir. Bakteri tespiti için turnusol testinden yararlanmak için bir yaklaşım geliştirdik. Yöntem, iki işlevi yerine getirmek için bakteriye özgü bir RNA parçalayan DNAzyme'den yararlanır: ilgilenilen bir bakteriyi tanımak ve üreaz aktivitesini kontrol etmek için bir mekanizma sağlamak. Bir DNAzime-üreaz konjugatı ile hareketsiz hale getirilmiş manyetik boncukların kullanılmasıyla, bir test numunesindeki bakteri varlığı, boncuklardan çözeltiye üreaz salınımına iletilir. Serbest bırakılan üreaz, üreyi amonyağa hidrolize etmek için bir test çözeltisine aktarılır ve bu da klasik turnusol testi kullanılarak görselleştirilebilen bir pH artışına neden olur.

Giriş

Bakteriyel patojenler global morbidite ve mortalitenin en önemli nedenlerinden biridir. Hastane kaynaklı enfeksiyonlardan, gıda kaynaklı patojenlerden ve çevredeki bakteriyel kontaminantlardan kaynaklanan salgınlar, halk sağlığı ve güvenliği için ciddi ve devam eden tehditler oluşturmaktadır. Bu salgınları önlemek için, çeşitli ortamlarda zamanında patojen tespitine izin veren etkili araçlara ihtiyaç vardır. Taşınabilir ve uygun maliyetli olan basit ama yine de etkili testler, özellikle salgınlara duyarlı olan ancak pahalı test tesislerini karşılayamayan bölgelerde büyük ölçüde rağbet görmektedir. ^1-3 Bakterileri tespit etmek için çok sayıda yöntem olmasına rağmen, bunların çoğu uzun test süreleri, pahalı aletler ve karmaşık test prosedürleri gerektirdiğinden tarama veya yerinde test araçları olarak uygun değildir.

Kolorimetrik testler, renk değişiklikleri çıplak gözle kolayca tespit edilebildiği için özellikle bakım noktası veya saha uygulamaları için çekicidir. pH için turnusol testi basit, hızlı ve etkilidir. Çok eski bir teknoloji olmasına rağmen, basitliği ve etkinliği nedeniyle günümüzde hala yaygın olarak kullanılmaktadır. Şaşırtıcı bir şekilde, bu basit test, yakın zamanda bu testi E. coli testi için modifiye etmeye yönelik bir yaklaşım geliştirmeden önce, diğer analitlerin tespitini sağlamak için hiçbir zaman değiştirilmemişti. ⁴

E. coli için genişletilmiş turnusol testi üç ek bileşen kullanır: bir E. coli ile aktive edilmiş RNA parçalayan DNA (EC1), ⁵ üreaz ve manyetik boncuklar. DNAzimler, katalitik aktiviteye sahip sentetik tek sarmallı DNA moleküllerini ifade eder. ⁶ İn vitro seçim kullanılarak rastgele dizi DNA havuzlarından izole edilebilirler. ^7,8 Oldukça kararlıdırlar ve yüksek verimli otomatik DNA sentezi kullanılarak uygun maliyetli bir şekilde üretilebilirler. ⁹ Bu nedenlerden dolayı, DNAzimler, özellikle RNA'yı parçalayan DNAzymler, biyo-algılama uygulamaları için geniş çapta incelenmiştir. Metal ^{iyonlarını,12-16 küçük molekülleri,17,18} bakteriyel patojenleri^5,19-21 ve kanser hücrelerini tespit etmek için ^6,10,11 RNA parçalayan DNAzim sensörleri geliştirilmiştir. ²² Hedefle indüklenen RNA parçalayan DNAzimlerin büyük mevcudiyeti göz önüne alındığında, bir DNAzyme kullanan herhangi bir test, çok çeşitli analitleri tespit etmek için potansiyel olarak genişletilebilir.

Üreaz, üreyi amonyağa hidrolize etme kabiliyeti nedeniyle ^{seçilmiştir,23,24} bu da pH artışına neden olur. Üreaz ayrıca oldukça verimli, stabildir ve diğer biyomoleküllere konjugasyon için uygundur. Bu nedenle, bir RNA-bölünme DNAziminin üreaz ile eşleniğinin, diğer hedeflerin tespiti için turnusol testinin kullanılmasına izin vereceğini varsaydık. ⁵

RNA parçalayan DNAzyme'in etkisi, DNAzime-üreaz konjugatı ile hareketsiz hale getirilen manyetik boncukların kullanılması yoluyla üreaz aracılı pH artışına iletilir. İncelenen DNAzyme'in aktivitesi sıkı bir şekilde E. coli'ye bağlı olduğundan, bu bakterinin test çözeltisindeki varlığı, manyetik boncuklardan çözeltiye üreaz salınmasına neden olacak, bu daha sonra alınır ve pH'a duyarlı bir boya içeren bir raportör çözeltide üreyi hidrolize etmek için kullanılır. Bu prosedürün nihai sonucu, boya veya pH kağıdı tarafından uygun bir şekilde rapor edilebilen bir renk değişikliğidir.

Protokol

Reaktifler ve Tamponlar hazırlanması 1.

1. 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA),
   1. 2 L'lik bir beher içinde, deiyonize damıtılmış 800 ml su ile 186.1 gr EDTA ekleyin (GKD ₂ O). NaOH peletleri ile 8.0 çözeltinin pH'ının ayarlanması. 1.0 L'lik son bir hacme O GKD ₂ ekleyin ve 4 ° C'de otoklav ve mağaza bir otoklav cam şişe çözüm aktarın.
2. 10 x Tris-borat EDTA (10x TBE)
   1. 4 L'lik bir plastik kabı içinde, tüm bileşenler kadar bir karıştırma çubuğu kullanılarak 4 L Karışım bir son hacme 432 g Tris-bazı, 200 g borik asit, 0.5 M EDTA (pH 8.0) ve GKD ₂ O 80 ml ​​ilave çözündürülür. 4 ° C'de otoklav ve mağaza 1 L cam şişe çözüm aktarın.
3. % 10 denatüre edici poliakrilamid Hazır
   1. F kadar çözeltisi ve GKD ₂ A: (1 29), 4 L'lik bir plastik kap olarak, 1681,7 g üre 400 ml 10x TBE, 40% akrilamid / bisakrilamid 1 L eklemeNominal hacmi üre çözünene kadar bir karıştırma çubuğu kullanılarak 4 L bir karışımıdır. 4 ° C 'de 1 L'lik amber cam şişe ve saklamak için bir çözüm aktarın.
4. Yükleme Tamponu 2x Jel (2x GLB)
   1. 200 ml'lik bir cam kabın içinde, 44 g üre, 8 g sakroz, 10 mg bromofenol mavi, 10 mg iksilen siyanol FF,% 10 sodyum dodesil sülfat 400 ul ve 10 x TBE ve 4 ml. 40 ml'lik bir son hacme O GKD ₂ ekleyin ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırılarak 50 ° C'de, hafif ısıtma ile bileşenleri çözülür. 4 ° C'de Aktarım 1 mi, 1.5 ml mikrofüj tüplerine kısım saklayın.
      Not: Ön kullanımı herhangi bir katı yeniden çözünmesi için 90 ° C'de kısa bir ısıtma gerektirir.
5. 1 M Tris-hidroklorür (Tris-HCl) (pH 7.5)
   1. Bir cam şişe içerisinde, Tris-bazın 12.1 g ve GKD ₂ O 70 ml ilave edilir ve katı madde çözülene kadar karıştırın. 1 M hidroklorik asit (HCI) ile pH'ı 7.5'e ayarlayın. 100 mi, otoklav ve taştan bir son hacme GKD ₂ O eklemere 4 ° C'de
6. 5 M sodyum klorür (NaCI)
   1. Bir cam şişe içerisinde, GKD ₂ O 150 ml NaCI 58.4 g çözülür GKD ₂ O. ile 200 ml ses seviyesini ayarlamak 4 ° C'de saklayın.
7. DNA, Seyreltme Tampon maddesi
   1. bir cam şişe içinde, 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 8.0 5 M NaCl mi ve 0.5 M EDTA, 0.4 mi (pH 8.0) içinde 2.0 ml karıştırılır. GKD ₂ O, 4 ° C'de otoklav ve mağaza ile 200 ml ses seviyesini ayarlayın.
8. 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) (pH 7,4)
   1. Bir cam şişe içerisinde, GKD ₂ O 80 ml ​​HEPES, 2.38 g çözülür 5 N NaOH kullanılarak 7.4 pH ayarlamak ve 100 ml lik bir son hacme GKD ₂ O ekleyin.
9. 1 M magnezyum klorür _(MgCI2)
   1. Bir cam şişe içerisinde, _MgCl2 -6H ₂ O 2.03 g ekleme ve GKD ₂ O ile 100 ml'ye ses getirmek
10. Reaksiyon Tamponu (RB)
    1. 50 ml konik bir tüp içinde, 1 M HEPES (pH 7.4), 5 M NaCI, 1.5 mL, 1 M _MgCl2, 0.75 mi, ve Tween-20 5 ul 50 ul ekle. 50 ml'lik bir son hacme O GKD ₂ ekleyin. çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre.
11. Bağlama Tamponu (BB)
    1. 50 ml konik bir tüp içinde, bir son hacim için O GKD _2; 1 M Tris-HCI (pH 7.5), 500 ul, NaCI 8.8 g, _MgCl2, 1 M, 50 ul, Tween 20 5 ul 50 ml. çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre.
12. Substrat solüsyonu (SS)
    1. 50 ml'lik konik bir tüp içinde, NaCI 5.8 g, 1 M 3 mL _MgCl2, 1.5 g üre ve GKD ₂ O 40 ml ilave 10 mM HCI kullanılarak 5,0 çözeltinin pH'ının ayarlanması. Çözelti tamponlu olduğundan, HCI kullanılarak pH ayarlamakdikkatle küçük HCI alikotları eklenmesi ile. 50 ml'lik bir son hacme O GKD ₂ ekleyin.
    2. çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre.
13. Luria Bertani (LB) Broth
    1. Beher, GKD ₂ O 1 L 20.0 g LB tozu çözmek 4 ° C'de bir cam şişe, otoklav ve saklamak için aktarın.
14. % 1.5 LB agar
    1. 250 ml'lik bir şişe içinde, 1.5 g agar ve LB suyu 100 ml. 4 ° C'de otoklav ve saklayın.
15. agar Tabaklar
    1. Bir mikrodalga LB agar tekrar çözündürülmesi ve çözeltiye ~ 50 ° C soğutulur. Petri kaplarına solüsyonu dökün ~ 5 plakaları yapmak ve onları katılaşmaya sağlar.

2. sentezi ve E. saflaştırma coli- duyarlı DNAzim EC1

1. Şablon aracılığı Enzimatik Ligasyonu ile EC1 sentezi
   1. comm arındırınticari olarak uygundur, sentezlenmiş oligonükleotidler BS1, DE1 ve T1,% 10, standart protokollere göre poliakrilamid jel elektroforezi (dPAGE) denatüre edici ile (Tablo 1 'de verilen sekansları).
   2. BS1, DE1 ve T1 100 uM stok hazırlayın. kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın.
   3. 1.5 ml mikrofüj tüpüne, enzim ile ilgili olarak (500 mM Tris-HCI (pH 7.6), 100 mM _MgCl2 sağladığı GKD ₂ O 38.5 ul, DE1 5 ul ve 10 x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu 5 ul 50 mM ditiotreitol (DTT), 1.0 mM spermidin).
   4. adenosin trifosfat (ATP) (100 mM) 1 ul ekle. T4 polinükleotid kinaz 5 birim (10 U / ul) eklenir. reaksiyon karışımına dikkatli bir pipetleme karıştırın.
   5. 30 dakika için 37 ° C 'de reaksiyon inkübe edin.
   6. 5 dakika boyunca 90 ° C'ye kadar ısıtılarak, reaksiyonun sönmesi.
   7. GKD ₂ O 118 ul, BS1 5 ul ve T1 5 ul ekleyin. 2 mi, 90 ° C tepkime ısısın, ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğutulur.
   8. Enzim, tedarikçi tarafından sağlanan 10 x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu 20 ul ekle (400 mM Tris-HCI (pH 7.8), 100 mM _MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). T4 DNA ligazı, 10 birim (5 U / ul) ilave edilir ve dikkatli bir şekilde pipetle karıştırılır.
   9. 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
   10. 3 M sodyum asetat (NaOAc) (pH 5.2) 20 ul soğuk% 100 etanol 500 ul ekle. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika için -20 ° C dondurucu içinde bir tüp yerleştirmek.
   11. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de mikrofüj santrifüj. Dikkatle pipetleme süpernatant kaldırmak.
   12. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g hızında tekrar soğuk% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. Bir kez daha süpernatant kaldırmak ve 10 dakika süre ile, vakum altında pelet kurutulur.
   13. GKD ₂ O 15 ul DNA tekrar ve daha sonra 2x GLB 15 ul ekleyin.
   14. 90 ° C'ye kadar kuvvetli bir şekilde karıştırın ve ıslak sertleştirilmesi için2 dak. Aşağıda tarif edildiği gibi,% 10 dPAGE tam uzunlukta DNA saflaştırılır.
2. % 10 dPAGE Kurma
   1. Temiz iki cam levha (bir tam plaka ve bir çontuklu), iki 0.75 mm kalınlığında aralama ve 12 kuyu tarak. İki her iki tarafta spacers ve üstüne çentikli plaka ile düz bir yüzeye bir cam plaka yatıyordu. Birlikte tedarikçi tarafından sağlanan dört klipler kullanarak iki tabak Clip.
   2. 150 ml'lik bir plastik kabı içinde,% 10 dPAGE 40 ml, tetrametiletilendiamin 40 ul (TEMED) ve% 10 amonyum persülfat (APS), 400 ul dökün. bileşenleri karıştırın ve yavaş yavaş plakalar arasına çözüm dökün.
   3. Tarak yerleştirin ve sonra jel üzerinde 10 dakika polimerize izin verir. Jel polimerize edildikten sonra, yavaş yavaş tarak kaldırmak ve GKD ₂ O. ile kuyu yıkayın
   4. jel elektroforezi aparat üzerine plakaları monte edin. aşırı ısınmayı önlemek için üretilen ısıyı dağıtmak için bir metal plaka kullanın.
   5. Üst ve alt bölmelere üzerine 1x TBE dökünve kuyular iyi tampon batık emin olun. Bir pipet veya şırınga kullanarak 1x TBE ile kuyu yıkayın.
   6. yükleme örnekleri önce 15 dakika için 35 mA'da için cihaz ve önceden çalıştırılmış ayarlayın.
3. % 10 dPAGE den Bağlanmış EC1 elüsyon
   1. Adım 2.2.6 ardından, alt boya (Bromophenol mavi) kadar 35 mA jel çalıştırmak cam plakanın alt ulaşır. Bu, yaklaşık 1.5 saat sürer. Gücü kapatın ve cihazdan plakaları çıkarın.
   2. kağıt havlu birkaç yaprak tabak Lay ve dikkatle cam plakalar gelen aralayıcılar kaldırın. Dikkatli bir şekilde üst cam plaka kaldırmak ve plastik wrap ile jel sarın.
   3. ikinci cam plakayı kaldırın ve tekrar plastik wrap ile karşılamak için jel çevirin. plastik wrap kırışıklıkları önlemek için özen gösterin.
   4. 4 farklı DNA bantları (Tam bağlanan EC1, DE1, BS1 ve T1) üretecek UV gölgeleme (260 nm) kullanarak bağlandı ürünü gözünüzde canlandırın.
   5. Tüketim 1.5 ml mikrofuge'de tüp steril bir jilet ve transferi ile üst bant (EC1). ince bir hamur haline dönene kadar steril bir pipet (200 ul uç boyutu) ile jel Crush. DNA elüsyon tamponu 550 ul ekle gömülü fluorofor korumak için alüminyum folyo ile tüp kapağı ve 15 dakika boyunca çalkalayın.
   6. 5 dakika boyunca 20.000 xg'de jel çözüm Santrifüj ve dikkatli bir 1.5 ml mikrofuge'de tüp süpernatant 400 ul aktarın. pipetleme sırasında jel parçaları çekilmesi kaçının.
   7. transfer süpernatan ile mikrofüj tüpe 40 3 M NaOAc (pH 5.2) içinde ul soğuk% 100 etanol içinde 1.0 ml. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika için -20 ° C dondurucu içinde bir tüp yerleştirmek.
   8. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de mikrofüj santrifüj. Dikkatle pipetleme süpernatant kaldırmak.
   9. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g hızında tekrar soğuk% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. Bir kez daha, kaldırmakSüpernatan 10 dakika için vakum altında pelet kurutulur.
   10. 260 nm'de UV absorbansı ölçerek EC1 konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 uM stok yapmak ve kullanılana kadar -20 ° C'de örnek saklayın.

DNA üreazın 3. Konjugasyon

1. Sukinimidil 4- (N-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat (SMCC), hisse senedi hazırlanması
   1. DMSO 676 ul 1 mg SMCC çözülür. kullanılana kadar buz üzerinde girdap ve yer.
2. Üreaz Stokta hazırlanması
   1. 1 x PBS (Mg ^{+ 2} veya Ca ^{+ 2),} 1 ml 1 mg üreaz çözülür. Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin.
      Not: Kristalize üreaz çözünmesi yavaştır ve yumuşak karıştırma denatürasyon önlemek için gereklidir.
3. Üreaz-DNA sentezi (UrDNA)
   1. 2.5 mi mikrofüj tüpüne 100 uM LD1 10 ul ekle. GKD ₂ O 140 ul 10x PBS 40 ul ve vorteks ekleyin.
   2. SMCC s 80.5 ul ekleyintak, bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak DMSO, girdap ve kısaca santrifüj 159.5 ul.
   3. 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. mikrofuge'ye kapağın altında yoğuşmayı önlemek.
   4. 1x PBS 200 ul 3 M NaOAc (pH 5.2), 60 ul soğuk% 100 etanol içinde 1.5 ml. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
   5. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin çözeltisi. Süpernatantı ve vakum altında pelet kurulayın. aşırı kurumayı önlemek.
   6. Kurutulmuş pelet, üreaz stokunun 400 ul, 5 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
   7. Önceden yıkanmış 100K MWCO santrifüj filtre kolonuna ham konjügat 200 ul aktarın. 5 dakika boyunca 14.000 x g'de sütun santrifüjleyin.
   8. 5 dakika boyunca 14.000 x g'de kolon ve santrifüj ham konjügat kalan 200 ul aktarın. sütunu kaldırmak ve yeni bir 2.0 ml mikrofuge'de tüp ( "toplama tüpüne") olarak baş aşağı yerleştirin.
   9. Santrifüjuge 2 dakika süreyle 1000 xg'de (ters sütun ile) toplama tüpü. toplama tüpünü çıkarın ve konjugatlarının ek kurtarma için membran yıkamak için santrifüj sütuna 1x PBS 30 ul ekleyin.
   10. Bir kez daha sütunu ters ve geri toplama tüpünün içine koyun. 2 dakika süreyle 1000 xg'de (ters sütun ile) toplama tüpü santrifüj. Çıkarın ve sütun atmayın.
   11. kullanılana kadar 4 ° C 'de UrDNA saklayın.

Manyetik boncuklar üzerine EC1 ve UrDNA 4. Montaj

1. gibi manyetik boncuk (MB) stok karıştırın ve 1.5 ml mikrofüj tüpe MB süspansiyon 100 ul aktarın. MB izole bir manyetik raf tutucu mikrofuge'ye tüpü yerleştirin.
2. pipetle ile süpernatantı ve tüp tampon (BB) bağlayıcı 150 ul ekleyin. tutucudan tüpü çıkarın ve dikkatlice homojen bir çözüm MB tekrar süspansiyon tüp dokunun. t süspansiyon sıçramasını önlemektüp ya da kap op. Böyle bir durumda, kısaca geri süspansiyona kalıntı dönmeye bir tezgah üstü santrifüj kullanın.
3. Adımı yineleyin 4.2 iki kez daha.
4. Bu süspansiyona 10 uM EC1 10 ul ekle. Dikkatle tüp dokunarak karıştırın.
5. Hafif 30 dakika boyunca çalkalayarak çözelti inkübe edin. MB çökmesini önlemek için tüpü her 2-3 dakikada bir dokunun.
6. MB izole ve pipetleme süpernatant kaldırmak için geri manyetik raf mikrofuge'ye tüpü yerleştirin. (Adım 4.2 de tarif edildiği gibi) BB 150 ul MB üç kez yıkayın.
7. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, BB 150 ul bir toplam MB askıya. Bu çözeltiye, UrDNA 15 ul ilave edin ve 2 dakika boyunca 45 ° C'ye kadar çözelti ısıtılır. Solüsyon oda sıcaklığına kadar soğutulur ve 2 saat süreyle inkübe edin.
8. MB izole ve pipetleme süpernatant kaldırmak için geri manyetik raf mikrofuge'ye tüpü yerleştirin.
9. Reaksiyon tampon maddesi (RB), 100 ul ekle. t kaldırO manyetik raf tüp mikrofuge'ye ve dikkatle MB tekrar süspansiyon.
10. adım 4.9 tekrarlayarak MB üç kez yıkayın.
    NOT: yıkanmış süpernatant hızla Melezleşmemiş UrDNA hala mevcut olup olmadığını bir yanlış pozitif sinyal neden olabilir, hangi belirlemek için test edilebilir. Test yıkama çözeltisine kırmızı 50 mM üre 10 ul ve% 0.04 fenol 10 ul ekleyerek yapılabilir. yıkama çözeltisi bir renk değişimine neden olmaz kadar MB yıkamak devam edin. 100 ul süspansiyon kullanilana kadar 4 ° C'de saklanır.

Bakteriyel hücreler ²⁰ 5. hazırlanması

1. Kültürleme E. Stoklar gelen coli
   1. Plaka E. E. coli K12, bir alev altında veya biyolojik bir güvenlik kabini, bir gliserol stokundan LB agar kaplan üzerine (MG1655).
   2. Steril bir pipet ucu kullanarak, yavaşça LB agar delinmesiyle önlemek için gliserol stok ve hafifçe çizgi bir agar plaka yüzeyi dokunun.
   3. Kesikli invertPlaka ve 14 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. 3 haftalık bir süre için 4 ° C sıcaklıkta Parafilm ile plaka ve mağaza kapatın.
2. Kültürleme E. Hücre Sayımı için coli
   1. steril 14 ml kültür tüpünde, LB suyu 2 ml dağıtın.
   2. Steril bir pipet ucu kullanarak, adım 5.1 hazırlanan çizgili agar plakasından tek bir koloni almak ve kültür tüpüne aktarın.
   3. 37 ° C 'de kültür inkübe ve 14 saat boyunca 230 rpm'de çalkalanır.
   4. Seri olarak 10-misli aralıklarla bakteri kültürü seyreltin.
   5. Her bir seyreltilmiş numune için eşit, ayrı LB agar plakaları üzerinde beş 100 ul alikotları plaka. plakalar ters çevirin ve 14 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   6. Her bir seyreltme ortalama hücre konsantrasyonu elde etmek üzere her numune hücreleri sayın.
      NOT: 10 ⁷ hücreleri genellikle E. için bir referans turnusol testi kurmak için kullanılan E. Bu seviyeye kadar coli E. coli hızlı bir renk chan tetikleyebilirge. Sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi Ancak, düzgün idam turnusol testi gibi düşük 500 hücreleri tespit edebilir.
3. E. hazırlama Test coli hücreleri
   1. arzu edilen bir hücre süspansiyonu için, transfer 1.5 ml mikrofüj tüpüne kültürlendi, 1 mL stok.
   2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak.
   3. Hücre topağı, reaksiyon tampon maddesi 10 ul ilave edin ve tekrar süspansiyon hücreleri. 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu sonikasyon. 5 dakika için bir buz kutusu hücre süspansiyonu aktarın.
   4. 5 dakika daha hücre süspansiyonu sonikasyon.
   5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13,000 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. Test için supernatant (10 ul) kullanır.

6. Litmus Testi

1. 1.5 ml mikrofüj tüpüne, mikrofüj tüpüne reaksiyon tampon maddesi (RB) 100 ul ilave edildi ve vorteks yoluyla tüp ön yıkama vetampon atarak.
2. Aktarım yıkanmış mikrofüj tüpe monte EC1 (protokol 4) 15 ul.
3. Bir manyetik rafa mikrofuge'ye tüp yerleştirerek manyetik boncuk yıkayın. pipetleme süpernatantı. , Raftan mikrofuge'ye tüpünü çıkarın RB 100 ul ekleyin ve dikkatlice manyetik boncuklar tekrar süspansiyon.
4. adım 6.3 yineleyerek MB iki kez yıkayın.
5. , Manyetik rafa geri mikrofuge'ye tüpü yerleştirin süpernatant kaldırmak ve 10 ul E. ekleyin E. coli örnek adım 5.3 hazırlanan.
6. yavaşça mikrofuge'de tüp dokunarak dikkatlice örnek ve manyetik boncuk karıştırın.
7. 1 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin.
8. Reaksiyona, GKD ₂ O 90 ul ekleyin ve bir manyetik raf üzerine mikrofuge'ye tüp yerleştirin.
9. Sonra manyetik ayırma yaklaşık 3 dakika, dikkatle 0.5 ml mikrofuge'de tüp süpernatant 85 ul aktarın. yavaş yavaş süpernatant geri çekinherhangi bir manyetik boncuk toplama kaçının.
10. Yukarıdaki mikrofüj tüpe% 0,04 fenol kırmızısı 15 ul ve alt-tabaka çözeltisi 100 ul ilave edin.
11. renk değişikliği kaydetmek için belirli zaman aralıklarında bir fotoğraf çekmek.
    Not: pH değişikliği bir mikroelektrot içeren bir pH metre kullanılarak izlenebilir. Başlangıç ​​pH yaklaşık 5,2-5,5 olmalıdır (çözüm sarı renkte). Aksi takdirde, çözelti, 1 mM asetat tampon pH 5.0) ilavesiyle ayarlanabilir.

Sonuçlar

Bakteriyel test edeceği prensibi Şekil 1 'de açıklanmıştır Test üç temel malzeme kullanır. Belirli bir bakteri, üreaz ve manyetik boncuklar ile aktive olan bir RNA klivaj DNAzim. DNAzim ilgi konusu bir bakterinin yüksek düzeyde spesifik tespit elde etmek için moleküler tanıma elemanı olarak kullanılır. Üreaz ve manyetik boncuk DNAzıme RNA klivaj aktivitesinin sinyal transdüksiyonunu elde etmek için kullanılır. Bu üreaz-DNAzim konjugatlarının ihtiva manyetik boncuk ol...

Tartışma

Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir turnusol test etmek için bir bakteri duyarlı DNAzıme RNA bölünme etkinliğinin etki yaptı, üreaz ve manyetik ayırma kullanımı ile mümkün olmaktadır. Bakteriyel tespiti için modifiye test edeceği gösteri rağmen E ile yapılan E. coli bağımlı RNA-yaran DNAzim, ^5,19,20 tasarım genellikle herhangi RNA-yaran DNAzıme için uzatılabilir. Yeni hedefler için rasgele dizi havuzlarından yeni RNA-yarma DNAzımler izole etmek farklı analitler ve çeşitli ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	VWR AMRESCO	0105
Sodyum Hidroksit (NaOH) peletleri	BIO BASIC CANADA INC.	SB6789
Tris bazlı	VWR AMRESCO	0497
Borik asit	AMRESCO	0588
Üre	VWR AMRESCO	M123
%40 akrilamid/bisakrilamid (29:1) çözeltisi	BIO BASIC CANADA INC.	A0007
Sucrose	Bioshop Kanada inc.	SUC507
Bromofenol mavisi	Bioshop Kanada inc.	BRO777
Ksilenesyanol FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
%10 sodyum dodesil sülfat	Bioshop Canada inc.	SDS001
Hidroklorik Asit (HCl)	CALEDON LABORATORIES LTD	6026
Sodyum Klorür (NaCl)	Bioshop Canada inc.	SOD001
4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)	Bioshop Canada inc.	HEP001
Magnezyum Klorür (II) hekzahidrat	VWR AMRESCO	0288
Tween 20	Bioshop Kanada inc.	TW508
Adenozin Trifospapat (ATP)	AMRESCO	0220
Sodyum Asetat trihidrat (NaOAc)	SIGMA-ALDRICH	S8625
Etanol	Ticari Alkoller	P016EAAN
Tetrametiletilendiamin (TEMED)	AMRESCO	0761
%10 Amonyum persülfat (APS)	BIO BASIC CANADA INC.	AB0072
Süksinimidil 4- ( N < / em >-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat (SMCC)	ThermoFisher SCIENTIFIC	22360
Dimetil sülfoksit (DMSO)	CALEDON LABORATUVARLARI	803540
Üreaz	SIGMA-ALDRICH	U0251
1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	ThermoFisher BİLİMSEL	70011-069
% 0.04 Fenol kırmızısı	SIGMA-ALDRICH	P3532
10x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu	Lucigen	30061-1
10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu	Bio Basics Canada	B1122-B
T4 DNA ligaz (5 U/&# 956; l)	Thermo Fischer Scientific	B1122
Luria Bertani (LB) Et Suyu	AMRESCO	J106
Agar	AMRESCO	J637
T4 polinükleotid kinaz (10 U/μ l)	Lucigen	30061-1
E. coli< / em> K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
Santrifüj	Beckman Coulter, Inc.
Cam plakalar	CBS scientific	ngp-250nr
0,75 mm kalınlığında ara parçalar	CBS scientific	VGS-0725r
12 kuyulu tarak	CBS scientific	VGC-7512
UV Lambası	UVP	95-0017-09
Spektrofotometre (NanoVue)	GE Healthcare	N/A
Metal plaka	CBS Bilimsel	CPA165-250
Vorteks	VWR Uluslararası	58816-123
Jel elektroforez cihazı	CBS bilimsel	ASG-250
Petri kapları	VWR Uluslararası	25384-342
100 kDa MWCO santrifüj filtreler	EMD Millipore UFC510024
Manyetik Boncuk (BioMag)	Bangs Laboratories Inc	BM568
Manyetik Ayırma Rafı	New England BioLabs	S1506S
Mikrofüj tüpleri	Sarstedt	72.69
Şırınga filtresi (0.22 &# 956; m)	VWR International	28145-501
14 ml kültür tüpü	VWR International	60818-725
Hücre kültürü inkübatörü	Eppendorf Scientific	M13520000
Branson Ultrasonik temizleyici	Branson	N/A
(Canon Powershot G11)	Canon	N/A
50 ml konik tüp	VWR International	89004-364