Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Deneysel Enfeksiyon

12.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54554

⸱

16 Kasım 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır.

Özet

L. monocytogenes, insanlarda gıda kaynaklı bir hastalık nedeni olan gram pozitif bir bakteridir. Bu patojenin farelerin deneysel enfeksiyon hücre içi patojenlere karşı konak bağışıklık doğal ve kazanılmış bağışıklık hücreleri ve belirli sitokinler rolü son derece bilgilendirici olmuştur. L. monositogenleri öldürücü enfeksiyon sırasında doğal hücreler tarafından IFN-y üretimi, makrofajları ve patojen 1-3 erken harekete geçirilmesi için çok önemlidir. Buna ek olarak, uyarlanır bellek lenfositler tarafından IFN-γ üretimi yeniden enfeksiyona 4 üzerine doğal hücrelerinin aktivasyonunu kullanıma hazırlanması için çok önemlidir. L. böylece enfeksiyon modeli monocytogenes IFN-γ üretimini artırmak için tasarlanmış yeni tedaviler in vivo IFN-γ yanıtları üzerinde bir etkiye sahip ve bu tür bakteriyel açıklık artan ya da fare sağ kalımı iyileştirmek gibi üretken biyolojik etkilere sahip olup olmadığını araştırmak için harika bir araç olarak hizmet vermektedir itibarenenfeksiyon. L. monocytogenes EGD suşu ile C57BL / 6J fareler intraperitoneal enfeksiyonları yapmak için ve akış sitometrisi ile NK hücreleri, NKT hücreleri ve adaptif lenfosit IFN-γ üretimini ölçmek için nasıl temel protokol, aşağıda tarif edilmiştir. (1) büyür ve aşılama için bakteri hazırlanması (2) uç noktalara dalak ve karaciğer, ve (3) ölçüsü, hayvan yaşam bakteri yükünü ölçmek: Buna ek olarak, prosedür tarif edilmektedir. Örnek verileri, bu enfeksiyon modeli L. monocytogenes ve bu enfeksiyonun farelerin hayatta kalması için, IFN-γ yanıtları belirli maddelerin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için verilmiştir.

Giriş

IFN-γ, hücre içi patojenlere karşı bağışıklık aracılık edecek ve tümör büyümesini 5 kontrol edilmesi için önemli olan bir sitokindir. Bakteriyel direnç, bu sitokinin önemi IFN-γ sinyalleme yolağında mutasyonlar mikobakteriler ve Salmonella 6 ile enfeksiyona karşı oldukça hassas olan sahip insanlar gözlem belirgindir. Aynı şekilde, fare IFN-y ya da L 10,11 monocytogenes dahil olmak üzere, mikobakteriler 7-9 ve diğer hücre içi patojenlere dirençte, IFN-γ reseptör sergi kusurlar ya Layişmanya majör 12, Salmonella typhimurium 13, ve bazı virüsler 11 eksikliği olan. Mücadele patojenlere ek olarak, IFN-γ tümörlere 14 karşı konak savunma önemli bir rol oynar. IFN-y ve yüksek üretim enfeksiyon ya da kanser bağlamında faydalı olmasına rağmen, bu sitokinin uzun süreli üretim t bağlantılıdırObez olmayan diyabetik fare modelinde 18 sistemik otoimmün 15-17 geliştirilmesi ve Çeşidi hızlandırılmasına O I diyabet.

IFN-y önemli kaynaklar, NK hücreleri, NKT hücreleri, γδ T hücrelerini, T yardımcı-1 (Th1) hücreler ve sitotoksik T lenfositler (CTL), 5,19,20 içerir. IFN-γ ile doğal ve kazanılmış bağışıklığı hem de geliştirir: (1) yukarı-regüle (3) arttırıcı makrofaj, (2) antijen sunan hücrelerde ko-stimülatör moleküllerinin ekspresyonunu arttırarak, majör histo-uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I ve II ifadesini fagositoz ve pro-inflamatuar sitokinlerin üretimi ve mikrop öldürücü etkenler (örneğin, nitrik oksit ve reaktif oksijen türleri), (4) (5) (immünoglobülin antikor sınıfı anahtarlama teşvik Th1 efektör hücrelere naif CD4 + T hücrelerinin farklılaşmasını teşvik Ig) 2a ve farede IgG3 (), (6) kemokinlerin üretimini indükleyen I sitelerine immün hücreleri işenfection, ve (7), NK hücreleri ve CTL karşılıklarını 5,19 artar. Patojenler ve tümörlere yanıtta IFN-y hayati önemi göz önüne alındığında, rekombinant IFN-γ (19 gözden) çeşitli enfeksiyonlara ve habis için bir tedavi olarak test edilmiştir. IFN-y ya da Th1 teşvik sitokin interlökin-12 (IL-12) ve sistemik uygulama yan etkileri ile ilişkili olan ve dozla ilişkili toksisite 19,21 olduğu için, ancak, IFN-γ üretimi artırmak için alternatif stratejiler geliştirilmesinde ilgi vardır immün hücreleri. Yeni biyolojik ve küçük moleküllerin geliştirilmesi, bu tür maddeler, bir immün tepkisi sırasında IFN-γ üretimini artırmak olmadığını test etmek için in vivo tarama araçları gerektirir olup, bu, hayvan hayatta kalma arttıkça anlamlı bir biyolojik etki anlamına gelir.

Gram-pozitif bakteri L. monocytogenes ile farelerin deneysel enfeksiyon için bir enstrümantal model olmuşturhücre içi patojenlere 1,22 karşı konak-bağışıklık IFN-y rolünü deşifre. patojen intravenöz veya intraperitoneal (ip) ile farelerin enfeksiyonu günlerce sonrası 3 ila 4 oluşan dalak zirve bakteriyel yükleri ile ikamet makrofajlar ve hepatositler tarafından içselleştirilmiş hale dalak ve karaciğer, bakterilerin hızla yayılmasına yol açar enfeksiyon 1,3,22. NK hücreleri ile IFN-y üretimi, makrofaj aktivasyonu ve patojen 3 karşı erken direnç için de önemlidir, Bununla birlikte, yüksek enfeksiyon dozlardaki, IFN-y üretimi, aynı zamanda patojen açıklık 23 için zararlı olabilir. NKT hücreleri, aynı zamanda patojen 2,24 erken kontrolü sırasında dalak ve karaciğerdeki IFN-y kaynağı ve bu üretim, NK hücreleri 2 dahil olmak üzere başka hücre tipleri tarafından IFN-γ üretimini yükseltmek için gösterilmiştir. Parti Diğer yandan, uyum sağlayıcı T lenfositler, daha sonra etkili, CD8 + T hücrelerivasküler, patojen temizlenmesini aracılık yeniden enfeksiyon 1,4,22 karşı koruma sağlamak için önemlidir.

Bu enfeksiyon modeli (1 gözden) bir takım nedenlerden araştırmacılar için cazip olmuştur. İlk olarak, patojen enfeksiyonu yüksek tekrarlanabilir ve Th1 ve güçlü hücresel bağışıklık tepkisi oluşturur. İkinci olarak, öldürücü enfeksiyon sırasında, bakteri yükü kolayca ölçülebilir karaciğer ve dalakta konsantre edilir. Üçüncü olarak, patojen güvenle Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) koşullar altında ele alınabilir. Dördüncüsü, organizma ve bağışıklık tepkisi bu kapsamlı karakterize edilmiştir üretir olduğunu. Son olarak, mutant ve genetik olarak modifiye edilmiş suşların çeşitli kullanım için uygun olduğu geliştirilmiştir.

L. EGD suşu ile C57BL / 6J fareler aşılama için temel protokol, burada 25 monositogenlerinden olarak tanımlayan ve IFN ölçüm - γ yenidenNK, NKT ve adaptif lenfositler sonrası enfeksiyon tarafından leflimleri. Ayrıca açıklanan öldürücü enfeksiyon sonrası bakteri dalak yükü ve karaciğer ölçmek ve patojenin değiştirilmiş LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra hayatta kalma çalışmaları yürütmek için nasıl. Son olarak, Örnek veriler, bu protokol, L. monocytogenesin IFN-γ yanıtları ve fare hayatta kalma ile ilgili yeni tedavilerin etkisini taranması için kullanılabilir nasıl gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Güvenlik Bildirimi

Bu protokol, canlı L. monositogenleri farelerin enfeksiyonu açıklanmaktadır. patojen bağışıklığı olmayan eğitimli personel tarafından BSL2 şartlarında güvenle ele alınır. Bağışıklığı baskılanmış kişiler HIV ile enfekte olan veya immünsupresif tedavi ile tedavi gerektiren kronik koşulları hamile kadınlar, yaşlılar ve bireyler bulunmaktadır. Enfekte örnekleri işlerken Personel koruyucu laboratuvar önlüğü veya cüppe, eldiven, maske ve göz koruyucu don gerekir. Burada tarif edilen çalışma Üniversitesi Sağlık Ağı tarafından (UHN) Biyogüvenlik ofis yayınlanan bir sertifika (# 32876) altında BSL2 koşulları altında gerçekleştirilmiştir. enfekte olmuş fareler ya da herhangi bir kullanılmayan dokularından karkaslar çift torbalı ve biyolojik tehlike atık bertaraf edildi. Enfekte farelerin kafesleri de otoklav ile dekontamine edildi.

Etik Beyanı

Fareler muhafaza ve Quara enfekte edildintine UHN hayvan tesisleri içinde oda ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından belirlenen kurallara uygun olarak bakım için. fareler üzerinde tüm işlemler UHN hayvan bakım komitesi tarafından onaylandı hayvan kullanımı protokol # 3214 altında gerçekleştirilmiştir. Etik kaygılar nedeniyle, ölüm hayatta kalma çalışmaları için bir son nokta olarak kullanılmamıştır. L. burada bildirilen değiştirilmiş LD 50 dozunun enfeksiyonu, farelerin% 50'si,% 20, vücut ağırlığında kayıp ya da aşağıdaki klinik işaretlerin en az iki gösteren oluşan belirli bir son noktalar, ulaştığı doz olarak belirlenmiştir monocytogenes: uyuşukluk, karıştırdı kürk, kambur duruş, nefes darlığı, donuk veya batık gözler. Onlar UHN tesis kurallarına göre karbondioksite maruz yoluyla uç noktaları (CO 2) ulaştığında farelere ötenazi uygulandı.

Uzun vadeli depolama için Gliserin Stoklar 1. Hazırlık

NOT: Bu prosedür nasıl gliserol stokları açıklarL. monocytogenes EGD suşu orijinal gliserol stokundan hazırlanır. aerosoller üretmek potansiyeline sahip Adımlar sertifikalı biyogüvenlik kabini (BSC) içinde yapılmalıdır.

  1. bakteri üremesi için beyin kalp infüzyon (BHI) ağar tabak hazırlayın. Bu% 3.8 ilave için BHI et suyu ve% 1.5 (w / v) agar damıtılmış ikiye katlamak için (a / h) H2O (GKD 2 O). Otoklav sıvı. ağar, 50 ° C'ye soğuduktan sonra, bakteriyel petri çanaklarına sıvısının dağıtılması (25 ml / kutu) ve 1 saat BSC kuru levhalar (ortaya) sağlar.
    NOT: otoklav sonrası 50 ° C su banyosunda içine aktarın BHI agar önce plakaları dökme için katılaşma önlemek için. ters (üstte medya yüzü) kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın BHI plakaları.
  2. Sıvı BHI ortamı hazırlayın. Bunun için, GKD 2 O otoklavda BHI et suyu (ağ / hac)% 3.8 karıştırın.
  3. L. monocytogenes EGD suşu dondurulmuş gliserol stok kaldırmak -80 C ° dondurmaR ve oda sıcaklığına kadar eritilir.
  4. Bir BHI plakası bir bölümü boyunca ileri geri steril bir pipet çözülmüş gliserol stok ucu ve hemen çizgi ucu batırın. Bu birincil çizgi olduğunu.
  5. (Bu ikincil çizgi ise) 90 ° C plaka çevirin ve taze bir pipet kullanarak, ilk çizgi boyunca sürükleyin ve plaka sonraki ¼ kadar yayıldı. üçüncül çizgi yapmak için bir kez daha tekrarlayın.
  6. ters plaka getirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Tek tek tip koloniler çizgiler son setinde elde 16 ve 24 saat arasında görülebilir olmalıdır.
  7. steril havalandırılmış 50 ml tüp içine steril BHI et suyu 10 ml koyun. Steril bir pipet kullanarak plaka L. monocytogenes bir koloni seçin ve suyu aşılamak. Bir gecede ya da OD 600 = min (rpm) 225 devirlerde ayarları ile 1.0 kadar 37 ° C yörünge sallayarak inkübatör kültür inkübe.
    NOT: Cam veya tek plaSTIC Erlenmeyer kabı da bir bakteri için kullanılabilir. Bağımsız olarak kullanılan kabın türüne, havalandırılmış steril olduğunu ve kültür hacmi bakterilerin, uygun havalandırma sağlamak için, kabın toplam hacminin% 20 geçmemesi emin olun.
  8. 1: 1 oranında, bir gece boyunca, bakteriyel sıvı kültür steril% 100 gliserol karıştırılarak, gliserol stokları hazırlayın. depolama için -80 ° C dondurucu 2 mi kriyojenik şişeler (500 ul / tüp) ve transfer şişelere bakteriyel / gliserol karışımı dağıtın.
    NOT: boncuk stoğu yöntemleri de bakteri depolamak için gliserol stokları yerine kullanılabilir. Bu yöntem ile, gözenekli mikro-L. monocytogenes saf kültürü ile aşılanır ve -80 ° C'de saklanır. Her bir kordon gerektiğinde yeni bir kültürü inoküle etmede kullanılabilir. Daha fazla bilgi için malzemeler listesine bakın.

L. Büyüme Eğrisi 2. Belirlenmesi Günü Kültür monocytogenes

NOT: Bu prosedür enfeksiyon çalışmaları için koloni oluşturan birim (CFU) tahmin etmek için kullanılan L. monocytogenes için büyüme eğrisi oluşturmak açıklamaktadır. aerosoller üretmek potansiyeline sahip tüm adımlar sertifikalı BSC içinde yapılmalıdır.

  1. Havalandırmalı bir 50 ml tüp içinde 10 ml BHI ortamı Adım 1.7'de elde gecelik kültüründen 100 ul alın ve (45 ° açı ile eğik 225 rpm) bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de büyür. Bir kontrol olarak, bir sigara İnoküle tüp kullanın.
  2. Saatlik aralıklarla kültür 0.5 ml numune alın (vs 1, 2, 3, 4, 5, 6 saat.). Bir plastik küvet içine BHI ortamı ile 1 (hac / hac): Her bir alikot 1 seyreltin. yukarı pipet ve aşağı karıştırın. Bir spektrometresi kullanılarak 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk (OD) ölçün. OD 600 = 1 kadar bakteri kültürleme devam edin.
  3. Aynı zamanda, kültür, 100 ul numune almak ve steril bir 1.5 mi MICR 900 ul BHI ortamı seyreltinocentrifuge tüp (bu 10 -1 seyreltme) olduğunu. 5 dakika boyunca 6.000 xg'de bakterileri santrifüj ve süpernatant aspire.
  4. , BHI ortamı, 1 ml pelet yeniden 6000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje tabi tutarak, ardından süpernatan aspire iki bakteri yıkayın. 1 ml BHI medya pelletini. BHI ortamı (10 -2 -9 10) bu numunenin, bir 10 katlı bir seyreltme serisi hazırlanır. Ayrı BHI agar plakları üzerine her seyreltici 100 ul yayıldı. Bir inkübatör içerisinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  5. 300 koloniler - Ertesi gün, 30 ila sahip plakaları almak. gerisini atın. Bu plakalar üzerindeki koloniler sayın. Tablo 1 OD 600 = 0.84 alınan bir alikot elde sayımların bir örneğini göstermektedir. Bu örnekte, plakaların bir (örneğin, 10 -6 seyreltme) 30 arasında koloni sayımları - 300 CFU / ml'lik hesaplanması için kullanılmıştır.
    NOT: Daha plakalar300'den koloniler aşırı kalabalık bakteri üremesini engelleyebilir beri kullanılan ve aynı zamanda zor ayırt ve bireysel koloniler numaralandırmak için yapar değildir. seyreltme tekniği veya kirletici mevcudiyetinde küçük hatalar aralığının alt ucunda sayımların hassas üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir, çünkü sayısı <30 plakaları da kullanılmamaktadır.
  6. kaplama hacimce koloni sayısını bölün ve sonra belirli bir seyreltme için CFU / ml değeri elde etmek için seyreltme faktörü ile çarpın. Tablo 1 'de örnekte, 10 -6 seyreltide sayısı 70 Böl seyreltilmiş kültür için CFU / mL değerini elde etmek için 0.1 mL, bu değer. Sonra sulandırılmamış kültür (7.0 x 10 8) CFU / ml değeri elde etmek için seyreltme faktörü (10 6) bu değeri çarpın.
  7. Büyüme 26 logaritmik fazı teşhis etmek için H zaman karşılık OD 600 (y-ekseni) (x ekseni) çizilir.
    NOT: Bu büyüme CurvBelirli bir OD okuma büyüdü, e günlük kültür CFU / ml bir tahmin sağlar. Günlük kültürlerin yetiştirilmesi için bir hedef OD 600 olarak kullanılabilen büyüme logaritmik fazı olan bir OD 600 okuma seçin. Şimdi aşı hazırlanması için bir kültür CFU tahmin etmek için de kullanılabilir Bu veriler (Prosedür 3).

L. monocytogenes ile Deneysel Enfeksiyonu için İnokulum 3. hazırlanması

NOT: Bu işlem, bir gecelik kültürden başlatıldı günde kültüründen Bulaşıcı inokulum hazırlanmasını anlatır (Prosedür 2'de hazırlanan). Aksi belirtilmedikçe, bu adımların hepsi BSC yapılmaktadır.

  1. farelerin ve çalışma deneysel tasarım sayısına göre enfeksiyonu için gerekli CFU sayısını hesaplayın. steril havalandırmalı bir Erlenmeyer şişesi veya kültür tüpüne BHI ortamı, uygun bir hacim.
    NOT: Bakteri p CFUrepared gerçekleştirilen deney tipine bağlı olacaktır. Enfeksiyon sırasında NK ve NKT hücresi yanıtlarını eğitim için, her bir fare bakteri 10 5 CFU (Prosedür 6) ile aşılanır. Bakteriyel yük enfeksiyondan için uyarlayıcı T hücresi tepkilerini okuyan veya ölçüm için, her bir fare bakteri 2 x 10 4 CFU (Prosedür 8) ile aşılanır. Uç noktalara hayatta kalma eğitimi, her bir fare (erkeklerde 10 5 CFU ve kadınlar için 1.5 x 10 5 CFU, Prosedür 9 see) patojenin LD 50 dozu ile aşılanmıştır.
  2. gecelik kültüründen 100 ul ile aşılanmış BHI ortamı içeren tüp inoküle. Hedef OD 600 kadar 37 ° C orbital çalkalama inkübatöründe (225 rpm) inkübe kültür ulaşılır. steril bir santrifüj tüpüne kültür aktarın.
  3. Bir santrifüj kullanılarak 6000 x g'de 5 dakika boyunca bir pelet halinde Santrifüj bakteri. çamaşır suyu içeren bir tuzak şişeye bağlı bir vakum kullanarak süpernatant aspire.
  4. Yıkama arasında (6.000 x g'de 5 dakika) santrifüj, 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez pelet.
  5. İkinci yıkama aspire ve 200 ul hacim içinde, her farenin ilgi CFU sunmak için 1x PBS içinde uygun konsantrasyonda bakteri seyreltin.
    NOT: laboratuvar cam lipopolisakkaritler gibi immünolojik kirletici tanıtmak beri, yıkama bakteri ve inokulum hazırlanması için steril 1x PBS ticari kaynağı kullanmak en iyisidir.

L. monocytogenes ile Fare 4. Deneysel İnfeksiyon

Not: Bu yordam Prosedür 3 ve nasıl inokulum teslim CFU doğrulamak için hazırlanan inokulum ile fareleri enfekte açıklamaktadır. farelerin ve enjeksiyonlar taşınması bir BSC yapılmaktadır.

  1. denemeniz için erkek veya dişi C57BL / 6J farelerin yeterli sayıda sipariş edin. Ayrıca fareler olarak bulaşmamış kontrolleri hizmet emrediyorum.
  2. fareler izinbakteriyel aşılama öncesinde 1 hafta iklime alıştırmak.
    NOT: Hayvanların taşınması ile ilgili stres stres hormonu üretimi ve lenfopeni 27,28 geçici bir artış tetikleyebilir olmasıdır.
  3. Aşılama gününde, her bir fare için bir temel vücut ağırlığı elde edilir ve defterin olarak kaydedin.
  4. BSC, yukarı ve bakteriler eşit olarak dağıtılır sağlamak ve daha sonra bir 25 G iğne ile donatılmış 1 ml güvenlik mühendisliği enjektöre inokulum 200 ul almak için steril bir pipet kullanarak aşağı bakteri süspansiyonu karıştırın.
  5. Hazırlanan inokulum 200 ul fare ip enjekte (örneğin, NK hücre enfeksiyonu için 10 5 CFU, Prosedür 6). Bu işlem için, farenin omuzlarına gevşek deriyi kapma daha az dominant elin ile fareler Scruff. Fare iyi ölçülü olmasını sağlamak sonra, m sadece yanal, karın alt kadranda fare enjekteidline mesane önlemek için.
  6. Bir biyolojik tehlike kesici kapta iğne ve şırınga imha edin.
  7. Tüm fareler enjekte kadar 4.6 - Tekrar 4.3 adımları. 1x PBS ile benzer adımları Davranış fareler (non-enfekte kontrol) enjekte edilir.
    NOT: CFU büyüme eğrisi dayanan bir tahmindir olduğundan, inokulum gerçek CFU kontrol etmek iyi bir uygulamadır. Eğer sayılabilir koloniler neden bekliyoruz (10 katlı bir seyreltme serisi kullanılarak) hazırlanmış aşı 4 farklı seyreltme - Bunun için, 3 hazırlayın. Bir BHI agar plakası üzerine her çözücünün 100 ul yayıldı ve bir gece boyunca 37 ° C enkübe edilir. kolonileri sayın ve işlem 2'de tarif edildiği şekilde, gerçek CFU / ml hesaplanır.

Bağışıklık Çalışmaları 5. hazırlanması Isı ile öldürülmüş L. monocytogenes

NOT: aerosoller BSC içinde gerçekleştirilir üretmek potansiyeline sahip tüm adımlar.

  1. OD 600 değerleri a kadar günlük kültür büyütünlogaritmik faz içinde olduğunu ulaştı yeniden. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine kültür koyun.
  2. bakterileri öldürmek için 1 saat için bir su banyosu içinde 70 ° C olarak inkübe edin.
  3. Adımlar 3.3 ve 3.4 gibi 1x PBS ile iki kez bakteri yıkayın. Cenin buzağı serumu (FCS) ihtiva eden steril bir tam RPMI ortamında yeniden süspanse 4 x 10 6 / ml'lik bir konsantrasyonda (tarifi için ek dosya 1 e bakınız). Kısım -80 ° C'de 2 ml steril kriyojenik flakon ve mağaza içine bakteri öldürdü.
  4. BHI agar plakları üzerine ısı ile öldürülmüş bakterilerin hazırlanması 100 ul yayılması ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilerek bakteri ölümünün teyit edin.
    NOT: BHI agar plaka üzerinde büyüyen herhangi koloniler varsa bu ısı ile öldürülmüş bakteriler Prosedür 8'de kültüründe lenfositleri uyararak için hazır olmalıdır, ısı öldürme işlemi tekrarlayın.

Enfeksiyon sırasında NK ve NKT hücrelerinin IFN-γ Cevaplarının 6. Ölçüm

Not: Bu yordam L. monocytogenes 10 5 CFU ile enfeksiyondan sonra 24 saat sonra farelerde NK ve NKT hücreleri tarafından IFN-γ tepkilerini ölçmek açıklamaktadır. Dalak 24 NK ve NKT hücreleri tarafından sağlam bir IFN-γ tepkileri indükler, bu doz kullanılır. BSC tüm adımları yürütün. Hücre canlılığını korumak mümkün olduğunca buz üzerinde hücreleri tutmak ve buz tamponlar kullanmanıza yardımcı olmak için.

  1. L. monocytogenes 10 5 CFU ile prosedür 4'te tarif edildiği gibi fare inoküle. Aynı zamanda, enfekte olmayan kontrol fareleri 1x PBS eşit hacimde ip enjekte edilir.
  2. Kurumsal kurallarına göre CO 2 inhalasyon 24 saat sonrası aşılamadan fareler Euthanize.
  3. onun sağ tarafında her fare yalan ve bir sıkmak şişe kullanılarak% 70 etanol ile cilt aşağı ıslak.
  4. aseptik veya steril forseps ve sert kesimli makas kullanarak, sadece göğüs kafesinin alt altında cilt insizyon.
  5. aşağı sprey% 70 etanol ile ortaya kas tabakası. Dalak kas tabakası (Şekil 1'de açık ok başı) altında görünür olmalıdır.
  6. aseptik veya steril forseps ve ince makas kullanarak, dalak ortaya çıkarmak için kas tabakası insizyon. Yavaşça forseps ile dalak kapmak ve bağ dokusu çevredeki uzak dalak kesmek için ince makas kullanın.
  7. Steril 1x PBS içeren 15 ml konik bir tüp içinde dalak yerleştirin.
  8. Steril 1x PBS ile steril petri kaplarına Yarım doldurun. steril 3 ml şırınga düz ucunu kullanarak petri içine 70 mikron naylon hücre süzgecinden dalak ayırmak.
  9. steril 10 ml serolojik pipet kullanarak temiz, steril 15 ml konik tüp içine splenosit süspansiyon aktarın.
  10. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 335 x g'de santrifüj örnekleri.
  11. çamaşır suyu içeren bir tuzak balona süpernatant aspire. bir parmak ile tüp hafifçe vurarak veya alt tüp sürükleyerek hücre pelet gevşetinileri geri bir oluklu yüzeyi boyunca (örneğin, hava akış BSC havalandırma).
  12. Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) lizis tamponu 1.5 ml ekleyerek Lyse kırmızı kan hücreleri, her dalak (tarifi için yazmak File 1'e bakınız). Tam 1 dakika ve 15 saniye sonra, hücre parçalama durdurmak için 1x PBS ile tüp doldurun.
  13. Santrifüj hücreleri olarak adım 6.10'da nitelendirdi. Süpernatant aspire ve (FACS) tampon (steril 1 x PBS,% 2 FCS ihtiva eden) ayırma floresan aktive hücre, 10 ml hücre pelletini.
  14. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bunun için, sayım için hücre süspansiyonu iki alikotları alır. (GKD 2 O% 0.4 tripan mavi bir çözelti seyreltilmesi% 0.04), tripan mavisi, eşit hacimde her hücre süspansiyonu 15 ul ekle. Yük hemasitometre bölmesine her hücre / Trypan mavi süspansiyon 15 ul (yani, üst bölmede bir alt bölme bir).
  15. Bir mikroskop kullanarak, tüm olmayan mavi hücreleri saymakHer odasında merkezi ızgara beş büyük kareler (Şekil 2). Bu sayı alın ve 10 6 / ml hücre sayısını elde etmek için 10 bölün. Şekil 2'de örnek olarak, sayısı 5 kareler 215 hücre olduğu; Bu nedenle, hücre konsantrasyonu 21.5 x 10 6 / ml'dir. İki örnekten elde edilen hücre konsantrasyonları ortalama.
  16. Boyama akış sitometrisi için 96 gözlü yuvarlak tabanlı plakanın üzerindeki çukurların / leke başına tohum 1 x 10 6 hücre. Ayrıca lekesiz ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri için hücreleri tohum emin olun. Tablo 2'de boyama panelinin sitometri tavsiye akışını bakın.
    Not: Aşağıdaki adımları için, buz üzerinde ya da 4 ° C 'de hücreler tutmak ve fluorochromes mevcut olduğunda folyo ile ışıktan hücreleri korumak için tavsiye edilir. Çok kanallı bir pipet işlenmesini hızlandırmak için 96 oyuklu boyama plakalara sıvıların dağıtılması için kullanılabilir. zaman hücre pelet rahatsız özen gösterinsantrifüj plakadan süpernatant aspire. santrifüj plaka adaptörleri ile donatılmış değilse Boyama ayrıca FACS tüpler yapılabilir. Bu noktada tüm santrifüj adımlar 4 ° C'de 5 dakika boyunca 456 xg'de yapılır.
  17. plaka santrifüj ve ardından FACS tamponu ile iki kez yıkama hücreleri. Bir yıkama, her bir FACS tampon 200 ul ekleyerek plaka santrifüj ve ardından süpernatan aspire yapılır.
  18. 50 ul / oyuk anti-fare CD16 / CD32 (saflaştırılmıştır Fc Block) (0.5 ug) ihtiva eden FACS tampon eklenerek bloke aşamasını gerçekleştirir. 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe hücreleri. yukarıda tarif edildiği gibi 1 x PBS içinde bir kez hücreler yıkanır.
  19. hücrelere: 100 ul canlılığı boya (1x PBS içinde 1.000 sabitlenebilir canlılığı boya 1 seyreltilmiş) ekleyin. 30 dakika boyunca (buzdolabında) karanlıkta 4 ° C'de Leke hücreleri. Yukarıda tarif edildiği gibi, FACS tamponu içerisinde hücreler iki kez yıkayın.
  20. İkinci yıkamadan sonra, ilgili kuyuları göre t 100 hücre yüzey antikorların ul veya tetramers eklemekO lekeleme paneli Tablo 2'de tarif edilen. 30 dakika boyunca (buzdolabında) karanlıkta 4 ° C'de Leke hücreleri. Şu anda, aynı zamanda tek pozitif ve FMO kontrol boyanması için antikor ekleyin.
    NOT: Tek bir pozitif kontrol ile ilgili olarak, bu panelde kullanılan antikorlar ile lekelendi CD4 antikoru veya ticari dengeleme boncuk çeşitli florokrom alternatifler ile boyanır ya da kullanımı dalak önerilir. Bundan önce boyama işlemi yürütülmesi için, her FACS antikorlar boyama için uygun konsantrasyonlarını belirlemek için test çalışmalarının titre edilmelidir.
  21. Yukarıda tarif edildiği gibi, FACS tamponu içerisinde hücreler iki kez yıkanır ve daha sonra% 4 paraformaldehid (GKD 2 O içinde seyreltilmiş% 16 paraformaldehit stok) 50 ul bunları yeniden süspanse edildi ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilerek hücrelerin tespit. DİKKAT: paraformaldehit toksik ve sadece davlumbaz ele alınmalıdır.
  22. iki kez hücre yıkayınn FACS tamponu arasında santrifüj. FACS tampon hücrelerin tekrar. en fazla üç gün boyunca ışıktan koruyarak buzdolabında sonraki adım ya da depolayan hücreler devam edin.
  23. Santrifüj hücreleri, aralarında santrifüj Süpernatantı ve 1X Permeabilization / Yıkama Tamponu (Perm / yıkama tamponu) 150 ul hücreler iki kez yıkayın. 9 (h / h) ile kombine 2 O.: Perm / Wash Buffer 1 seyreltilmesi ile 10x stoklar hazırlanır
  24. İkinci yıkamadan sonra, Perm / Wash Buffer 150 ul hücreleri tekrar süspansiyon ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
  25. Santrifüj hücreleri tekrar ve daha sonra süpernatant aspire. Anti-IFN-y ihtiva eden ve karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe 1x Perm / Wash tamponu 50 ul içinde süspanse hücreleri.
  26. arasında santrifüj, 1x Perm / Wash tamponu ile hücreler iki kez yıkanır. FACS tampon 250 ul hücrelerin tekrar ve daha sonra FACS tüpler hücreleri aktarmak.
  27. bir akış cytomet kullanarak satın alma akım sitometri geçiner bu Tablo 2'de 29 anlatıldığı boyama panelinde kullanılan fluorochromes ayrımcılık için uygun bir lazer yapılandırma ve filtre kümesi vardır. numune başına en az 200.000 olayları ve tazminat kontrolleri için 10.000 olayları toplayın.
  28. Tazminat matris uygulayın ve akım sitometri analizi yazılımı 30 kullanarak verileri analiz edin.

Tepe Enfeksiyon Seferde Dalak ve Karaciğer Bakteriyel Yük 7. ölçümü

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları BSC dahilinde gerçekleştirilmektedir.

  1. Farenin prosedür 4'te tarif edilen prosedürler kullanılarak patojen 2 x 10 4 CFU IP inoküle.
  2. 3. gün sonrası enfeksiyon üzerine, bir 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüpü hazırlayın her biri 1 x PBS içinde buz soğukluğunda steril% 0.1 Triton X-100, 500 ul 0,2-2 mm asitle yıkanmış steril cam boncuk - 1.5 0.3 g. Her tüp tartılır.
    NOT: Cam boncuk asit incu tarafından yıkanır1 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı ile bir çanak içinde% 10 asetik asit içinde sama. Bu boncuklar daha sonra yoğun, hava ile kurutulmuş olan asiti çıkarmak için GKD H2O ile yıkandı ve daha sonra kullanımdan önce sterilize edildi.
  3. CO 2 maruz kalma fareler Euthanize.
  4. organların diseksiyon için, bir diseksiyon gemide sırtında hayvan yatıyordu ve 25 G iğneler kullanılarak kuruluna fare uzuvlarını pin. % 70 etanol ile ıslatma cildi dezenfekte.
  5. Steril sert kesim makas kullanarak, her diz doğru ve her dirsek doğru orta göğüs orta kasık sonra orta göğüs kasık deri bir orta hat kesi yapmak ve. Teşrih künt, 25 G iğneler kullanılarak açmak iğneleme, cildi geri yansıtır ve.
  6. Steril ince makas periton duvarında bir orta hat kesi yapmak kullanarak daha sonra% 70 etanol ile ıslatma ve kas tabakası dezenfekte edin. forseps ile kılıç şeklinde sürecini tut. Ardından, aynı ince makas kullanarak, kılıç şeklinde proce periton duvar kesimler yapmakdiyaframın hemen altında, göğüs kafesine aşağıdaki yanal her iki tarafta ss, karaciğer ortaya çıkarmak için.
  7. Steril makas kullanılarak karaciğer ~ 100 mg parça (her fare için, aynı lob kullanın) kesin ve önceden tartılmış bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine koyun.
  8. nazikçe dalak görselleştirmek için periton boşluğuna sol tarafındaki organları bir kenara itmek için forseps kullanabilir. Yavaşça forseps bir çift ile dalak kapmak ve çevresindeki bağ dokusu uzak kesim tarafından periton boşluğundan bırakın.
  9. boncuklar içeren önceden tartılmış bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde dalak yerleştirin. Ulaştırma sızdırmaz bir kap içeren buz laboratuvara dokular. mg doku ağırlıklarını belirlemek için organları içeren tüpler yeniden tartın.
  10. 30 hertz frekans 3 dakika boyunca bir boncuk değirmeni homojenleştirici kullanılarak tüp çalkalanarak dokular homojenize edilir.
    NOT: boncuk değirmeni yöntemi homojenizasyon için tercih edilir o işlenme müsait olduğuörneklerin çok sayıda şarkı ve daha az karışıklık ve patojene potansiyel riski oluşturur. Ancak, otomatik veya manuel homojenizatörler cam doku homojenizatörler bir alternatif olarak kullanılabilir 2 ml otoklava.
  11. (Seyreltilmemiş 10 -7 arasında) arasında değişen, 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X-100'de homojenatlarında 10 katlı bir seyreltme serisi hazırlanır.
  12. steril dağıtıcısı kullanarak (iki nüsha) bir BHI agar plaka üzerine her seyreltilmiş Homojenat 100 ul yayıldı. 37 ° C inkübatör transfer plakaları ve gece boyunca inkübe edilir.
  13. geri kalanını atmak, 30 ve 300 koloni / plaka arasında ihtiva plakaları tutun. Her plaka üzerinde koloniler sayın ve yinelenen formalar için kolonilerin ortalama sayısını belirlemek.
  14. şu denkleme göre CFU / mg hesaplayın:
    Homojenize doku mg ağırlığına bölünür hazırlanan homojenat ml çarpılır Homojenat CFU / mg = CFU / ml.
    Not: 30 col Örneğin, ortalamaonies gibi olacaktır hesaplamalar aşağıdaki 0.5 ml homojenleştirilmiştir karaciğer 120 mg birim hazırlanan 10 -2 seyreltildi homojenat 100 ul kaplama sonrası sayılmıştır:
    CFU / ml = 30 koloni x 100 (seyreltme faktörü) / 0.1 ml (hacim yayılmış) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30,000 CFU / ml x 0.5 ml Homojenat / 120 mg doku = 125 CFU / mg.

8. CD4 + ve CD8 IFN-γ Yanıtları üzerinde L. monocytogenes Etkileri + Hücreler

Not: (1) akış: Bu işlem iki yöntem kullanılarak adaptif bağışıklık yanıtı (~ 7 gün sonrası enfeksiyon) zirve zaman hasat dalak CD4 + ve CD8 + efektör T hücreleri tarafından IFN-γ üretimini ölçmek açıklamaktadır sitometrisi hücre içi sitokin boyama ile CD4 + ve CD8 + hücreleri ile IFN-y ölçümü için, ve (2) ELISA splenositler (tüm T hücrelerini içerir) tarafından üretilen toplam IFN-γ düzeylerini ölçmek için. prosedürlerBSC dahilinde gerçekleştirilmektedir.

  1. Prosedür 4'e de tanımlanan prosedürler kullanılarak patojen 2 x 10 4 CFU ip enjekte fareler Infect.
  2. Gün 7 sonrası enfeksiyon, kurumsal kurallarına göre CO 2 inhalasyon fareler euthanize.
  3. Steril 1x PBS içeren 15 ml'lik konik bir tüp içinde dalak (yukarıda tarif edildiği gibi) ve yer teşrih. sızdırmaz bir kap içeren buz laboratuvara tüpleri taşıyın.
  4. , Tek bir hücre süspansiyonu içine dalak proses aşaması 6'da tarif edildiği gibi, kırmızı kan hücrelerinin lize ve daha sonra% 10 FCS içeren tam RPMI ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  5. IFN-γ yanıtlarının ölçümü için ayarlayın kültürleri. Bu dağıtma hücreleri için (1 4 x 10 6 ml / oyuk) ile birlikte 24 oyuklu plakalar ve eşit sayıda (4 x 10 6 ya da 1 ml / oyuk) çözülmüş ısı ile öldürülmüş L. monositogenleri (Prosedür 5'te hazırlanan) . 37 hücreleri aktarınC inkübatör °.
  6. inkübasyondan 20 saat sonra, gözlere, protein taşınma inhibitörünün 0.66 ul / ml ilave edilir ve inkubasyon devam edin.
  7. Dört saat sonra, ticari bir enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti kullanılarak 31, IFN-γ seviyelerinin daha ölçümü için transfer BSC plaka ve (-80 ° C) kültür yüzey ve dondurularak 500 ul toplar. Daha sonra steril bir 15 ml tüp içine hücreleri toplamak. 1x PBS ile kuyu yıkayın ve toplanan hücreler ile birlikte bu yıkama havuz.
  8. Tablo 3'te tarif edilen boyama panelini kullanarak hariç, Yöntem 6'da tarif edildiği gibi, CD4 + ve CD8 + hücreleri üzerinde IFN-y için hücre yüzeyi lekelenmesi ve hücre içi boyama yapılması. Edinimi sitometresi (200.000 olayları / numune toplama) akış ve analiz yazılımı 30 flow sitometri kullanarak veri 29 analiz geçin.

9. L. monocytogenes Infec sonra endpointi Fare Survival Ölçmeyon

Not: Bu yordam patojenin modifiye LD 50 dozu ile uç noktalara fare sağkalım üzerine bir ajanın etkisi sonrası enfeksiyon açıklanır. Bütün bu işlemler hayvan barınağında BSC yapılmaktadır.

  1. Prosedür 4'de tarif edildiği gibi farenin L. monocytogenes değiştirilmiş LD 50 dozu ile ip Enjekte Bu (kadınlarda), 10 5 CFU ya da (bir kadın için) 1.5 x 10 5 CFU 31 olduğu tespit edildi.
  2. günde iki kez klinik bulguları fareler izleyin ve bir laboratuar dizüstü bu belirti ve hayvan vücut ağırlıklarını kaydeder. onlar% 20 vücut ağırlığı veya listeriosis iki klinik bulgular kaybı (uyuşukluk, karıştırdı kürk, kambur duruş, yorucu nefes, donuk veya batık gözler) gösterirseniz fareler Euthanize.
  3. 14 gün sonra, CO2 inhalasyonu ile farelerin hayatta euthanize.
  4. Zaman 32 karşı her grubun yüzde hayatta çizerek veri Kaplan-Meier araziler hazırlayın.
    Not: fareler (Etik Bildirimi'nde açıklanan bitiş noktaları karşılamak) enfeksiyona yenik varsa, bu genellikle günde 5 sonrası enfeksiyon (Şekil 7) ile gerçekleşir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 3 patojenin 10 5 CFU ile 24 saat sonrası enfeksiyon dalak NK ve NKT hücrelerinin IFN-y boyanması sitometri bazı tipik akışı sunar. Bu şekil, aynı zamanda, Tablo 2'de tarif edilen boyama paneli geçit stratejisini göstermektedir. Şekil 4, 10 5 CFU L. monositogenleri enfekte erkek fare PPARa antagonisti IS001 ya da vasıta ile tedavi edilen tek bir deneyde elde edilen bazı temsili verileri gösterm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada L. EGD suşu kadın veya erkek C57BL / 6J farelerde 25 monocytogenes ile temel deneysel enfeksiyon yürütmek için nasıl bir protokol açıklar. Bu protokol, in vivo 31 doğal ve kazanılmış lenfositler tarafından IFN-γ üretimi üzerinde yeni küçük moleküllü IS001 etkisini incelemek amacıyla kuruldu. bakteriyel temizleme ve hayatta kalma sonrası enfeksiyon izleyerek, anlayışlar IFN-y bu değişikliklerin enfeksiyon kontrol etme konağın yeteneğini nasıl etkilediğini içine elde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Açıklanacak çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Bu protokolün geliştirilmesi, CIHR'den (MOP97807) SED'ye bir işletme hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Beyin Kalp İnfüzyon Suyu, Modifiye BD299070herhangi bir marka uygun olmalı
AgarBD214010herhangi bir marka uygun olmalı
Triton X-100Sigma-AldrichX100herhangi bir marka uygun olmalı
1x PBSSigmaD8537herhangi bir marka uygun olmalıdır
TissueLyser IIQiagen85300herhangi bir marka uygun olmalıdır
Amonyum Klorür (NH < alt > 3 < / alt > Cl)herhangi bir marka uygun olmalıdır
KHCO < alt > 3 < / alt >herhangi bir marka uygun olmalıdır
Na < alt > 2 < / alt > EDTAherhangi bir marka uygun olmalıdır
RPMI 1640Gibco22400089bir marka uygun olmalıdır
Fetal Sığır Serumu Gibco12483Kullanmadan önce, 56 ° C'de ısıyı etkisiz hale getirin; 30 dakika için C
L-glutaminGibco25030herhangi bir marka uygun olmalıdır
Esansiyel olmayan amino asitlerGibco11140herhangi bir marka uygun olmalıdır
Penisilin/StreptomisinGibco15140herhangi bir marka uygun olmalıdır
GolgiStop Protein Taşıma İnhibitörü (Monensin içeren)BD554724Kullanım 4 & mu; l 6 ml hücre kültüründe %
16 ParaformaldehyeElektron Mikroskobu Bilimleri15710ddH2O veya 1x PBS'de %4 PFA'ya seyreltin
10x Perma / Yıkama tamponuBD554723ddH2O Fc bloğunda 1x seyreltin
, Anti-Fare CD16/CD32 SaflaştırılmışeBioscience14-0161Seyreltik 1:50
Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 506eBioscience65-08661: 1.000 seyreltin (ayrıca Moleküler Problardan canlılık boyaları da kullandık)
anti-Fare CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041Üretici belirli bir test boyutu önerir; ancak bu, kullanımdan önce titre edilmelidir.
anti-Fare CD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081Üretici belirli bir test boyutu önerir; ancak bu, kullanımdan önce titre edilmelidir.
PBS57/mCD1d tetramer-APCNIH Tetramer Çekirdek TesisiN/ATesisten hediye olarak alınmıştır
anti-Fare TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961Üretici belirli bir test boyutu önerir; ancak bu, kullanımdan önce titre edilmelidir.
anti-Fare NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351Üretici belirli bir test boyutu önerir; ancak bu, kullanımdan önce titre edilmelidir.
anti-Fare CD45 PE-Siyanin7 (30-F11)eBioscience25-0451Üretici belirli bir test boyutu önerir; ancak bu, kullanımdan önce titre edilmelidir.
anti-Fare IFN gamma-PE (XMG1.2)eBioscience12-7311Üretici belirli bir test boyutu önerir; ancak bu, kullanımdan önce titre edilmelidir.
OneComp eBeadseBioscience01-1111Leke başına bir damla kullanın
Fare IFN gama ELISA kitieBioscience88-7314Kültür süpernatantında interferon gamasını ölçmek için kullanılır
KültürBakterileri kültürlemek için kullanılır, herhangi bir marka uygun olmalıdır
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleriherhangi bir marka uygun olmalıdır
bakteriyel petri kaplarıherhangi bir marka uygun olmalı
2 ml cyrovialsherhangi bir marka uygun olmalı
herhangi bir marka uygun olmalı
güvenlik mühendisliği iğneleriherhangi bir marka uygun olmalıdır
C57BL/6JJackson laboratuvarlarıStok # 000664Sipariş 7 haftada varış
Çamaşır suyuDekontaminasyon için
% 70 EtanolDekontaminasyon için
Cam boncuklarherhangi bir marka uygun olmalıdır
Santrifüjrotoru, kovalar, kova kapakları.
Mikrosantrifüjherhangi bir marka uygun olmalı
Steril Gliserolherhangi bir marka uygun olmalı
Pipet uçlarıherhangi bir marka uygun olmalı
Pipetherhangi bir marka uygun olmalı
Cerrahi aletlerherhangi bir marka uygun olmalı
70 mikron süzgeçlerherhangi bir marka uygun olmalı
3 ml şırıngaherhangi bir marka uygun olmalıdır
Pipet tabancasıherhangi bir marka uygun olmalıdır
Filtrasyon Üniteleriherhangi bir marka uygun olmalıdır
Tripan MavisiddH2O'da 1 ila 9 oranında seyreltin, herhangi bir marka uygun olmalıdır
Hemositometreherhangi bir marka uygun olmalıdır
Yuvarlak tabanlı plakalarherhangi bir marka uygun olmalıdır
FAC tüpleriFisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBDFlorokromları ayırt etmek için uygun bir lazer konfigürasyonuna ve filtre setine sahip herhangi bir akış sitometresi
kullanılabilir. yazılımTreestarVeri analizi için kullanılır. Diğer veri analiz yazılımı türleri de uygun olacaktır
Çok kanallı pipetleyici (0 - 300 & mikro; l)EppendorfAkış sitometrisi boyama sırasında hücreleri yıkamak ve antikor eklemek için kullanılır
Asetik AsitCam boncukları yıkamak için kullanılır, herhangi bir marka uygun olmalıdır
Microbank Bakteri Koruma SistemiPro-lab TeşhisBakterilerin uzun süreli depolanması için gliserol stoklarına alternatif olarak kullanılır
herhangi için 50 ml havalandırmalı tüpler UV spektrometresi

Kaynaklar

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381(2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İnterferon GamaFare EnfeksiyonuAkış SitometrisiBakteriyel YükDalak KaraciğerIFN-gamma YanıtlarıHücre İçi PatojenlerKonak BağışıklığıSağkalım Analizi
Deneysel Enfeksiyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.