Yöntem makalesi

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

DOI:

10.3791/54557

⸱

16 Eylül 2016

 ,  ,  ,  , 
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan tükenme-kurtarma deneyleri için bir yöntem tanımlıyoruz. Adenofeksiyon, tek hücre düzeyinde mitotik hücre bölünmesi ve miyogenez gibi ince ayarlanmış aktin bazlı dinamiklere dayanan biyolojik süreçler içindeki proteinlerin fonksiyonel analizlerini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böyle mitoz ve hücre farklılaşması gibi hücresel süreçleri büyük ölçüde hücre iskelet yapılarının doğru yeniden güvenmek hücre şekli değişiklikleri ile yönetilmektedir. Bu, belirli bir zaman ve yerde daha yüksek dereceden moleküler yapıların bağlanma-çözülme, proteinlerin aşırı ifadesi ile neden olduğu düzensizlikler, özellikle hassas olan bir işlemi içerir. yakın--normal hücre morfolojisi, protein homeostazını koruyan ve korumak yöntemler hücresel süreçlerin çeşitli ilgi konusu bir proteinin fonksiyonel katkı belirlenmesi yüksek ölçüde istenebilecektir. RNA müdahalesi dayalı geçici baskılanma-kurtarma deneyleri, protein fonksiyonları ve yapısal gereksinimlerini analiz güçlü yaklaşımlardır. Ancak, fizyolojik seviyesinden en az sapma ile hedef proteinin reintroduction gerçek bir mücadeledir. Burada moleküler şaperonlar rolünü incelemek için geliştirilmiş bir yöntem olarak adlandırılan adenofection açıklayan bird bölünen hücrelerin normal çalışma ortakları ve aktin biçimlenme ile ilişkisi. HeLa hücreleri siRNA dubleksler 3'UTR bölgeyi hedefliyor ile BAG3 tükenmiş bulundu. GFP etiketli BAG3 proteinleri transfeksiyon reaktifleri bağlanmış rekombinant adenovirüsler kullanarak hücrelerin>% 75 içine eş zamanlı olarak yeniden dahil edilmiştir. Adenofection stres yanıt verilmemesi halinde, BAG3 yoksun HeLa hücrelerinde yakın fizyolojik seviyede BAG3 GFP proteinleri ifade etmek için etkin. Etkisiz endojen ısı şoklu protein şaperonlar protein homeostazı ana stresle uyarılabilir düzenleyiciler düzeyde gözlenmiştir. Ayrıca, hücre iletimi-transfeksiyon sırasında floresan belirteçlerin ifadesini süren bakulovirüsleri ekleyerek, biz time-lapse mikroskobik tarafından mitotik hücre dinamiklerini incelemek olabilir, normal mitotik ilerlemesi minimum pertürbasyon ile analiz eder. Adenofection myoblast fark fonksiyonel analiz için zor enfekte fare hücreleri de uygulanabilir ve uygunmyotubes farklılık yaratmak. Böylece adenofection yapı-fonksiyon üst düzey iskelet dinamikleri güveniyor hassas biyolojik süreçlerde yer proteinlerin analizi gerçekleştirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücrelerinde gen ifadesinin fonksiyonel inaktivasyonu proteinlerin fonksiyonları incelemek için altın standarttır. Yeni tür Çinko parmak nükleazlara gibi site-spesifik nükleazların kullanımına dayanan genom düzenleme teknolojileri geliştirmiş ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / CAS9 şimdi hedeflenen gen silme ve mutasyon 1,2 ile hücre hatlarının üretilmesini sağlar. Bu yeni yaklaşımlar biz protein fonksiyonu ve insan hastalıklarının genetik anlayışımızı okuyan yol devrim olmalıdır. Bazı durumlarda ise, uzun vadeli veya tam gen nakavt arzu edilmez ve sekonder hücre telafi mekanizmaları provoke edebilir. Genetik olarak tadil edilmiş hücre çizgilerinin üretimi de sınırlı bir proliferasyon kapasitesi, ya da farklı hücre tiplerinde mutasyonların büyük bir set tarama aranan primer hücre kültürleri ile uğraşırken sınırlayıcı olabilir. Bu genellikle, bir hücre b bağımlılığı belirlemek için gereklidirbir proteinin yapısal gereksinimleri malarla proses. Bu amaçla, çeşitli hücresel geçmişleri geçici tükenmesi-kurtarma deneyleri sağlayan RNA müdahalesi ile geri dönüşümlü demonte hala yapı-işlev ilgi 3'ün bir protein analizleri gerçekleştirmek için basit ve güçlü bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Ancak, bu yaklaşımın önemli bir dezavantajı zorluk verimli susturulması elde etmek ve hücre popülasyonunun bir çoğunluğu yakın fizyolojik düzeyde ilgi ya da türevleri protein reintroduce etmektir. Bu protein-protein etkileşimleri ile ilgili, örneğin hücre popülasyonu bazlı deneylerde görülen, tek hücreler (hypomorphic fenotipi) seviyesinde görülen işlevsel etkileri ilişkili girişimi kapsamlı çalışmalar sağlamak için çok önemlidir.

Klasik transfeksiyon yöntemleri kullanarak, bir güçlükle hücrelerin büyük bir nüfus eksojen proteinlerin homojen ve düşük ifadesini elde edebilirsiniz. Rekombinant virüs hücrelerin İletimiadenovirüsler gibi genellikle eksojen proteinin daha normal ifadesini sağlar. Bununla birlikte, adenovirüs alımı insan olmayan hücrelerde mevcut değildir veya sadece zayıf bir insan hücre tiplerinde ifade edilir ARAÇ reseptörü ile sınırlıdır. Ayrıca, adenovirüsler hücreye girişi hücre şekli ve yapışma 4-6 düzenleyen sinyal yollarının aktive eder. Hücre morphodynamics düzenleyici mekanizmaları okuyan bu besbelli istenmemektedir. Biz hücre bölünmesi ve aktin dinamikleri, bir koruyucuya kompleksi, BAG3-HSPB8 fonksiyonel analizleri üstlendi zaman biz bu sorunlu bakan. Öncü iş stresi 7,8 sırasında protein kalite kontrol ve otofaji bu hastabakıcı kompleksi için bir rol tarif etmişti. Bu çalışmaların çoğu, ancak, chaperones normalde stres sırasında düzenlenen varsayarak, protein aşırı ekspresyonu dayanıyordu. Bu HSPB8 ile kompleks içinde, ister BAG3 sorusunu açık bıraktı, th ifade bölünen hücrelerin normal çalışmasına katkıda bulunabilirBirçok kanser hücre tipleri 9 gibi ese şaperonlar. Özellikle, hastabakıcı kompleksi HspB'dir şaperonlar ve iskelet dinamikleri 10 arasında ortaya çıkan bağlantıları verilen büyük ilgi oldu mitoz ilerlemesini kontrol aktin-tabanlı yapıların yeniden bir katkısı olup olmadığını. Bu sorunu gidermek için, biz mitoz ilerlemesi veya hücresel morfoloji müdahale olmaz ve hücre şekil değişiklikleri düzenleyen makromoleküler kompleksleri dinamikleri ikincil pertürbasyon önlemek için, protein homeostazisini korumak hangi tükenmesi-kurtarma deneyler için etkili bir yöntem geliştirmeyi aramaktadır . Bu nedenle, ideal olarak söz konusu genin tükenmesi ekleyin geri eş zamanlı olarak yapılmalıdır.

Bir katyonik polimer veya lipidler ile adenovirüs komplekslerinin kullanımı, in vitro ve in vivo 11,12 gen transferini teşvik etmek için tarif edilmiştir. Örneğin, kalsiyum fosfat (Capi) sahip bir çökelti oluşturmak için görünürBir CAR-bağımsız yolunun 13 üzerinden virüs bağlayıcı girişi geliştirmek adenovirüs. Gerçekten de, katyonik bileşikler ile adenovirüs bazlı hücre transdüksiyonu ve transfeksiyon birleştiren tükenmesi kurtarma deneyler etkinliğini arttırabildiği bulunmuştur. Bu çoğunda yakınındaki endojen seviyelerde ekzojen proteinlerin ekspresyonunu ayarlamak için daha geniş bir pencere hücre hattı ve ilgi dahilindeki gen ve yarar bağlı olarak, US 20-kat 3- virüsün miktarını düşürmek için izin hücresel morfoloji üzerinde asgari etki ile ilgi bir hücre popülasyonunun. Bu koşullar altında, daha da endojen protein ekspresyonu (>% 75) yüksek verimli demonte elde edebiliriz. Biz burada fizyolojik ro fonksiyonel analizler için yöntem uygun hale adım yöntem adım tarif ve Isı Şoku Protein ailesinin stres kaynaklı chaperones değişmeden seviyeleri ile değerlendirilen protein homeostazı önemli ölçüde tedirgin olmadığını kanıttime-lapse video mikroskobu ile moleküler şaperonlar le. Protokol hücre senkronizasyon prosedürlere ve mitotik ilerlemesi sırasında, normal aktin bazlı ve mil dinamikleriyle en az müdahale ile flüoresan işaretlerin düşük seviyelerde, ko-ekspresyonu için ticari olarak temin edilebilir bakulovirüslerin kullanımı elverişlidir. Biz daha in vitro myotubes myoblast farklılaşma üzerinde önemli bir etkiye sahip fare C2C12 hücreleri, "uyum sağlamak zor" uygulanabilir yöntem çok yönlülüğünü gösteriyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta ve Çözümleri 1. Hazırlama (bütün steril süzülmüş)

  1. C2C12 fare kas hücreleri (farklılaşma çalışmaları)
    1. C2C12 hücre kültür bakım için büyüme ortamı 500 ml hazırlanması:% 10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM yüksek glikoz ihtiva eder.
    2. C2C12 farklılaşması için 100 mi farklılaştırma ortamı (DM) hazırlayın:% 2 at serumu ile desteklenmiş DMEM yüksek glikoz ihtiva eder.
  2. HeLa hücreleri (mitotik hücrelerde çalışmaları)
    1. Hazırlama 500 mi αMEM HeLa RFP H2B hücre kültür bakım ve deneyler için:% 10 FBS ve 2 mM L-Glutamin (αMEM% 10) ile takviye edilmiş αMEM.
    2. HeLa RFP H2B hücre senkronizasyonu için (deoksiribonükleositler / ribonükleositlerin olmadan) 500 mi αMEM eksi hazırlanması:% 10 FBS ve 2 mM L-glutamin (αMEM eksi% 10) ile takviye edilmiş αMEM eksi.
    3. HeLa-RFP-H2B l Fenol Kırmızısı olmadan 20 ml αMEM hazırlayınive hücre elde etme: αMEM fenol kırmızısı olmaksızın,% 10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiştir.
    4. 100 mM timidin hazırlayın: vorteks ile 37 ° C 'de, 1 ml, H2O 24.2 mg çözülür. Filtre sterilize ve 4 ° C'de tutun.
  3. ortak çözümler
    1. % 0.05 tripsin / EDTA Hazırlama:% 0.05 tripsin, 0.625 mM EDTA 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde. Filtre ile sterilize ve mağaza alikotları -20 ° C'de ilave edildi. Bir kez, 4 ° C'de kısım tutmak çözülmüş.
    2. HBS2x hazırlayın: 280 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na 2 HPO 4. 10 N NaOH ile pH tam arasındaki 7,01-7,05 ayarlayın. steril filtre edildi ve 4 ° C'de tutun.

HeLa-RFP-H2B Hücrelerinin FİBRONEKTİN ve Kaplama ile Hücre Kültürü Plakaların 2. Kaplama

NOT: Deneyden önce, her manipülatör varyasyonları OC olabilir çünkü hücrelerin uygun bir yoğunluğu elde etmek için optimum hücre kaplama koşulları kurmak gerekirHer manipülatör ve her biri farklı hücre çizgisi arasındaki cur.

  1. Deneyden bir gün önce, onlar kaplama gününde büyüme üstel faz içinde olduğundan emin olmak için HeLa-RFP H2B hücreleri genişletin. % 80 birleşen 1x10 cm plaka itibaren 10 cm plakalar 2 ardışık 1/3 dilüsyonları olun.
    NOT: deney için plakaların sayısını planlayın. çiftleri, protein kısa süreli canlı hücre görüntüleme için diğeri Western Blot analizi ile demonte ve eksojen protein ifade etkinliğini belirlemek için ayıklar her koşul hesaplayın. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını belirlemek için bir ek plaka planlayın.
  2. 10 ug / ml fibronektin ile, kaplama kat cam alt yemekleri hücre önce. Hem de tüm yüzeyini kaplayan ve 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 1 saat boyunca inkübasyona 1 mg / ml fibronektin (steril 1 x PBS içinde seyreltilmiş) 35 mm başına çanağı 100 seyreltme: 1 ile 1 ml ilave edilir.
  3. İnkübasyon sırasında, ön-sıcak αMEM Wi takviye37 ° C'de% 10 FBS (αMEM% 10) ve% 0.05 tripsin / EDTA Th.
  4. inkübasyon 45 dakika sonra, hücre çözeltisinin hazırlanması başlar. steril bir muhafaza içinde, 10 cm plaka ortamı aspire 1.5 mi% 0.05 tripsin / EDTA ile iki defa hafifçe durulama ve son aspirasyon tripsin / EDTA 0.5 ml bırakın.
  5. 37 ° C'de 2-3 dakika boyunca inkübe hücreleri,% 5 CO2. nazikçe mikroskop altında plaka ve gözlem dokunarak, tüm hücreler müstakil doğrulayın. Hücreleri ayırmak için αMEM% 10 ve pipet yavaşça birkaç kez 10 ml. bir hemositometre kullanılarak, hücre süspansiyonunun bir 10 ul örnek sayısı.
  6. cam alt yemekleri aspire fibronektin çözüm. fibronektin hücre kaplama önce kurumasına izin vermeyin.
  7. Plaka 1.5x10 5 2 ml αMEM% 10 35 mm tabak başına hücre ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir. Hücreler, SEPA olduğu mikroskop altında 30-45 dakika sonra doğrulamabunlar plakasının merkezinde birikme eğilimi olduğundan, nominal.
  8. Gerekirse, hücreleri yeniden dağıtmak için hafifçe çapraz bilge plakaları çalkalayın. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını saymak için koşulların sayısına ilave plaka bir 35 mm levha.
  9. en az% 50 değerinde bir hücre yoğunluğu elde etmek için bir sonraki güne kadar hücreleri büyütün. Hücre yoğunluğu, virüs transdüksiyon verimliliği önemli bir azalma daha düşük% 50 sonuç, hücre başına protein ekspresyonu varyasyonları artış ve hücre toksisitesinin artmıştır.
    NOT: fibronektin cam yemekleri Kaplama hücre büyümesini ve morfolojisi artırır ve mitoz yoluyla hücrelerin düzgün ilerlemesini teşvik eder. Bu genellikle daha ucuzdur ticari olarak temin edilebilir jelatin ile ikame edilmiş olabilir.

3. Adenovirüs İletimi ve CAPI çökeltileri kullanma HeLa-RFP-H2B Hücreleri siRNA Transfeksiyon tarafından devirme Endojen protein

Dikkat! Çalışmavirüslerle ing özel önlemler ve virüs ile temas halinde olmuştur tüm materyalin uygun bertaraf edilmelidir.

Dikkat! Bizim ellerde, CAPI sık sık (örneğin, otofaji) vezikül kaçakçılığı biyolojik süreçler üzerinde örneğin, daha fazla istenmeyen etkilere sahip çöker. Buna göre, (aşağıya bakınız) ve analizler yapılmadan önce en az 48 saat beklemek bir katyonik lipid transfeksiyon reaktifi kullanılması tavsiye edilir.

Not: ilişkisiz bir gen (örneğin, LacZ) ya da herhangi bir geni taşıyan bir kontrol adenovirüs ilgili geni taşıyan rekombinant adenovirüsün en miktarda kullanarak, tüm Adenofections minimal MOI (10-20 PFU / hücre) ulaşmak için kullanılır.

Not: Bu işlem büyük bir hücre popülasyonunda hücre başına normalize ifade yardımcı gösterilmiştir.

  1. Bir gün hücre sonra kaplama, ek kaplama çanak hücrelerin sayısını. orta aspire ve1 mi,% 0.05 tripsin / EDTA ile bir kez yıkayın. % 0.05 tripsin / EDTA daha 1 ml ilave edilir ve tüm hücreler müstakil kadar 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edilir. iyi bir 1ml pipet kullanarak hücrelerin ayırın ve bir hemositometre kullanılarak ml başına hücre sayısını saymak.
  2. Enfeksiyon çokluğu hücre başına (POI) proteinin 2 plak oluşturucu birim (pfu) ve boş vektör hücre başına 18 PFU'nun (MOI) hücreleri nakletmek için gerekli virüs miktarı belirlemek (ör LacZ) hücre başına 20 PFU'nun toplam sahip. Aynı zamanda her bir bakülovirüs (aktin ve αTubulin, GFP ve RFP-etiketli, sırasıyla) 4 PFU transdüksiyonu. Aşağıdaki adenofection protokolü kullanarak hücrelerin transdüksiyonu. Fuchs ve diğerleri de tarif edildiği gibi virüsler kullanılmıştır. 14
  3. Her durum için, steril bir başlık içindeki bir 1.5 ml'lik plastik tüp hazırlanır ve sıcak αMEM eksi% 10 400 ul ekle.
  4. Gerekirse t, seyreltik, buz üzerinde yavaş virüsler bir kısım çözülme vepipetleme hataları en aza indirmek için bir sesini 1'den büyük ul pipetlemeyin için o virüs stoku.
  5. 400 ul αMEM-eksi% 10 içeren her 1.5 ml plastik tüp koşulu başına hesaplanan virüs miktarını ekleyin ve pipetleme hafifçe karıştırın. faaliyetini tutmak için hemen geri -80 ° C'de virüs stok yerleştirin.
  6. hücrelerden orta aspire ve yavaşça virüs karışımı damla damla pipetle. 37 ° C'de,% 5 CO2 de hücreleri inkübe ve de virüs hücreleri kapsayacak şekilde 1 saat boyunca steril başlık altında dikkatli bir şekilde, her 15 dakikada bir tabak çalkalayın. ortamın bir miktar kullanılarak hücrelerin virüsün teması kolaylaştırır.
  7. İnkübasyondan sonra, yavaşça, 2 ml 'lik bir toplam hacim elde etmek için her plakaya 1.6 ml αMEM eksi% 10 pipetle 2 mM timidin eklenerek hücre senkronizasyonu başlar ve 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde ilave bir 2 saat daha hücrelerin inkübe .
  8. Bu arada, siRNA transfeksiyon karışımı followi hazırlanmasıCapi transfeksiyon yöntemi ng (Şekil 1). Resim siRNA gerekli ise, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için, steril su ile siRNA'nın miktarının yerini.
  9. kopya 400 ul ile sonuçlanan, her durum için, 200 ul karışımı hesaplayın. Aşağıdaki Örnek 50 nM nihai siRNA konsantrasyon için verilir ve ilgi her protein için adapte edilmesi gerekmektedir. 1.5 ml plastik tüp içinde, 139 | il steril H2O içine pipetle 50 ul 1 M CaCl2 ve ul 20 uM 11 siRNA ve vorteks ile karıştırın. Hızlı bir dönüş sonrası, damla damla 200 ul HBS2x (280 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,01-7,05) dikkatli ekleyin.
    Not: küçük küçük damlalar iyi transfeksiyon verimi ile sonuçlanır çökeltiler bulunmaktadır. Yavaşça 200 ul-pipet kullanılarak hava enjeksiyonu ile üç kez karıştırılır.
  10. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile bir karışım inkübe edin. damla damla yavaşça ekle transfeksiyon karışımı 200 ul her plaka veenlemesine çalkalayın. 16 saat 37 ° C'de,% 5 CO2 plakalar aktarın.
  11. Bir sonraki gün, 2 mi, sıcak HEPES (6.7 mM KCI, 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.3) ile iki kez hücreleri yıkayın ve 10 2 mi αMEM eksi% ekleyin. sıcaklık değişimleri hücre döngüsü uzunluğunu etkileyebilir çünkü her seferinde en fazla dört hücre plakaları ile devam etmeyin.
  12. 20-40x (hava) bir büyütmede bir ters flüoresan mikroskop altında enfeksiyon etkinliğini görselleştirme ve dokümantasyon için hem fluoresan hem de iletim kanallarında durum için üç Örnek görüntüler elde. Yedi gün sonra, 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde ilave bir 16 saat boyunca 2 mM timidin ekleme ve inkübe edilir.
  13. Ertesi gün, siRNA transfeksiyon ve virüs enfeksiyonu 48 saat sonra, 2 ml ılık fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez hücreleri yıkayın ve canlı hücre görüntüleme için veya fenol / o fenol kırmızı w 2 mi αMEM% 10 7 saat bırakın protein ekstraksiyonu için kırmızı.
  14. Protein ekstrelerinin hazırlanması, Batı benek analizi için, her bir durum 48 saat sonra-transfeksiyon için Hasat hücreleri demonte etkinliğini ve endojen protein 15 ekspresyonunu belirlemek için.
    NOT: ilgi protein yanı sıra yükleme kontrolleri olarak hizmet veren, uygun antikorlar karşı antikorlar kullanın. Nakavt etkinliği bir titrasyon eğrisini sağlar (kontrol siRNA ile transfekte edilmiş) kontrol hücre lizatları azalan miktarlarda yükleme belirlenir (yani, 1, ½ ¼ ⅛).

Bir Katyonik Lipid Transfeksiyon Reaktif Kullanımı HeLa Hücrelerinde siRNA Transfeksiyon tarafından demonte 4. Adenovirüs İletimi ve Endojen Protein

NOT: Burada hücre senkronizasyonu içermeyen deneyler için uyarlanmış bir protokol mevcut ve / siRNA transfeksiyon capi yöntemiyle yapılamaz zaman, örneğin bazı hücrede lin istenmeyen toksik etkilerden kaçınmak için ya daes. Bu protokol, aynı zamanda, uygun bir hücre yoğunluğunda çalışmak için adenofection sonra hücre şarjı adımını içerir. Biz sadece katyonik lipid transfeksiyon reaktifi test ettik.

Dikkat! Virüsler ile çalışma özel önlemler ve virüs ile temas halinde olmuştur tüm materyalin uygun bertaraf edilmelidir.

  1. Plaka 1.75 x 10 5 2.5 mi αMEM% 10 35 mm tabak başına hücre ve 37 ° C'de inkübe,% 5 CO2. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını saymak için koşulların sayısına ilave plaka bir 35 mm levha.
  2. en az% 50 değerinde bir hücre yoğunluğu elde etmek için bir sonraki güne kadar hücreleri büyütün. Virüs transdüksiyon verimliliği önemli bir azalma en az% 50 sonuçlarının bir hücre yoğunluğu, hücre başına protein ekspresyonu varyasyonları artış ve hücre toksisitesinin artmıştır.
  3. Bir gün hücre sonra kaplama, ek kaplama çanak hücrelerin sayısını. solukluortam 1 ml% 0.05 tripsin / EDTA ile bir kez yıkayın ve. % 0.05 tripsin / EDTA daha 1 ml ilave edilir ve tüm hücreler müstakil kadar 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edilir. Ayrı hücreler, 1 ml pipet kullanılarak ve ml başına hücre sayısı.
  4. Örneğin (enfeksiyon çokluğu hücre başına (POI) proteinin 20-40 plak oluşturucu birim (pfu) ve boş vektör hücre başına 0-20 PFU (MOI) transdüksiyonu için gerekli virüs miktarı belirlemek, LacZ) hücre başına 40 PFU'nun toplam sahip.
  5. Her durum için, steril bir başlık içindeki bir 1.5 ml'lik plastik tüp hazırlanır ve sıcak αMEM% 10 400 ul ekle.
  6. , Pipetleme hataları en aza indirmek için bir sesini 1'den büyük ul pipetlemeyin için virüs stoku sulandırmak gerekirse, buz üzerinde yavaş yavaş virüslerin bir kısım Çözülme ve.
  7. 400 ul αMEM% 10 içeren her 1.5 ml plastik tüp koşulu başına hesaplanan virüs miktarını ekleyin ve pipetleme hafifçe karıştırın. Yeri inciHemen geri -80 ° C'de e virüs stok faaliyetlerini tutmak için.
  8. hücrelerden orta aspire ve yavaşça virüs karışımı damla damla pipetle. 37 ° C'de,% 5 CO2 de hücreleri inkübe ve de virüs seyreltme hücreleri kapsayan, 1 saat boyunca steril başlık altında dikkatli bir şekilde, her 15 dakikada bir tabak çalkalayın. ortamın bir miktar kullanılarak hücrelerin virüsün teması kolaylaştırır.
  9. Bu arada, transfeksiyon yöntemi izlenerek siRNA transfeksiyon karışımı hazırlayın. Resim siRNA gerekli ise, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için serumsuz aracı madde ile siRNA'nın miktarının yerini.
    1. Aşağıdaki Örnek 50 nM nihai siRNA konsantrasyon için verilir ve ilgi her protein için adapte edilmesi gerekmektedir. Her adenofection için, serum olmadan 150 ul ortamda (örneğin, 6.25 ul 20 uM SiRNA + serum olmadan 144 ul orta) ve bir 1.5 ml plastik tüp containi 416 nM siRNA içeren bir 1.5 ml plastik tüp hazırlamakserumsuz ng 6.25 ul katyonik lipid transfeksiyon reaktifi + 144 ul ortam.
    2. yukarı pipetleme ve 200 ul pipet ile birkaç kez aşağı her plastik tüp içeriği karıştırın. Her iki tüpe içeriğini birleştirin ve yukarı pipetleme ve 200 ul pipet ile birkaç kez aşağı karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  10. Virüs ile inkübe edildikten sonra, yavaşça 2.2 ml toplam hacim elde etmek için her plakaya 1.8 ml αMEM% 10 pipetle hemen damla damla siRNA transfeksiyon karışımı her plaka yavaş yavaş ve enlemesine çalkalayın. 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 plakalar aktarın.
  11. Sonraki gün, yeniden plaka 37 ° C'de ilave bir 24 saat boyunca 2.5 mi αMEM% 10 dört yeni 35 mm tabak içine, her 35 mm levha gelen hücreler her ve inkübe,% 5 CO2.
  12. Sonraki gün, siRNA transfeksiyon ve virüs enfeksiyonu, hazırlanması için, her durum için bir plaka hasat hücrelerinin 48 saat sonraprotein özleri ve Western blot analizi, demonte etkinliğini ve endojen protein 15 ekspresyonunu belirlemek için.
    Not: Kalan plakaları ile, hücrenin sabit devam tercih protokolü kullanılarak ve ilgi 14 antikorları ile immünofloresan analiz için numune maruz.

Mitotik Hücre ve Veri Analizi 5. Canlı Hücre Görüntüleme

  1. Bir / 5 nemlendirilmiş% CO 2 / termo-regüle odası ile donatılmış bir inverted mikroskop ile mitotik hücreler üzerinde kısa vadeli canlı hücre görüntüleme deneyleri.
    NOT: Bu çalışmada, dönen bir disk konfokal mikroskop (40X, 0.75 NA) kullanıldı, bir EMCCD ile donatılmış -50 ° C'de şarj çiftli kamera soğutuldu.
  2. alımı öncesinde, bölme 37 ° C uygun sıcaklığa ulaştığını doğrulayın.
    NOT: Bu mikroskobik sistemine bağlı olarak birkaç saat sürebilir.
  3. MICR kültür yemekleri yerleştirinOscope odası edinme önce 1 saat orta uygun dengeyi sağlamak ve sıcaklık değişikliklerine bağlı olarak sürüklenen odak önlemek için. hücrelerin mitoz durumunu izleyin. Bu noktada, hücreler% 10-15 mitoz (profaz-prometafaz) erken aşamalarında olmalıdır.
  4. Önceki deneylerde tespit edildiği üzere bir dengeleme sırasında, alıcı parametrelerini ayarlamak. Tipik olarak,% 100'lük bir lazer yoğunluğu ve 121-130 hassasiyet ile 0,2-3 sn iki kanal (488 ve 594) için bir maruziyet süresi bizim elimizde uygun parametrelerdir.
    NOT: İlk testler hücre hasarları neden olur ve mitoz ilerlemesini bozan asgari photobleaching uygun bir çözünürlük neden asgari lazer yoğunluğu ve satın alma zamanı / aralığını belirlemek için yapılmalıdır.
  5. iktisap aralığını aşmadan analiz etmek için hücrelerin önemli sayıda elde etmek için koşul başına birkaç alanları seçin. Tipik bir kurulum içinde olacak bir dönen disk konfokal sistemi kullanarakDört farklı koşullar, plaka başına 7 alanları ve 75 dakika-bir süre boyunca 1.5-2 dakika arayla 2 renk kanallarını (488 ve 594) ihtimal.
  6. mitotik girişinde olan hücreler, bir kez tüm alanları seçilmiştir odağı yeniden ayarlamak ve mümkün olduğunca hızlı alımı başlatabilirsiniz seçin.
  7. en az üç kez puan için sistemin istikrarı izlenmesi ve gerekirse odak erme.
  8. 75 dakika ilk kısa süreli canlı hücre görüntüleme sonra mitotik hücre yeni alanlar hücreleri analiz edilen sayısını artırmak için film ikinci bir dizi elde etmek için seçilebilir.
  9. floresan belirteçler bağlıdır hücrelerin mitoz fenotipleri, kullanılan analiz etmek iyi tanımlanmış kriterleri belirleyin. Mitoz kusurlar 14 blebbing, kromozom hiza, iğ sallanan ve korteks (nükleer anafaz kadar yıkımı) mitoz harcanan zaman uzamış içerebilir.

Differentiatin 6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirüs İletimig C2C12 Fare miyoblastları

NOT: adenofection protokolü de farklılaşma geçiren zor enfekte fare C2C12 iskelet hücreleri uygulanabilir.

  1. Plaka plastik ya da tercih edilen bir alt-tabaka üzerine büyüme ortamında 35 mm kültür çanakları 2 x 10 5 C2C12 hücreleri.
    Not: Hücre farklılaşması gelatine- ya Matrigel kaplı kaplar üzerinde geliştirilmiştir. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını belirlemek için bir ek plaka planlayın.
  2. Sonraki gün, hücreler birleşecek% 80 ulaşmış olmalıdır. sıcak PBS ile iki kez hücreleri yıkanması ve farklılaşma ortamında (DM) 2 ml ekleyerek miyoblast farklılaşma neden.
  3. Ertesi gün, farklılaşma gün 1 (D1) olarak etiketlenmiş, canlı hücreleri aktin hücre iskeleti görselleştirmek için adenovirüs LifeAct-TagGFP2 ile miyositleri transduce. 3.2 altında açıklandığı gibi ek plaka hücre sayısını sayın. sınavı takip eden 5 LifeAct-TagGFP2 adenovirüs PFU / hücre ve 45 PFU / hücre AdLacZ hesaplayınPLE Tablo 1 'de tarif edilen. toplam virüs miktarı 50 PFU / hücre. 14 tarif edildiği gibi virüsler kullanılmıştır
  4. Her durum için steril bir kaput içinde 1.5 ml plastik tüp hazırlayın ve sıcak DM 400 ul ekleyin.
  5. , Pipetleme hataları en aza indirmek için bir sesini 1'den büyük ul pipetlemeyin için virüs stoku sulandırmak gerekirse, buz üzerinde yavaş yavaş virüslerin bir kısım Çözülme ve.
  6. 400 ul DM içeren her 1.5 ml plastik tüp koşulu başına virüs parçacıklarının uygun miktarda ekleyin ve pipetleme hafifçe karıştırın. faaliyetini tutmak için hemen geri -80 ° C'de virüs stok yerleştirin.
  7. yemekleri orta aspire ve yavaşça virüs karışımı damla damla pipetle. 37 ° C'de,% 5 CO2 de hücreleri inkübe ve de virüs hücreleri kapsayacak şekilde 1 saat bir toplam steril bir başlık altında dikkatli bir şekilde, her 15 dakikada bir tabak çalkalayın.
  8. inkübasyondan sonra, yavaşça her tabağa 1.6 ml DM pipet ve i devam37 ° C'de ilave bir 2 saat boyunca ncubation,% 5 CO2.
  9. Bu arada, Capi transfeksiyon yöntemi izlenerek boş transfeksiyon karışımı hazırlayın. Her durum için 200 ul karışımı hesaplayın. 400 ul karışımı toplam hacmi için, aşağıdaki örnek kullanın.
    1. 1.5 ml'lik plastik tüp, pipet 50 ul 1 M CaCl2 150 içine ul steril H2O ve vorteks ile karıştırın. Hızlı bir dönüş sonrası, damla damla 200 ul HBS2x (280 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,01-7,05) dikkatli ekleyin. Yavaşça 200 ul pipet kullanarak hava enjeksiyonu ile üç kez karıştırın.
  10. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile bir karışım inkübe edin. damla damla transfeksiyon karışımı 200 ul her plaka yavaş yavaş ekleyin ve çapraz bilge çalkalayın. 16 saat 37 ° C'de,% 5 CO2 plakalar aktarın.
  11. Bir sonraki gün, 2 mi, sıcak HEPES (6.7 mM KCI, 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.3) ile iki kez hücreleri yıkayın ve 2 ml DM ekleyin. INFE görselleştirmekction 20-40X (hava) bir büyütmede bir ters flüoresan mikroskop altında verimlilik ve dokümantasyon için hem fluoresan hem de iletim kanallarında durum için üç Örnek görüntüler elde.
  12. İstenilen deney kurulumuna bağlı olarak, birkaç gün boyunca myotubes farklılaşma izleyin. Hücreler, sabit ve daha sonra gerçekleştirilebilir immünoflüoresans analizi veya canlı hücre görüntüleme çalışmaları tabi tutulabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katyonik lipidler ile BAG3-gfp plazmit DNA'sı transfeksiyonu HeLa hücrelerinde heterojen ekspresyonu ile bağlantılı, çok yüksek BAG3 seviyeleri (Şekil 2A) taşıyan zor tespit protein seviyelerini ve diğerleri gösteren bazı hücreler. Bu hücrelerde protein homeostazı kaybı perinükleer agregatları (Şekil 2A, oklar) içine BAG3-GFP birikmesi ile kanıtlanmıştır. Bunun aksine, BAG3-GFP taşıyan adenovirüsler hücre transdüksiyonu daha homojen düşük bir ifade ve BA...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, stokiyometri ve protein kompleksleri ve moleküler yapıların dinamiklerini etki proteinlerin aşın özellikle hassas olan hücre biyolojik süreçlerin işlevsel analizleri için de geçerlidir tükenmesi kurtarma deneyler için sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Mitoz hücre bölünmesi, bir hücrenin genel yapısı içinde en dramatik ve muhteşem değişiklikleri içeren ince ayarlı hücre morphodynamics aşırı bir örnektir. hücre görüntüleme için aktin ve tubulin belirteçlerin düşük ama algılanabilir miktarlarda tanıtmak ticari o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (Hibe no: 7077) ve Bellini Vakfı ve Roby Fondazione tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C2C12 Fare MiyoblastlarıATCCCRL-1772
Adenovirüs özel tasarımWelgenÖzel tasarım
Kalsiyum KlorürFisher ScientificC79-500
CellLight® Aktin-GFP, BacMam 2.0Thermo FisherC10582
Hücre Işığı® Tübülin-RFP, BacMam 2.0Thermo FisherC10614
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM), Yüksek GlikozThermo Fisher11965-092
EDTASigmaE5134
Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermo Fisher12483-020
FibronektinSigmaF1141
Cam alt tabaklar, 35 mmMatTek CorperationP35G-1.5-20-C Kasa
HeLa-RFP-H2BDr Sabine Elowe'nin nazik hediyesi, Soru; bec, KanadaKlebig C et al. 2009
HEPESFisher ScientificBP310-1
At Serumu, Yeni ZelandaThermo Fisher16050-122
KClFisher ScientificBP366-500
L-GlutaminThermo Fisher25030081
Lipofektamin® RNAiMAX Transfeksiyon ReaktifiThermo Fisher13778-150
Minimal Esansiyel Orta (MEM) AlfaWisent310-101-CL
Minimal Esansiyel Orta (MEM) Desoksiribosülfürler/Ribonükleozitler içermeyen AlfaThermo Fisher12000-022
Minimal Esansiyel Orta (MEM) Fenol içermeyen Alfa KırmızıThermo Fisher41061-029
Na2HPO4BiyobazikS0404
NaClFisher ScientificBP358-10
OptiMEMThermo Fisher11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2IBIDI60121
siRNA dublekslerDharmaconÖzel tasarım
TimidinSigmaT9250
Tripsin% 2.5Termo Balıkçı15090-046

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  3. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
  4. Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
  5. Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462(2013).
  6. Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889(2013).
  7. Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
  8. Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
  9. Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141(2011).
  10. Guilbert, S. M., et al. The Big Book of Small Heat Shock Proteins. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).
  11. Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
  12. Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
  13. Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
  14. Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).
  15. Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
  18. Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
  19. Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).
  20. Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2(2013).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AdenofectionDepletion RescueMolecular ChaperonesCellular MorphodynamicsBAG3 ProteinsiRNA TransductionAdenovirus ExpressionGFP TaggingMitotic AnalysisLive Cell Imaging

İlgili makaleler