Yöntem makalesi

Etkin Sporlanma Saccharomyces cerevisiae 96 çukurlu Formatında

DOI:

10.3791/54584

⸱

17 Eylül 2016

 , 
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Saccharomyces cerevisiae'nin sporlanması 96 çok kuyulu bir formatta gerçekleştirilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beslenme stresi zamanlarında, Saccharomyces cerevisiae sporülasyon olarak bilinen gametogenez geçirir. Azot ve karbon için aç kalan diploid maya hücreleri, sporülasyon sürecini başlatacaktır. Sporülasyon süreci, mayoz bölünmeyi ve ardından haploid çekirdeklerin çevreye dirençli sporlar halinde paketlendiği spor oluşumunu içerir. Sporülasyon fenotipleri için tarama maya hücrelerinin verimini artırmak için 96 çok kuyulu plakada tomurcuklanan mayanın verimli bir şekilde sporlanması için yöntemler geliştirdik. Bu yöntemler, uygun minimal besiyeri kullanıldığında besin seçimi gerektiren maya içeren plazmitlerle tarama veya zengin bir presporülasyon rejimi kullanıldığında genomik değişiklikler içeren maya taraması ile uyumludur. Bu yöntem için, sporülasyon sırasında havalandırmanın spor oluşumu için kritik olduğunu bulduk ve 96 çok kuyulu plaka formatı ile uyumlu yeterli havalandırmayı sağlamak için teknikler geliştirdik. Bu yöntemler, büyük hacimli şişe bazlı deneylerde elde edilebilecek tipik ~% 80 sporülasyon seviyesine ulaşmasa da, bu yöntemler küçük hacimli çok kuyulu plakalarda güvenilir bir şekilde yaklaşık% 50-60 sporülasyon seviyesine ulaşacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomurcuklanan maya sporlanma mayoz 1, genetik rekombinasyon 2 mekanizmaları, 3 sinyal hücre tarafından gelişim kontrolü, geliştirme 4 besin kontrolü, transkripsiyonel sırasında kromozom ayrımı kontrolü de dahil olmak üzere biyoloji birçok açıdan, içgörü sağlamak için çalışılmıştır gelişim 5 düzenlenmesi ve spor oluşumu 6 incelenmesi. Spor Oluşumu koruyucu spor duvar 6 birikimi, ardından ana hücreden içinde yeni zar bölümlerine oluşturulmasını içeren yeni bir hücre bölünmesi olayını içerir. Sporlanan hücrelerini inceleyen Bu çalışmalar genellikle nispeten verimli bir şekilde 7,8 yaklaşık 24 saat içinde sporülasyonun sürecinden geçmeleri için hızla sporlanan maya suşu SK1, yararlanmak. Maya tomurcuklanan sporülasyon koşullarının optimizasyonu 9-13, bu deney, tarif edilmiş olmasına rağmens katı ortam üzerinde ya da sporlaşma kültür tüpleri veya şişeleri kullanılarak gerçekleştirilir büyük ölçekli sıvı kültürlerde sporlanmasını incelenmiştir.

Burada, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, maya sporlanan için bir yöntemi tarif eder. Bu yöntem için, havalandırma senkron ve verimli sporülasyonun için kritik olduğunu bulmak ve küçük hacimli multiwell biçimi yeterli sporulasyonunu sağlamak için teknikler geliştirdiler. Hücreler, yüksek verimli teknikleri ve döşemeli kütüphane 14-16 kullanılarak yüksek kopya bastırma için çok oyuklu bir plaka biçiminde, bu tarama için optimize edilmiş reaktifler kullanılarak taranabilir için 96 çukurlu bir levha formatında sporlanan sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sporulationun için hazırlanıyor

Not:. Bu protokol açıklanan medya standart reçeteleri ve yöntemleri kullanılarak yapılan olan 13,17 Tablo 1 Bu protokolde kullanılan çeşitli medya 1 L formülasyonu verir.

Bacto Pepton Maya Özü Bacto Agar üzüm şekeri Potasyum Asetat gliserin GKD 2 O
YPG plakalar 20 g 10 g 20 g - - 30 mi 970 mi
YPD plakaları 20 g 10 g 20 g 20 g - - 1000 mi
YPD sıvı 20 g 10 g - 20 g - - 1000 mi
YPA sıvı 20 g 10 g - - 20 g - 1000 mi
sporülasyon ortam - - - - 10 g - 1000 mi

Tablo 1:. Ortam formülasyonlar edilmiştir ortam 1 ​​L için verilmiştir. medya konusunda Özelliklerimaddeler Malzeme Tablo bulunabilir.

  1. Tüm sporlanan Hücreler aynı genotip olacaksa, bu yordamı uygulayın:
    1. Çözülme maya suşu, bir YPG (YPGlycerol) plaka kullanılır. 30 ° C'de 12-16 saat boyunca maya büyümek. Önemlisi, SK1 hücreleri de o kadar SK1 suşları YPG plakalar üzerinde çok uzun bırakılmamalıdır, sporlanmalanna gurur duyuyoruz, ya da plaka üzerinde sporlanmalanna olabilir.
      Not: YPG üzerinde büyümüş bir taze çözülmüş soyu, bir karbon kaynağı olarak gliserol kullanımı gibi oksidatif fosforilasyon gerektirir tercih edilir ve bu durumda işlevsel mitokondriyal DNA sahip hücreler için seçim yapmaktadır edilir. SK1 hücreler fonksiyonel mitokondriyal DNA kaybetmek ve petites olma eğilimi var. Fonksiyonel mitokondriyal DNA, sporlanma için gereklidir.
    2. tek koloniler için YPD bir (YPDextrose) plaka üzerine YPG plakasından Streak maya. 30 ° C'de YPD plaka 24-28 saat üzerinde maya büyür.
    3. YPD katı ortam üzerinde büyüme yaklaşık 36-48 saat sonra, tek bir koloni ile 25 ml'lik bir YPD kültürünü başlatmakYPD plaka dan. Hücreler 7.0 = 4.0 OD 600 hakkında kadar bu kültürü büyütün. 220 rpm'de çalkalanarak, bir çalkalama inkübatöründe gece boyunca 30 ° C 'de bu adımı gerçekleştirir.
    4. YPD kültüründen (220 çalkalanarak 30 ° C'de ve çalkalama inkübatöründe maya büyümek 2. Bölüm, her 96 yuvalı plaka ihtiyacı için OD 600 = 0.1 olduğunu YPA (YPAcetate) kültür 1000 ml başlangıç ​​hücre, uygun bir miktarda kullanımı OD 600 1,5-1,3 arasında kültür kadar rpm).
      Not: Dört 96 çukurlu levhalar tarama, her 96 çukurlu levha YPA kültürü 100 ml inoküle Örneğin, Bölüm 2'de elenecek, YPA kültürü 400 ml gereklidir. YPA kültür içinde% 10 ekstra hacim başlayarak buharlaştırıcı birim kaybına karşı korumak için gereklidir. Hücreler uygun OD 600 ulaşması için Tipik olarak, 12-16 saat arasında sürer; süre maya suşu genotipine bağlı olarak değişebilir. YPA presporulation ortamıdır. Pregrowthasetat içinde gen ekspresyonunu (örneğin IME1 gibi) etkili ve eş zamanlı sporlanma 6 için gerekli neden olur.
    5. 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj 1.800 x g'de Spin YPA yetiştirilen hücreler pelet. Yıkama Hücreler, steril otoklavlanmış deiyonize su, 0.5 hacim 1x. Tekrar Spin ve yıkama atın. 1x hacim sporlanma medyada yeniden süspanse hücreleri. Bölüm 2 devam ediyor.
  2. Farklı genotipleri, vardır sporlanma için hücreleri kullanarak (farklı plazmidler ile transforme, yani veya farklı tipik elde dondurulmuş stoklar olarak saklanır mutasyonları içeren) 96 çukurlu bir biçime farklı genotip, dizi hücrelerini edin. Sonra, bu yordamı izleyin:
    1. YPG katı ortam üzerinde 96 oyuklu bir plaka (lar) içinde çözülmüş, dondurulmuş stoklar hücreleri aktarmak için bir steril 96 çatal Frogger kullanın. 30 ° C de bir gece boyunca, maya büyümek.
    2. steril 96 diş Frogger kullanarak, YPD katı ortam veya seçici üzerine YPG katı ortam hücreleri aktarmakKatı ortam (hücre seçimini gerektirir plazmidler içeriyorsa, yani sentetik minimal medya, amino asitler eksik). Seçici ortam gerekirse koloniler 2 gün YPD tipik haliyle 1 gün, her bir suş için oluşturulur ve kadar 30 ° C 'de maya büyütün.
    3. Kısım 96, derin 2 mi çukurlu plakanın her oyuğuna YPD sıvı ortam veya seçici sıvı ortam 1.2 mi. Bir Frogger kullanılarak sıvı ortam içine bir katı ortam transfer hücreleri, bant ile yerinde tutulan plastik bir kapak ile kapatın ve 220 rpm'de çalkalanarak, 30 ° C'de çalkalayıcı içinde gece boyunca büyür.
      Not: kontaminasyonu en aza indirmek için, dikdörtgen bir petri tabak plastik kapaklar kullanarak kapak plakaları. Bu hava sirkülasyonu minimal sınırlıdır, bu yüzden bir parça bant kullanarak yerine kapaklarını tutun.
    4. adaptörleri ile sallanan bir kova santrifüj kullanılarak 5 dakika boyunca 1.800 xg'de santrifüj plakalar, 96 gözlü plakalar karşılamak için. hücrelerden medya dökün; YPA pelet hücreleri her 500 ul Ypa de ekleme ve yeniden süspanse edin. kapakbant ile yerinde tutulur plastik kapak ile.
    5. 220 rpm'de çalkalanarak, bir çalkalama inkübatöründe 30 ° C'de 15 saat boyunca hücreler büyür. Bölüm 2 devam ediyor.

96 çukurlu Format 2. sporlanan Hücreler

  1. Bir 3 mm steril katı cam boncuk ve 1.3 mi çukurlu bir 96 oyuklu plakanın her oyuğuna steril 5 mm x 2 mm boyutlarında manyetik bir karıştırma çubuğu, ya ekleyin. (Bir boncuk veya bir karıştırma çubuğu kullanmak konusunda bir tartışma için aşağıdaki Temsilcisi Sonuçları gör.)
  2. elenecek tüm hücreler aynı genotip ise, 2.2.1 gidin. elenecek hücreleri farklı genotip ise, 2.2.2 gidin.
    1. 96 çukurlu bir levhanın her çukuruna içine adım 1.1.5 ve kısım hücre ve ortam 500 ul hücreleri al. bant ile yerinde tutulur plastik kapakla örtün. 2.3 geçin.
    2. 96 kuyucuğu karşılamak için adaptörleri ile sallanan bir kova santrifüj kullanılarak 1.2.4 den 5 dakika boyunca 1.800 xg'de YPA olan Spin hücreleri. dökünhücrelerinden f medya. sporlanma medya pelet hücreleri her sporülasyon medya 500 ul iyi ekleyin ve tekrar süspansiyon. bant ile yerinde tutulur plastik kapakla örtün. 2.3 geçin.
  3. Cam boncuk kullanılarak, bir yerde, 30 ° C'de çalkalayıcı bir inkübatör içinde, örnekler ve sporlaşma 220 rpm'de çalkalanır. sporlanma için 30 ° C inkübatör içinde bir karıştırıcı plaka üzerinde bir manyetik karıştırma çubuğu, Örnekleri kullanarak.
    Not: tüm barlar enerjik hareket ediyor ve kültür havalandırılır olarak manyetik karıştırma çubukları için tam karıştırma hızı sürece çok önemli değildir.
  4. , Sporulationun ilerlemeyi izlemek görselleştirme sporlanan kültüründen örnekleri çekilme, 96 iyi lamel plakada sporülasyon medya 24 ul sporlanan kültürlerinden hücrelerin 6 ul ekleyin için (1: 5 seyreltme). ters bir mikroskop kullanılarak hücrelerin incelenmesi önce 5 dakika boyunca yerleşmek için hücreleri bırakın.
    Not: vahşi tip SK1 hücrelerinde, kompakt olgun sporlar 3 ile oluşturacaksporlanma medyaya transfer edildikten sonra 6 saat. Sporlanma ilerleme, örneğin nükleer işaretleyici olarak flüoresan işaretçileri kullanılarak mikroskop ile izlenebilir (yani, Htb2 mCherry 18), öz değişmesine ait bölünme veya prospore membran işaretleyici incelemek için (örneğin, G-20 19) spor morfojenezi incelemek. Seçenek olarak ise, refraktil sporların oluşumunu sporülasyon ortama transferinden sonra yaklaşık 12 saat başlayan Nomarski DIC mikroskopi kullanılarak görülebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol değerlendirmek için, (yukarıda anlatıldığı gibi) çukurlu levhalarda yer alan hücreler sporlanan elde sporülasyon verimleri şişelerinde (Tablo 2) 'de daha büyük hacimler ile sporule hücreleri karşılaştırılmıştır. multiwell plakaların kullanımı ~% 80 verimlilik rutin görülebilir matara, sporlanan zaman görülen yüksek verim elde etmedi. (Cam boncuk veya bir karıştırma çubukları tarafından sağlanır), uygun havalandırma ile çukurlu plakalarda sporlanan En iyi sonu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada 96 multiwell formatta SK1 maya sporlanan için bir protokol mevcut. Havalandırma Bir karıştırma çubuğu ya da her iyi bir cam boncuk ya kullanımını gerektirir verimli sporlanma için anahtardır. hücreler, bir tane veya bir karıştırma çubuğu ya da olmayan bir çalkalama inkübatöründe 96 çukurlu bir plaka içinde sporule zaman, hücreleri verimli sporlanmalanna yoktur. Hücreler bir boncuk ya da (çalkalama olmaksızın 30 ° C de Tablo 1 olmasına kıyasla bir çalkalama inkübatöründe Bir karıştırıcı çubuğu, ya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH Massachusetts Boston (LSH) ve R15 GM86805 Üniversitesi (LSH) bir Joseph P. Healey hibe ile desteklenmiştir. SMP Massachusetts Boston Üniversitesi'nde Sanofi-Genzyme Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nunc 1.3 ml DeepWell PlakalarıThermoScientific260251Sporülasyon için kullanılır
Nunc 2.0 ml DeepWell plakalarıThermoScientific278743Presporülasyon büyümesi için kullanılır, adım 1.2.3
3 mm cam boncukFisher11-312ASporülasyon için kullanılır
5 mm x 2 mm karıştırma çubuğu, 12'li paketFisher14-511-82Sporülasyon için kullanılır
96 iyi kurbağaV & P ScientificVP407adım 1.2
kütüphane fotokopi makinesiV & için gereklidir P ScientificVP381adım 1.2 için gereklidir; kurbağa
dikdörtgen Petri kabı1.2 için gerekliolan ThermoScientific264728
Bacto PeptoneBD211677medya için gereklidir
Maya Özüiçin gerekli212750
gerekli
DekstrozMedya için FisherD16-3gerekli
Ortam için Potasyum AsetatFisherP171-500
Ortam içinFisherG33-500
Siyah 96 kuyulu cam alt plakaMatTekPBK96G-1.5.5-Fadım 2.4 için gerekli
, ile kullanılmak üzere Adım medya Bacto Agar BD medya için gerekli Gliserol gerekli

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  2. Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
  3. Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
  4. Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
  5. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
  6. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  7. Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
  8. Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
  9. McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
  10. Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
  11. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
  12. Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
  13. Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
  14. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  15. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).
  16. Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
  17. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  18. Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
  19. Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  20. Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Saccharomyces cerevisiae Spor lasyonu96 Kuyucuklu PlakaMaya Spor lasyonuSpor lasyon Verimlili iHavaland rma Y ntemiCam BoncukManyetik Kar t rma ubu uMayoz TaramaSpor lasyon BesiyeriY ksek Kapasiteli leme

İlgili makaleler