Method Article

Drosophila Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

DOI:

10.3791/54585

⸱

October 6th, 2016

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster, bütün bir organizma bağlamında tümör gelişimi ve ilerlemesinin fonksiyonel ve mekanik çalışmaları için güçlü bir deneysel sistem olarak ortaya çıkmıştır. Genetik mozaikler oluşturmak için sofistike teknikler, normal doku ile çevrili, görsel olarak işaretlenmiş, genetik olarak tanımlanmış klonların indüksiyonunu kolaylaştırır. Klonlar, çeşitli moleküler, hücresel ve omik yaklaşımlarla analiz edilebilir. Bu çalışma, Drosophila larvalarının göz/anten görüntüleme disklerinde (EAD) Bastırılabilir Hücre İşaretleyici (MARCM) tekniği ile Mozaik Analizi kullanılarak değişen maligniteye sahip floresan işaretli klonal tümörlerin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır. Mozaik EAD ve beynin larvalardan nasıl kurtarılacağı ve floresan transgenik raportörlerin ve antikor boyamanın eşzamanlı görüntülenmesi için bunların nasıl işleneceği prosedürleri açıklar. Mozaik dokunun moleküler karakterizasyonunu kolaylaştırmak için, toplam RNA'nın EAD'den izolasyonu için bir protokol tarif ediyoruz. Diseksiyon prosedürü, EAD ve beyinleri herhangi bir larva aşamasından kurtarmak için uygundur. Hayali diskler için fiksasyon ve boyama protokolü, Drosophila proteinlerini tanıyan bir dizi transgenik raportör ve antikorla çalışır. RNA izolasyonu protokolü çeşitli larva organlarına, bütün larvalara ve yetişkin sineklere uygulanabilir. Toplam RNA, aday veya genom çapında yaklaşımlar kullanılarak gen ekspresyonu değişikliklerinin profillenmesi için kullanılabilir. Son olarak, klonal tümörlerin invazivliğini ölçmek için bir yöntemi detaylandırıyoruz. Bu yöntemin kullanımı sınırlı olmasına rağmen, altında yatan kavram, bilişsel yanlılıktan kaçınılması gereken diğer nicel çalışmalara geniş ölçüde uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser insidans ve mortalite önemli ölçüde dünya çapında, özellikle yaşlılarda, artan hastalıkların en genetik olarak heterojen bir grup, birini temsil eder. Kanser doğasında tümör baskılayıcı mekanizmalarını kaçar ve kontrol dışı bölen bir tümör başlatan hücre klonal kaynaklanır. ölüm ve farklılaşmasını inhibe ederken işbirliği büyüme, çoğalma ve motilitesini teşvik genetik lezyonların kademeli birikimi yüksek, malign metastatik ve ölümcül tümör içine ilk selim üremesine dönüştürür. Bu genetik değişikliklerin yanı sıra, tümör ilerlemesi olan mikro-tümör ve çok sayıda hücre türleri (örneğin, fibroblastlar, immün ve endotel hücreleri) arasındaki çevre stroma ve çapraz-karışma değişiklik gerektiren belirgin hale gelmiştir. tümör stroma etkileşimleri de dahil olmak üzere malign transformasyon altında yatan moleküler ilkelerinin anlaşılması PREVEN geliştirmek için büyük önem taşıyoryon ve erken tarama stratejilerinin yanı sıra, yeni ve etkili tedavi, kanser metastazı ve ilaç direncine karşı koymak.

Meyve sineği Drosophila Melanogaster'in onun hızlı nesil zaman nedeniyle kanser araştırmaları 1-4 için çekici bir sistem haline gelmiştir sinekler ve insanlarda, hemen hemen herhangi bir genin işlenmesini kolaylaştıran gelişmiş genetik araçları sınırlı genetik yedekleme ve zenginlik arasındaki düğümleri sinyal olağanüstü koruma bir geçici ve mekansal kısıtlı bir şekilde. Değişen malignite genetik olarak tanımlanmış tümörler tekrarlanabilir MARCM tekniği 5 kullanan bir başka vahşi tip dokusunda progenitörlerin bir alt kümesi gain- ve zarar-fonksiyon mutasyonlar tanıtarak Drosophila tasarlanmış olabilir. MARCM aracı FLP / FRT (FLP rekombinaz / FLP Tanıma Hedef) FLP-out 7 ve Gal4 / UAS (yukarı aktivasyon dizisi) 8 hedef geni ile mitoz rekombinasyon 6 aracılı birleştiririfade sistemleri 9. dsRNA'nın indüklenen gen susturma onkogen ya da floresan proteini cDNA ya ters çevrilmiş DNA Tekrarlar dahil olmak üzere herhangi UAS göre transgenin bu yöntem ifade ile, spesifik bir genetik yeri ve rekombinasyon nedeniyle bir GAL4 represörü kaybetmiş bir hücre klonu ile sınırlı olacak (Şekil 1A). Klon yamalar yeşil floresan (GFP) veya kırmızı floresan proteinleri ile işaretlenmiş (örneğin, RFP, DsRed, mCherry) kolayca geliştirme, izole ve analiz boyunca izlenebilir. Önemli olarak, onların davranışları doğrudan bitişik vahşi tip dokuya karşılaştırılabilir. Böylece, sorular genetik lezyonların özerk ve özerk olmayan etkiler rahatlıkla ele alınabilir hücreye formüller verilmiştir. Memelilere benzer şekilde, sadece klonları olan çoklu onkojenik lezyonlar Drosophila malign olmak ve memeli kanser kilit işaretlerinden özetlemek kombine edilir. Onlar, apoptoz kaçmasına enflamasyon neden, ölümsüz ve InvAn haline overproliferatesive, sonuçta ev sahibi 10-17 öldürme.

Burada, bir protokol MARCM tekniği kullanılarak Drosophila larvalarının göz / anten ve beyin dokusunda genetik olarak tanımlanmış klonal tümörler oluşturmak için tarif etmektedir. Yöntem, eyeless arttırıcı (eyFLP) 18,19 kontrolü altında maya FLP yeniden bağlayıcı ifade eden bir MARCM test hisse senetleri dayanır. Bu şekilde, GFP etiketli klonlar peripodial ve kolumnar EAD epiteli ve embriyonik ve larva aşamaları (Şekil 1A, B ve referans 20) boyunca beynin neuroepithelium hem de oluşturulur. neuroepithelium farklılaştırılmış optik lob nöronlar üreten neuroblasts doğurmaktadır EAD yetişkin göz, anten ve baş kapsül içine geliştikçe klonlar kolayca yetişkinliğe kadar takip edilebilir.

Biz de mozaik doku geniş, moleküler fonksiyonel ve fenotipik karakterizasyonu kolaylaştırmak içinçubuk üçüncü instar larvaları EAD ve beyin diseksiyon için bir protokol ve üç farklı uygulamalar için işleme nasıl özetlemektedir: (i) transgenik flüoresan muhabir ve immün saptanması, tümör yayılımı ve (iii) analizi, (ii) ölçümü gen ekspresyon kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) veya yüksek verimli bir mRNA sıralaması (mRNA DİZİ) (Şekil 1C) ile değiştirir.

immün protokolü spesifik bir antikor ile çıkar proteini görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Transgenik floresan transkripsiyonel gazetecilere belirli bir sinyal yolunun aktivitesi üzerine uygun ve kesin uzaysal bilgi sağlar. Hücre soyu, belirli muhabir, diğer taraftan, mozaik doku içinde ve farklı genotipler tümörleri arasında hücre popülasyonlarının niteliksel ve niceliksel değişiklikler göstermektedir. invaziv davranış miktarının belirlenmesi genotipi arasındaki tümör malignite karşılaştırılmasını kolaylaştırırs. Son olarak, RNA izolasyonu için mozaik EAD toplanması ve işlenmesi tarif protokolü, sırasıyla QRT-PCR ve genom mRNA SEQ, ardından ters transkripsiyon hem küçük hem de büyük ölçekli alt uygulama için uygundur. Bu analizler sonucu elde edilen nitel ve nicel veriler klonal tümörlerin sosyal davranış içine yeni bakış açıları sağlayacaktır. Ayrıca, bireysel genler, genetik ağları ve farklı aşamalarında tümör mikro ve tümörogenez yönleriyle rolü üzerine fonksiyonel çalışmalar için sağlam bir temel oluşturur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu çalışma eyFLP1 kullanır; hareket> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, küvet-GAL80 MARCM 82B Yeşil test hattı 11. Böyle w suşların erkeklere MARCM 82B Yeşil test bakireler Geçiş; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotip mitotik rekombinasyon 3. homolog kromozomların doğru kolları arasında oluşacak olan soy verecektir. Bu şekilde, FRT82B sitesine uzak bulunan gen c klonlar homozigot mutant EAD ve beyin neuroepithelium içinde oluşturulur. Bu klonlar gen b (Şekil 1A) için GFP, transgen a ve dsRNA'larını ifade edecektir. X, 2L, 2R, 3L ve 3R üzerinde rekombinasyon için çeşitli eyFLP-MARCM test hatları kurulmuş ve sinek toplum içinde mevcuttur edilmiştir.

1. Fly Taşıma, Haçlar ve Evreleme

  1. Birden fazla bo doldurmamak oda sıcaklığında uygun MARCM test stok genişletmekAynı zamanda ttles. Bu yeterli bakireler sonraki haçlar için toplanan böylece her 2-3 günde bir taze şişeler içine yetişkin çevirin.
    NOT: bakireleri toplarken, bu kadın doğurganlığını uzlaşma olarak CO 2 için uzun süreli maruz kalmasını önlemek.
  2. Deney ölçeğine bağlı olarak, en az 10 MARCM test bakire ve (örneğin, floresan gazetecilere ve immün görüntülenmesi için) ya da en az 30 bakireler ve 10 erkek (örneğin, için olan şişelerde 4 erkek kullanarak şişeleri sinek haçlar kurmak RNA izolasyonu ve invaziv ölçümü).
  3. Uzun bir günün 16 saat / 8 saat ışık-karanlık döngüsü altında 25 ° C'de soy kaldırın. larvaların tekrarlanabilir evreleme kolaylaştırmak ve aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeler / şişelere her 24 saat anne çevirin.
    NOT: yumurtlama (AEL) gün sonra 6 başlayarak, geç üçüncü evre kontrol larvaları durdurma besleme, dolaşıp başlatmak ve pupariation girin. Buna karşılık, larva-pupa geçiş başlangıcı de olabilirkoydu veya EAD hiperplastik veya habis klonal tümörleri taşıyan ile larva varolmayan.

2. Üçüncü dönem larva Toplama

  1. immün için, yaklaşık 20 geç üçüncü evre larvaları (duvara dolaşan ve gıda karşılaştırılabilir vücut büyüklüğüne olanlar) toplamak. hafifçe şişe ya da viyal larvaları almak ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile doldurulmuş bir embriyo cam tabak içine aktarmak için forseps kullanır.
    1. RNA izolasyonu ve invaziv ölçümü için, en az 80 geç üçüncü evre larvaları (duvara dolaşan ve gıda karşılaştırılabilir vücut büyüklüğüne olanlar) toplamak. Yüzey kaplıdır kadar larvaları içeren bir sinek şişeye PBS fışkırtma bir bücür şişe kullanın.
    2. Bir spatula ile yiyeceklerin üst katmanlarını yumuşatır ve bir Petri kabı içine larvaları içeren gıda püre dökün. Forseps kullanarak, hafifçe larvaları almak ve PBS ile dolu bir embriyo cam tabak içine aktarabilirsiniz.
  2. PBS UNT ile larvaları yıkayınIL artıklarını yiyecek kaynağı kaldırılır. Larva vücuda rasgele GFP pozitif noktalar (Şekil 2A, 2B ve görmek Tartışma Bölüm) taşıyan tüm "leopar larvaları" atmak için 16X büyütme 8 ile floresan stereomicroscope altında larvaları inceleyin.
    Not: RNA izolasyonu için 1 dakika için% 70 EtOH içinde sondan bir önceki yıkama aşamasını içerir.
  3. diseksiyon kadar buz üzerinde PBS seçilen larvaları içeren çanak yerleştirin. 30 dakika içinde süreç larva soğuk ve açlık olumsuz etkilerini önlemek için.

Larva 3. diseksiyonu

  1. Bir stereomikroskop altında EAD incelemek için, yavaşça cam çanak alt karşı larva orta kısmı basın forseps bir çift kullanın. İkinci forseps ile larva ağız kanca kapmak ve vücuttan (Şekil 2C) onları çekin.
    NOT: çekme kuvveti EAD pai bağlayan optik saplarını kırmak için çoğu zaman yeterlidirBeyin lobları r. Beyin veya parçaları EAD bağlı kalmak ve mevcudiyeti uygulamalar için arzu edilen ise, forseps iki çift bir yardımıyla optik sapları kesti. (Örneğin, ras V12 Scrib 1) EAD ve beyin lobları arasındaki bağlantı giderek overgrowing ve klonal hücrelerin göçmen zamanla gizlenmiş olur invaziv tümörlerde.
    1. Bozulmamış bir ventral sinir kablosu (VNC) (Şekil 2B) ile EAD / beyin kompleksini hazırlamak için, vücudun ortasında bir larva kesmek için forseps kullanabilir. arka yarısını atın.
    2. Bir forseps uçları arasındaki larva vücudunun ön yarısını tutun ikinci forseps ucu ile ağız kanca iterek ve ilk forseps çifti ile üzerine manikür yuvarlayarak larva içten dışa çevirin.
  2. Dikkatle EAD çifti bırakarak tüm yabancı dokuları (örn, tükürük bezleri, yağ vücut ve gut) kaldırmak veya forseps kullanmaağız kanca bağlı EAD / beyin kompleksi. üstteki manikür ağız kanca disentangle. Vücut kaslarının ve epidermis (Şekil 1B, 2C, 2D) kadar uzanan aksonal projeksiyonları kesilmesinin VNC ücretsiz.
    NOT: Ağız kancalar forseps ile doku güvenli manipülasyon için izin ve yıkama sırasında dokuda daha verimli batan ve kolay tanınmasını kolaylaştırmak. PBS içinde sabitlenmemiş tutulduğunda nispeten hızlı EAD değişim morfolojisi disseke. 20-30 dk diseksiyon zamanı sınırlayın.
  3. doku aktarmak için, kat kalan vücudu pipetleme bir P20 mikropipet ucu yukarı ve aşağı birkaç kez nakli. Büyük EAD / beyin kompleksleri aktarmak için, makasla P20 mikropipet ucu kesilmiş.
    Not: kaplama işlemi, aktarım sırasında yapışmasını ve çıkartılan doku kaybını önlemek için önemlidir. Bir P20 mikropipet kullanımı istenmeyen sınırlayıcı seyreltme, fiksatif çözelti içine PBS transferini en aza indirir.
    1. immün için transfer400 ul% 4 paraformaldehit (PFA) sabitleyici ile dolu bir 0.5 ml'lik bir tüp içine EAD kesilir. Daha büyük EAD için 1 ml PFA 1.5 ml tüp kullanın / beyin kompleksleri invazivliğinin puanlama için geliyordu.
      DİKKAT: PFA son derece toksiktir. Koruyucu eldiven ve giysiler giyin. cilt, göz veya mukoza ile temasından kaçının.
    2. RNA izolasyonu için, soğuk PBS ile dolu yeni bir cam tabak içine parçalara EAD aktarın. Örnek kirliliklerinin en aza indirmek için, halka ve lenf bezlerinden EAD temizlemek için forseps kullanabilir.
    3. Forseps (Şekil 2E) kullanılarak anten diskler ve ağız kanca arasındaki bağlantıyı kesilmesinin ağız kancaları EAD ayırın. RNA bozulmasını ve gen sentezleme bozulmaları önlemek için, 30 dakika için diseksiyon zaman sınırı. 7. adıma geçin.
      NOT: Deneyimli bir araştırmacı larva toplama ve yıkama için gerekli 30 dakika hariç zaman içinde yaklaşık 60 larva incelemek olabilir. Toplam RNA verim genotipleri ve developmentà arasında değişir EAD büyüklüğüne bağlıdırl aşamaları. geç üçüncü evre larvaları 80-100 kontrol EAD çiftlerinin Diseksiyon 5-8 ug toplam RNA boyun eğmek zorundadır.

4. Sabitleme, immün ve Montaj

  1. Oda sıcaklığında nutating ise 25 dakika süreyle PFA fiksatif örnekleri sabitleyin. sabitleme süresi doku morfolojisi ve proteinlerin antijenitesini değiştirmeden 60 dakikaya kadar uzatılabilir.
  2. Nutator kullanılarak 10 dakika boyunca üç kez (% 0.1 Triton X-100 içeren PBS) PBST ile tespit edici ve yıkama örnek alabilir. Her yıkama adımı (400 ul / 0.5 ml tüp) için PBST yeterli hacmi kullanın.
    NOT: Sabit EAD / beyin kompleksleri immün gerekmez invazivliğinin puanlama için geliyordu. GFP sinyali tespit sonrasında iyice görünür kalır. Nihai diseksiyon için 4.4 adıma geçin.
    1. immün, oda sıcaklığında yumuşak çalkalama ile 20 dakika boyunca (% 0,3 BSA ile PBST) bir bloke edici çözeltisi 200 ul blok dokusu.
      1. prim ile inkübehafifçe çalkalayarak li antikorlar, 4 ° C'de bir gece boyunca bir blokaj çözeltisinin 100 ul seyreltilmiş. Önerilen antikor seyreltme için birincil antikor veri sayfası veya yayınlanmış literatüre bakın.
        NOT: Primer antikor seyreltme optimize edilmesi gerekebilir.
      2. yavaşça karanlıkta 4 ° C de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalanarak ya da PBST içinde beş ila 10 dakika yıkama sonrasında, floresan ikincil antikorlarla leke doku çözüm engelleme seyreltilmiştir.
      3. Yıkama numuneleri üç kez PBST içinde 10 dakika.
  3. DAPI-boyama çözeltisi 500 ul PBST değiştirin. F-aktin etiketlemek için, DAPI lekelemesi çözeltisine floresan boya konjuge Phalloidin ekleyin. Karanlıkta 15 dakika nutation sonra PBST ile 10 dakika boyunca bir kez doku yıkayın.
    Not: F-aktin etiketleme DAPI lekelemesi bağımsız yapılabilir.
  4. Nihai diseksiyon adım için, 1 ml pi kullanarak PBS dolu cam tabak içine geri doku transferiPette. ağız kanca off klibi forseps iki çift kullanma.
    1. analizi engel olabilecek büyümüş EAD olarak optik sap keserek EAD gelen invazivlik ölçümü için kullanılacak beyinleri ayırın.
  5. objektif sürgü üzerine monte edilen orta bir damla (22 mm x 22 mm'lik bir örtücü cam için 15 ul) yerleştirin. forseps ipuçları sayesinde, ince bir tabaka halinde orta dağıtın. Bir P20 mikropipet ile montaj ortama EAD, beyin veya EAD / beyin kompleksleri aktarın.
  6. doku dağıtmak ve slayt VNC düzeltmek için forseps ipuçları veya tungsten çubuk kullanın.
  7. Montaj sırasında kabarcık, ilk tarama bir montaj ortamına lamel kenarı ve forseps yardımıyla monte ortamı üzerine yavaşça düşük oluşumunu önlemek için. lamel kenarlarında aşırı montaj orta emmek için silme filtre kağıdı ya da doku küçük parçalar kullanın.
    Not: DABCO / Poli (vinil alkol) 4-88 montaj orta sertleşirbir saat içinde, 4 ° C'de. Slaytlar, 4 ° C 'de ay depolanabilir.

5. Konfokal Görüntüleme

  1. 20X, 40X ve 60X petrol hedefleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanılarak tek konfokal bölümleri ve yığınlarını edinin.
  2. piksel doygunluk önlemek. Ofset görüntü çözünürlüğü, lazer giriş gücü, kazanç, çerçeve ortalama alma, z-serisi bir adım boyutu dahil, aynı görüntü elde etme parametrelerini kullanın ve farklı genotipleri 21,22 arasında piksel yoğunluğunun karşılaştırmalar için izin tüm genotiplerde bu ayarları korumak.
    NOT: EAD / beyin kompleksinin görselleştirme için maksimum projeksiyonlar üretmek ve ilgili komşu görüntüleri dikiş. Son görüntü hazırlanması için, panel montajı için yazılan görüntü işleme yazılımı kullanmak ve parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için.

Tümör yayılmasını 6. sayısallaştırılması

  1. Tümör invasivenes farklı düzeylerde karakterize edecek bir puanlama sistemi tanımlamakistilası uzamsal desen ve beyin ve VNC yayılmasını GFP pozitif hücrelerin miktarı göz önüne alındığında bu. Belgeler (Şekil 3A) için değerlendirme sayfaları hazırlayın.
  2. Montaj en az 80, 24 mm x 50 mm'lik bir örtücü cam başına montaj orta 40 ul kullanılarak bir slayt her genotip için sağlam beyin sabit.
    1. tarafsız puanlama izin vermek için, puanlama prosedürü tarafsız böylece, slaytlar anonim bir nötr bir parti istiyoruz. bağımsız iki laboratuvar üyeleri tarafından anonim slaytlar değerlendirin. sayma bittikten sonra genotipleri ifşa.
  3. GFP filtre seti ile donatılmış bir floresan stereomikroskopta altına monte beyinleri kör skorlama ile malignite derecesi değerlendirin. Zaten çift sayımı (Şekil 3B) önlemek için incelendi var beyinleri etiketlemek için bir işaretleyici kullanın.
  4. genotip başına tanımlanan invaziv kategorilerin her düşen beyinleri yüzdesini hesaplayın. İstatistiksel s belirleyinignificance bir ki-kare testi (Şekil 3C) kullanarak.

7. RNA İzolasyon, DNaz Tedavi ve Kalite Kontrol

Not: Aşağıdaki adımlarda kullanılan tüm reaktifler (çözeltiler, plasticware) RNaz etkinliğinin arındırılmış olmalıdır. Her zaman eldiven giyin ve organik çözücüler ile çalışmak için bir kimyasal kaputu kullanın.

  1. 1.5 ml tüp içine kaplanmış P20 mikropipet ucu ile temiz EAD aktarın.
  2. tüpün dibine doku lavabo edelim, dikkatlice PBS kaldırmak ve 100 ul RNA parçalama reaktifi (en fazla 140 EAD için yeterli) ile değiştirin.
  3. vorteks Lyse doku. Bu noktada, örnekleri, sıvı nitrojen içinde dondurulur, derin ve -80 ° C'de saklandı veya doğrudan standart RNA izolasyon protokolü ile işlenmiş olabilir.
    NOT: Birden fazla diseksiyon mermi benzer genotiplerin örnekleri RNA parçalama reaktifi kez toplanmış olabilir.
  4. RNA parçalama reaktifi ile 0.9 ml örnek hacmi doldurun. kloroform 0,2 ml ilave edilir ve Vigoro örnekleri karıştırın15-20 saniye usly.
  5. Oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika inkübasyondan sonra, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj örnekleri.
  6. interfaz bozmadan yeni bir tüp içine renksiz üst sulu faz içeren RNA aktarın. proteinleri ve genomik DNA içerdiği uzak interfaz uzak durun.
    Not: geri kazanılan birim homojenizasyon için kullanılan RNA liziz reaktifi hacminin yaklaşık% 60 olması gerekmektedir.
  7. izopropil alkol, 0.5 ml ilave edilerek RNA hızlandırabilir. Vorteks ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin.
  8. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri.
  9. Süpernatantı atın ve% 75 etanol 600 ul kez RNA pelet yıkayın. Kısa bir girdap ve santrifüj (4 ° C'de 7 dakika boyunca 10,000 x) Sonuçta etanol atmak ve 5-10 dk temiz bir kağıt mendille silin açık tüp yerleştirmek için RNA pelet hava kurumaya bırakın.
    NOT: RNA pelet küçük opak beyaz / st olarak görünür olabilirtüp veya görünmez dibinde olgun. Kalan etanol damla dikkatle P10 mikropipet ucu ile temizlenebilir.
  10. bir pipet ucu ile bir kaç kez vorteks ya geçirilmesiyle DEPC ile muamele edilmiş su 50 ul RNA çözülür.
  11. genomik DNA ile kirlenmesini en aza indirmek için, DNase 1 ul (2 U / ml) ve DEPC ile muamele edilmiş su içinde 10 x DNaz tamponu 10 ul ihtiva eden bir karışım, 50 ul ekleyerek DNaz ile total RNA tedavi. Vortex ve aşağı doğru döndürün.
  12. bir su banyosu ya da 30 ila 40 dakika için bir ısıtma bloğu içinde 37 ° C'de inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir numune içine DEPC ile muamele edilmiş su, 100 ul ilave edin.
  13. DNaz gelen enzimatik aktivitesi ve temiz RNA inaktive fenol 200 ul için: 4 ° C'de 7 dakika boyunca 10,000 x g'de 1 dakika santrifüj için numune çözeltisi, girdap kloroform: izoamil alkol (1: 25: 24).
  14. Dikkatle yeni bir tüp içine RNA içeren üst sulu faz transfer. eşit hacim ekleme (200 ul)kloroform, mix ve yukarıdan santrifüj adımı tekrarlayın.
  15. Dikkatli bir şekilde, üst fazı toplayın ve 3 M sodyum asetat ve 1/10 hacimde eklenmesiyle RNA çökeltilmesi, pH 5.2% 100 etanol DEPC H2O ve 2.5 hacim hazırlandı. vorteks ile iyice karıştırın.
    NOT: Bir yağış karışımı 0.5 ul glikojen (20 mg / ml) ekleme RNA pelet görselleştirmek için yardımcı olur. silikonlu düşük bağlayıcı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, RNA kaybı en aza indirmek.
  16. en az 1 saat boyunca -20 ° C'de RNA hızlandırabilir.
    Not: inkübasyon gece boyunca sürdürülür. Örnekler hem -80 ° C 'de yerleştirilebilir.
  17. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile pelet RNA. Yıkayın ve 7.9 açıklamasında şu kuru pelet.
  18. DEPC ile muamele edilmiş su 10-15 ul RNA eritin. -80 ° C'de saklayın RNA.
  19. 230 nm, 260 nm ve bir spektrofotometre kullanılarak 280 nm'de OD ölçümü ile RNA miktarı ve saflık belirler. RNA co hesaplayınkongre uygulayarak ncentration 40 ug / ml RNA eşit nm 260 1 OD söyledi.
    Not: A 260/230 oranı 2.0-2.2 aralığı içinde olması gerekirken "saf" RNA nın bir 260/280 oranı 2.0 eşittir. 1.7 ve 2.0 arasında bir bir 260/280 oranı RNA örnekleri örneğin cDNA sentezi alt uygulamalar için uygundur. mRNA DİZİ kütüphanelerinin hazırlanması için RNA niteliği ve miktarı, otomatik bir elektroforez sistemi kullanılarak kontrol edilmelidir. 28S / 18S oranı 1.8 üzerinde olmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila EAD tanımlanan genotiplerin GFP işaretlenmiş yamalar oluşturmak için eyFLP-MARCM tekniğin potansiyel göstermek için, klon üç tip indüklenmiştir: Sadece (1) kontrol GFP ifade, (2) habis tümörler, küçük bir onkojenik biçimi eksprese bir tümör baskılayıcı geni Scribbles'ın homozigot kaybı (Scrib 1) 'in bir arka G-proteini Ras (RAS V12), ve (3) büyümeye devam fakat non-invazif ras V12 Scrib 1 JNK DN

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknikler Drosophila genetik mozaikler analiz ve gen fonksiyonu 33 işlemek için en gelişmiş araçlar arasında yer almaktadır oluşturmak için. O gözsüz arttırıcı aktif 9,18 olan dokularda, yani mekansal kısıtlı bir şekilde görsel olarak işaretlenmiş, genetik olarak tanımlanmış klonların indüksiyon izin verdiği eyFLP-MARCM sistemi güçlü ve sağlam olduğunu kanıtlamıştır. Birden çok genetik lezyonlar aynı hücrelerde birleştirilir, bu özellikle önemlidir. EAD ve beyin neuroepit...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloomington Stock Center'a (Bloomington, ABD), Dirk Bohmann, Katja Brückner ve Istvan Ando'ya sinek stokları ve antikorlar için teşekkür ederiz. El yazması hakkındaki yorumları için Marek Jindra ve Colin Donohoe'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Alexander von Humboldt Vakfı'ndan M.U.'ya verilen Sofja Kovalevskaja Ödülü ve Alman Araştırma Vakfı'ndan M.U.'ya UH243/1-1 DFG projesi ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarGewü rzmü hle Brecht, Eggenstein, Almanya00262-0500Sinek yemi tarifi: 160 gr agar, 360 gr maya, 200 gr soya unu, 1,6 kg sarı mısır unu, 1,2 L malt özü, 300 ml hafif mısır şurubu, 130 ml propiyonik asit ve 200 ml %15 nipagin ile 20 L sinek yemi hazırlayın. Sinek yemi 85 ° C'de 1 saat pişirilmelidir; °C.
Mısır şurubuGrafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Almanya01939
Propiyonik asitCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya6026.1
Mısır unuReformKontor GmbH, Zarrentin, Almanya4010155063948
Malt özüCSM Deutschland GmbH, Bremen, Almanya728985
Soya unuStockmeier Food GmbH, Herford, Almanya1000246441010
MayaWerner Ramspeck GmbH, Schwabach, Almanya210099K
Metil-4-benzoat / NipaginSigma-Aldrich, Deisenhofen, AlmanyaH5501%70 EtOH
Drosophila sinek gıda şişeleriKisker Biotech, Steinfurt, Almanya789008
Flakon tapalarıK-TK e.K., Retzstadt, Almanya1002
Drosophila fly gıda şişeleriGreiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya960177
Şişe tapalarıK-TK e.K., Retzstadt, Almanya1002 S
Poli (vinil alkol) 4-88 / [-CH2< / sub>CHOH-] n< / sub>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Almanya81381Montaj ortamı tarifi: 6 g Poli (vinil alkol) 4-88'i 39 ° C'de çözün; ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) ve 12.5 ml gliserol. Gece boyunca 50 ° C'de karıştırın; ° C ve santrifüj 20  5.000 rpm'de dk. % 2.5'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için süpernatana DABCO ekleyin. Alikotları -20 'de saklayın; °C.
1,4-Diazabisiklo[2.2.2]oktan / DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen, AlmanyaD2522
Triton X-100Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Almanya9002-93-1
Fosfat tamponlu tuzlu su / PBS137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2< / sub>HPO<>sub4< / sub> ve 1.8 mM KH2< sub>PO4< / sub>, Millipore H2O PBST'de pH 7.4
Almanya'da %0.1 Triton X-100
158127%4 PFA fiksatif tarifi: 4  çözün; 55 'ye ısıtılmış manyetik bir karıştırma plakası üzerinde 80 ml Millipore H2O'da g PFA; °C. Tüm PFA parçacıkları çözülene kadar damla damla 1 M NaOH ekleyin. 10 ml 10x PBS ekleyin ve pH'ı 1 M HCl ile 7.4'e ayarlayın. 100 & mikro'da karıştırın; l Triton X-100 ve Millipore H2< / sub>O ile 100 ml'ye kadar doldurun. Alikotları -20 ° C'de saklayın Tekrarlanan çözdürmeyi kaçının. (DİKKAT: PFA oldukça toksiktir. PFA sabitleyiciyi bir çeker ocakta hazırlayın. Bağımsız bir solunum cihazı, eldiven ve giysi giyin. Cilt, göz veya mukoza zarları ile temasından kaçının.)
Sığır Serum Albümini / BSASigma-Aldrich, Deisenhofen, AlmanyaA3059Bloke edici çözelti tarifi: PBST
Floresan etiketli phalloidinInvitrogen, Karlsruhe, Almanya, Moleküler ProblarA12379, A22283, A22284: Tozu (300 U) 1,5 ml Metanol içinde çözün. -20 ° C'de saklayın. Boyama için, PBST'de 1:250 (A12379, A22283) ve 1:100 (A22284) seyreltmede kullanın.
4 ',6-Diamidino-2-fenilindol Dihidroklorid / DAPICarl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya6335DAPI boyama çözeltisi: Millipore H2O'da 5 mg / ml'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve alikotları 4 ° C'de saklayın. PBST'de 1: 1,000 seyreltmede kullanılır.
Fare anti-H2 antikoruKurucz ve ark., 2003Engelleme çözeltisinde 1:500 seyreltmede kullanılır
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch, Suffolk, İngiltere715-175-151Bloke edici çözeltide 1:500 seyreltmede kullanılır
Dumont # 5 forsepsGüzel Bilim Araçları, Heidelberg, Almanya11295-10
Cam embriyo tabağı (30   mm)Thermo Scientific, Schwerte, AlmanyaE90
Tungsten iğneleriGüzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya10130-20
Nikel Kaplama Pim TutucuGüzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya26018-17
Mikroskop slaytlarıVWR, Darmstadt, Almanya631-1553
Lameller 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)VWR, Darmstadt, Almanya631-1336
Lameller 24 x 50 mm (0.13-0.16  mm)Thermo Scientific, Schwerte, Almanya1076371
Kimtech Science Hassas MendilThermo Scientific, Schwerte, Almanya06-677-70
Diseksiyon stereomikroskobuOlympus, Hamburg, AlmanyaSZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japonya)
Floresan stereomikroskopOlympus, Hamburg, AlmanyaSZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japonya) DP72 CCD kameraileGFP, diğer mavi uyarılabilir florokromların (uyarma filtresi BP460-480 nm, bariyer filtre BA495-540 nm) uyarılması için dar mavi bant geçiren filtre seti ve RFP ve diğer yeşil uyarılabilir florokromlar için dar yeşil uyarma ve uzun geçiren bariyer filtresi (uyarma filtresi BP530-550, bariyer filtre BA575IF) ile donatılmıştır. Yazılım: Olympus cellSens Standard 1.11.
Konfokal mikroskopOlympus, Hamburg, AlmanyaFV1000Ters çevrilmiş IX81 mikroskop ile donatılmıştır. Hedefler: 20 kez; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40 kez; UPlanFL (NA 1.30) ve 60&kez; UPlanApo (NA 1.35). Lazerler: UV lazer Diyot LD405 (50  mW), Argon lazer, çok hatlı 457/(476)/ 488/515 (40  mW), Sarı / Yeşil lazer diyot LD560 (15  mW) ve Kırmızı Lazer diyot 635 (20  mW). Yazılım: Fluoview 2.1c Yazılımı
Drosophila soğutmalı inkübatörEwald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Almanya  Sanyo MIR553
Fışkırtma şişesiVWR, Darmstadt, Almanya215-8105
BD Clay Adams Nutator MikserVWR, Darmstadt, Almanya15172-203
ELMI Dijital Sallanan ÇalkalayıcıVWR, Darmstadt, AlmanyaDRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lizis ReaktifiVWR, Darmstadt, Almanya2302700Protokol, diğer TRIzol tabanlı reaktifler, örneğin , Sigma'dan TRIreagent (Cat. Nr.T9424), Thermofisher'dan TRIzol reaktifi (Kat. Nr. 15596).
Dietil pirokarbonat / DEPCSigma-Aldrich, Deisenhofen, AlmanyaD5758DEPC 1: 1.000'i Millipore H2< / sub>O'da seyreltin, gece boyunca karıştırın ve otoklavlayın.
Ultra Saf Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol (25:24:1)ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Almanya15593-031
KloroformMerck, Darmstadt, Almanya102445
TURBO DNaz (2 U/&mikro; l)Thermo Scientific, Schwerte, AlmanyaAM2238
Invitrogen UltraPure GlikojenThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Almanya10-814-010
Sodyum asetat trihidratVWR, Darmstadt, Almanya27652.232DEPC-H2O ile 3 M Sodyum asetat çözeltisi hazırlayın ve pH'ı 5.2'ye ayarlayın
2-PropanolMerck, Darmstadt, Almanya
EthanolMerck, Darmstadt, Almanya100983DEPC-H2O ile %75 EtOH seyreltmesi hazırlayın.
UV/Vis-Spektrofotometre NanoDrop ND-8000Thermo Scientific, Schwerte, AlmanyaND-8000
Eppendorf Mikrosantrifüj (Soğutmalı)Thermo Scientific, Schwerte, Almanya5417R
Experion RNA StdSens Analiz KitiBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Almanya7007103
Experion Otomatik Elektroforez İstasyonuBio-Rad Laboratories GmbH, Mü Nchen, Almanya7007010
SuperScript III Ters TranskriptazThermo Scientific, Schwerte, Almanya18080044
Oligo d(T) PrimerEntegre DNA Teknolojileri, Leuven, BelçikaPrepare 100 &mikro; DEPC-H2O'da M stok çözümleri ve -20 ° C'de saklayın; C
dNTP KarışımıTakara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Fransa403025 & mikro mağaza alikotları; l -20° C
CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Almanya1855195
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Almanya170-8882
Sert Kabuklu PCR Plakaları 96 kuyulu, ince duvarlıBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, AlmanyaHSP9601
Microseal 'B' FilmBio-Rad Laboratories GmbH, Mü Nchen, AlmanyaMSB1001
rp49 İleri astarEntegre DNA Teknolojileri, Leuven, Belçika5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Ters astarEntegre DNA Teknolojileri, Leuven, Belçika5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 İleri astarEntegre DNA Teknolojileri, Leuven, Belçika5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Ters astarEntegre DNA Teknolojileri, Leuven, Belçika5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'
ile %15 stok çözeltisi hazırlayın PBS Paraformaldehit/ PFA Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Phalloidin stok çözeltisinde %0,3 BSA'yı çözün109634

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  2. Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
  3. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  4. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  6. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  7. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  8. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  9. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  12. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
  13. Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).
  14. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  15. Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
  16. Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
  17. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  18. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
  19. Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
  20. Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
  21. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  22. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  23. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
  24. Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
  25. Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
  26. Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063(2012).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  28. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  29. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  30. Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
  31. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
  32. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
  33. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
  34. Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
  35. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  36. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  37. Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
  38. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  41. Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
  42. Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).
  43. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  44. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Imaginal DiscGenetic MosaicsMARCM TechniqueFluorescent MicroscopyConfocal ImagingRNA IsolationTumor InvasivenessJNK SignalingHemocyte InfiltrationMMP1 Expression

Related Articles