Yöntem makalesi

bir

DOI:

10.3791/54592

⸱

8 Aralık 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçlara odaklanarak, empedans hücre spektroskopisini kullanan kan-beyin bariyerinin in vitro bir murin modelini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan-beyin bariyerinin (BBB) parçalanması, multipl skleroz (MS) ve hayvan modeli deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) gibi otoimmün hastalıkların gelişiminde kritik bir adımdır. Bu süreç, aktive edilmiş T hücrelerinin, BBB'nin ana bileşenleri olan beyin endotel hücreleri (EC'ler) boyunca transgrasyonu ile karakterize edilir. Bununla birlikte, bu tür T hücreleri ile etkileşim üzerine beyin EC fonksiyonu üzerindeki sonuçlar büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, zaman içinde T hücreleri ile etkileşim sırasında birincil fare beyni mikrovasküler EC (MBMEC) fonksiyonunun ve bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesine izin veren bir testi açıklıyoruz. Test, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ve hücre tabakası kapasitansındaki (Ccl) değişiklikleri ölçerek EC tek tabaka bütünlüğünü ve geçirgenliğini incelemek için güçlü bir araç olan empedans hücre spektroskopisini kullanır. EC'lerle doğrudan temas halinde, uyarılmış ancak naif olmayan T hücreleri, TEER'de bir azalma ve Ccl'de bir artış ile görselleştirildiği gibi, EC tek katmanlı disfonksiyonu indükleyebilir. Test, EC tek tabaka bütünlüğündeki değişiklikleri sürekli ve otomatik bir şekilde kaydeder. Farklı uyaran güçleri ile T hücresi aktivasyon seviyeleri arasında ayrım yapacak kadar hassastır ve antikorlar, farmakolojik reaktifler ve sitokinler gibi çok çeşitli maddeler kullanılarak T hücresi-EC etkileşiminin hedefli bir modülasyonunun sonuçlarının araştırılmasını sağlar. Bu teknik aynı zamanda in vitro T hücresi transmigrasyon testlerinde EC bütünlüğü için bir kalite kontrol olarak da kullanılabilir. Bu uygulamalar, onu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında BBB özelliklerini incelemek için çok yönlü bir araç haline getirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3 -, kan-beyin bariyeri, merkezi sinir sistemi (MSS) 1 sistemik dolaşıma ayırır. Bu hücrelerin serbest dolaşımını ve suda çözünen moleküllerin difüzyon engeller ve patojenler ve potansiyel olarak zararlı maddelerden koruyan beyin fiziksel bir engel oluşturur. bariyer fonksiyonuna ek olarak, BBB nöronal doku düzgün işleyişini sağlayan beyin parankimi, oksijen ve besin iletimini sağlar. BBB fonksiyonel özellikleri son derece son derece uzmanlaşmış EC ana yapı elemanı olmak üzere, hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından düzenlenir. BBB EC sıkı birleşme (TJ) kompleksleri, fenestrasyonlar eksikliği, aşırı düşük pinocytic aktivitesi ve kalıcı olarak aktif taşıma mekanizmaları varlığı ile karakterize edilir. endotel, astrositik uç ayak ve = ilişkili par katıştırma Diğer BBB bileşenleri AK bazal membran, perisitlerenchymal bazal membran da bbb 2,4 geliştirilmesi, bakım ve işlevine katkıda - 6 ve birlikte nöronlar ve mikroglia ile merkezi sinir sistemi 7 doğru çalışmasını sağlayan nörovasküler birimi (NVU) meydana - 9.

Bu gibi nörodejeneratif, enflamatuar veya bulaşıcı hastalıklar gibi nörolojik hastalıklar, çeşitli, BBB fonksiyonu 2,5,10 ele almaktadır. TJ kompleksleri ve moleküler taşıma mekanizmaları düzensizliği BBB geçirgenliği, lökosit ekstravazasyonu, enflamasyon ve nöronal hasarı sebep olur. Böyle patofizyolojik koşullarda BBB özelliklerini incelemek amacıyla, çeşitli in vitro BBB modelleri 9,11,12 kurulmuştur. Birlikte bariyer bütünlüğünün, geçirgenlik yanı sıra taşıma mekanizmaları değişiklikleri değerli bilgiler sağlamıştır. Bu modeller, insan, fare, sıçan, domuz veya b endotel hücrelerini kullanırKoyun kökenli 13-18; 25 - primer endotel hücreleri ya da hücre hatları, in vivo 19 daha yakından BBB taklit etmek için perisitler ve / veya astrositler ile tekli kültür olarak ya da birlikte kültürlenir. Son yıllarda, endotel elektrik direnci (TEER) ölçümü endotel bariyer özelliklerinin 26,27 değerlendirmek için yaygın olarak kabul gören bir araç haline gelmiştir.

TEER hücre tek tabaka boyunca iyon akı empedansı yansıtan ve onun azalma tehlikeye endotel bariyer bütünlüğünün ve dolayısıyla artan geçirgenliği hassas bir ölçümünü sağlar. 30 - Çeşitli TEER ölçüm sistemleri Epitelyal Voltohmmeter (EVOM), elektrik Hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) ve gerçek zamanlı hücre analizi 15,28 dahil olmak üzere geliştirilmiştir. TEER bitişik EC arasındaki iyon akımının (paraselüler yol) direnç gösterir ve doğru orantılıdırbariyer bütünlüğü. Empedans spektroskopisi 27,31 yılında, karmaşık toplam empedansı (Z) CCL ölçerek bariyer bütünlüğünün hakkında ek bilgi sağlar, hangi ölçülür. CCL hücre zarı (transsellüler yol) üzerinden kapasitif akımı ile de ilgilidir: hücre katmanı zarın her iki tarafında ücretleri ayırma eşdeğer elektrik devresinde bir kapasitör gibi davranır ve ters bariyer fonksiyonunun orantılıdır. geçirgen ekler üzerinde yetiştirilen zaman, EC, uygun çoğalırlar ve mikro gözenekli membran yayıldı. Bu (kendisi bir kondansatör gibi davranır) ve minimal seviyeye ulaşana kadar kapasitans bir azalmaya yol açar ucun arka kapasitif akımını direnç gösterir. Bu TJ kurulması takip eder komşu EC arasındaki boşluk kapalı olduğu mühür kompleksleri. Bu parasellüler yoldan iyon akı kısıtlar ve onun plato ulaşana kadar TEER arttırır. inflamatuar koşullar altında, ancak, endothelial bariyer tehlikeye: TJ bozulur olsun kompleksleri ve ekin kapasitif bileşeni tekrar yükseldiğinde Ccl arttıkça TEER azalır.

Bizim TEER ölçümü otomatik hücre izleme 32 sistemi kullanır: Bu empedans spektroskopisi prensibini takip eder ve önceki uygulamalarını uzanır. Burada, bağışıklık hücreleri ile beyin endotel etkileşimi de dahil olmak üzere bariyer özellikleri çalışma, sağlayan in vitro BBB modeli tarif; özellikle aktive edilmiş T hücreleri. 37 - Bu patofizyolojik koşullar, çoklu skleroz ve hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit 33 olarak merkezi sinir sisteminin bağışıklık hastalıklarının gözlenmektedir. Burada, çok önemli bir adımdır BBB boyunca ensefalitojenik, miyelin özgü T hücrelerinin göçü olup. Bu beyin parankimi içine perivasküler alanda ve giriş onların reaktivasyonuna tarafından takip edilir, diğer bağışıklık hücrelerini işe ve bana neredeACİL enflamasyon ve daha sonra demiyelinasyon 1,35,38. Bununla birlikte, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimin moleküler mekanizması, BBB temel bileşenler, iyi anlaşılmamıştır. Bizim protokol bu boşluğu doldurmak ve aktive T hücreleri ile bunların doğrudan temas ve karmaşık etkileşimi üzerine endotel hücreleri (yani, bariyer bütünlüğü ve geçirgenlik) üzerinde sonuçları yeni bir bakış açısı kazandırmayı amaçlamaktadır.

Burada açıklanan protokol mikro-gözenekli membran ile geçirgen eklerde üzerinde tek-katman olarak yetiştirilen primer fare beyni mikrovasküler endotel hücreleri, kullanır. Endotel hücreleri, ortak-kültürlenir poliklonal veya antijen spesifik şekilde ya da ön-aktive edilebilir, CD4 + T hücreleri ile. Ön-aktifleştirilmiş, ancak saf T hücreleri ile MBMECs Co-kültür TEER bir azalmaya ve MBMEC fonksiyon bozukluğu ve engelleyici bir bozulma nicel ölçümünü sağlar CCl bir artışa da neden olur. tekniknon-invaziv: built-in yerine AT tek tabaka büyük olumsuz yönde etkilenmemesi çubuk elektrotlar, kullanır; hücre belirteçleri kullanılmadan bariyer fonksiyonunu izlemek için de kullanılabilir. Bu otomatik bir şekilde sürekli ölçümler yapar ve aynı anda zamanla iki bariyer parametreleri (TEER ve Ccl) bağımsız bir değerlendirmesini sağlar. Yöntem ayrıca, farklı T hücresi aktivasyonunun seviyeleri ve EC ile T hücrelerinin etkilerini ayırt kadar hassastır.

Bu fonksiyonel analizlerin geniş bir kullanılabilir: inflamatuar süreçlere de karışırlar farklı sitokinler ve / veya kemokin MBMECs ve T hücrelerinin ko-kültür ilave edilebilir; EC ya da T-hücresi, her iki yanında, hücre yapışma moleküllerinin karşı bloke edici antikorlar kullanılabilir; ve T hücre aktivasyon işaretleme maddelerinin veya sitolitik özellikleri inhibitörleri, T-hücresi priming veya EC ile ko-kültür sırasında ilave edilebilir. Tahlil, aynı zamanda, T-hücresi göçü için kullanışlıdırdeneyler, bu T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, MBMEC tek tabaka bütünlüğünün bir kalite kontrol olarak hizmet edebilmektedir. Bütün bu yöntemini AK tek tabaka bütünlüğünü aktive T hücrelerinin etkisi odaklanarak, in vitro BBB incelemek için çok yönlü ve güvenilir bir araçtır. Bu, kendi kendine reaktif ensefalitojenik T hücreleri BBB çapraz ve enflamasyon ve nöronal zarara neden MS ve hayvan modeli EAE gibi oto-bağışıklık hastalıklarının patojenezinde BBB bozulma mekanizmalarının anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hayvan bakımı Alman kurallarına göre tüm deneyler için, fareler yetiştirilmiş ve Münster University merkezi bir hayvan tesisine spesifik patojenden serbest durumlar altında tutulur. Bütün deneyler hayvan deneylerinin etik komitenin kurallarına göre yapılır ve Kuzey Ren-Vestfalya, Almanya (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) yerel otoriteler tarafından kabul edildi.

1. MBMEC İzolasyon ve Kültürü

Not: Daha önce şu değişiklikler detaylı 14'de anlatıldığı gibi MBMECs izole:

  1. CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) 20 yetişkin C57BL / 6 fareler kurban ve kalp ve solunum arrest araştırarak onların ölümünü onaylayın.
  2. % 70 etanol ile fare durulayın ve makas kullanarak başını kesmek; forseps ve makas kullanılarak kafa derisi çıkarın. foramen magnum başlayarak, kafatasının sol ve sağ tarafında kesiler olun. onun kuyruk tarafı ve tak gelen kafatası kaldırınforseps ile beyin dışarı e.
  3. Laminer akış kaputu altında, sadece korteks tutarak, bir Petri kabındaki beyin yerleştirin ve beyin sapı, beyincik ve talamus kaldırmak için steril forseps kullanabilir.
    NOT: Bir mikroskop kullanımı, bu herhangi bir aşaması için gerekli değildir.
  4. Steril Western lekeleme bir kağıt parçası üzerine korteksi yerleştirin ve meninks artık görünür olana kadar forseps ile yavaşça yuvarlayın.
  5. (Protokol 14 Aşağıdaki) mekanik ve enzimatik sindirimden sonra, uzun, steril bir iğne ve 5 mi piston kullanılarak yoğunluk gradyanı endotel hücreleri toplamak. Endotel hücreleri eritrositler ile kırmızı halka üzerinde bir karanlık bir tabaka olarak görünür. Yeni 50 mi santrifüj tüpe bu katmanın devri 20-25 mi; DMEM ile tüp kontör.
  6. Yıkama 14 iki tur sonra, puromisin içeren MBMEC ortamında (4 ug / ml), 6 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 24 oyuklu plaka altı kaplanmış oyuklarına üzerine onları tohum; bir dokuda onları terk37 ° C'de ve% 5 CO2 kültür inkübatörü üç gün (buradan itibaren "kuluçka" olarak adlandırılır).
    NOT: MBMEC kaplama çözeltisinin ayrıntılar için Malzemeler Tablosuna bakınız.
  7. Puromisinin olmayan, taze MBMEC ortam, her sıra için, 1 ml ilave edilerek orta değiştirme; iki gün daha geri 37 ° C ve% 5 CO2 de tabak koydu.

2. Hasat MBMECs

  1. MBMEC izolasyondan sonra Beşinci günde MBMEC kaplama solüsyonu ile ön kaplama geçirgen eklerde: uç başına çözeltisi 80 ul ilave edin ve 3 saat boyunca CO2 37 ° C'de bırakmak ve% 5.
  2. Dikkatle kaplama çözüm pipet ve 30 dakika boyunca ekler hava kurumaya bırakın. orta yıkamak MBMECs kullanılarak plaka her oda sıcaklığında 2 ml (RT) PBS ilave et; bu adımı tekrarlayın. % 0.05 tripsin-EDTA (oyuk başına 300 ul) ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca inkübatör plaka bırakın.
  3. durdurmak için her bir oyuğa MBMEC orta 2 ml ilave edilirtrypsinization. 15 ml santrifüj tüpüne hücreler toplandı aktarın ve 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve Puromisinin olmadan MBMEC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
  4. Hücreleri saymak; % 0.04 tripan mavi 90 ul (hücre 10x seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın. Pipet cam kapak ve hücre sayım odasına (hemositometre) arasındaki bu karışımı 10 ul. odanın (N), dört çeyrek Tripan Mavisi içermeyen hücrelerin sayısı ve sayılan hücrelerin (N ") 'nin ortalama sayısını belirlemek aşağıdaki gibidir: K' = K / 4.
  5. Aşağıdaki formül kullanılarak (10 6 hücre / ml), hücre konsantrasyonu hesaplanır: C = N x 10 4 hemasitometre boyutlarıyla verildi ve 10 adım 2.4 seyreltme faktörüdür 10 x 10 4,.
  6. Tohum uç başına 260 ul'lik bir hacim içinde 2 x 10 4 hücre. her bir alt bölmeye MBMEC ortamının 810 ul ekle. bölüm 4 ile devam etmek için hazır olana kadar inkübatör ekler ile plaka koyun.
    NOT: Üst ve alt bölüm için hacimleri insert spesifik ve tüm 24-kuyu biçimleri için işe yaramaz.

3. CD4 + T hücre izolasyonu ve Uyarım

  1. CD4 + T hücre Isolation
    1. CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) bir yetişkin fare Kurban ve kalp ve solunum arrest ascertaining ederek ölüme onaylayın.
    2. Temiz bir diseksiyon gemide sırtında fare yerleştirin ve% 70 etanol ile durulayın; dalak ve lenf nodları (inguinal, koltuk altı, brakiyal ve rahim ağzı) periton açıp kaldırmak için steril makas ve forseps kullanabilir; Son olarak, buz üzerinde 5 ml PBS içeren 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın.
    3. Laminer akış Kaputun altında, üstünde bir 70 mikron hücre süzgecinden ile 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku ile PBS boşaltılarak doku transferi; homojenleştirmeksüzgecinden 1 ml pistonu ile bastırarak dokusudur.
    4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de FACS tamponu ve santrifüj bunu 30 ml ekleyin. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. tüp FACS tampon diğer 20 ml ekleyin, 40 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre.
    5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de o santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve FACS tampon 500 ul hücreleri tekrar süspansiyon.
    6. Fare CD4 manyetik mikro boncuklar 20 ul ekle karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de FACS tamponu ve santrifüj bunu 25 mL ekleyin.
    7. Bu süre zarfında, mıknatıs bir LS ayırma sütunu yerleştirin ve FACS tamponu 3 ml ile durulayın. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
    8. sütun hücreleri ekleyin. üç kez FACS tamponu 3 ml sütun yıkayın. mıknatıstan sütunu kaldırmak ve yeni bir 15 ml merkezkaç üzerine yerleştirinfugation tüp. FACS tampon 5 ml ekleyin 5 dakika 4 ° C için 500 xg'de sütun piston ve santrifüj onu etiketli hücreleri yıkayın.
    9. Süpernatant atılır ve T hücre ortamının 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Oyuk başına ortam 100 ul 2.4 ve tohum 1 x 10 5 hücre tarif edildiği gibi hücre sayımı.
  2. CD4 + T hücre uyarımı
    1. Poliklonal CD4 + T hücre uyarımı
      1. Ön kaplama, istenen nihai konsantrasyonda saflaştınlmış anti-fare CD3 antikoru PBS (klon 145-2C11), bir yuvarlak dipli 96 oyuklu plaka. Örneğin, 1 ug / ml'de α-CD3 ile tam plaka ön kaplama için, PBS, girdap, 5 ml antikor 10 ul (stok konsantrasyon = 0.5 mg / ml) karıştırmak ve karışımın 50 ul iyi çok kanallı pipet ile her.
      2. 3 saat inkübatörde plaka bırakın. T hücrelerinin izole edilmesi sonra PBS ile iki kez önceden kaplanmış plakayı yıkayın. (Klon saflaştırılmış anti-CD28 antikor ekleyinArzu edilen bir nihai konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri (kadar 37.51), örneğin, 1 ug / ml); iyice karıştırın. T hücrelerini Tohum ve iki ya da üç gün boyunca inkübatör onları bırakın.
    2. Dendritik hücreler (DC'ler) ile antijene özgü CD4 + T hücresi uyarımı
      Not: DCler antijen sunan hücreler (APC'ler) olarak kullanılması halinde, bu özel durumlar dışında, T hücresi izolasyon Protokolü izleyin:
      1. dalak homojenize önce, 0.5 mg / ml PBS içinde kollajenaz tip Ia 1 ml enjekte ve 15 mi santrifüj tüpe aktarın.
      2. 15 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde inkübe edin. PBS ile yıkandıktan sonra, FACS tampon pelet tekrar süspansiyon ve 20 fare CD11c, manyetik mikro boncuklar ul yerine CD4 mikro ekleyin.
      3. MS ayrımı kolonu ve uygun hacimlerde: FACS tampon 1 ml kolon durulama; FACS tampon 1 ml ve tekrar süspansiyon Hücreler, FACS tamponu üç kez 1 ml sütun yıkayın.
      4. ilanDCler (örneğin, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) aa 35-55 20 de ug / ml) için tercih edilen bir D antijen, iyice karıştırın ve tohum 5 x 10 4 hücre T hücre kültür ortamında 100 ul başına 96 yuvarlak Alt- iyi.
      5. Protokol T hücre izolasyonu tarif edildiği gibi, sonunda 96 yuvarlak dipli-oyuk başına T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleyin.
    3. B hücreleri antijen-spesifik CD4 + T hücresi uyarımı
      NOT: B hücreleri APC 'olarak kullanılması halinde, bu istisnalar, T hücre izolasyonu için Protokolü izleyin:
      1. Olan B hücreleri (B hücreleri, özellikle MOG 35-55 tanır, örneğin, IgH MOG (Th) fareler) antijen spesifik transgenik farelerden dalak kullanın.
      2. (TCR MOG (2B2) fareler arasında, örneğin) antijen-spesifik T hücreleri kullanır. Fare CD19 manyetik mikro boncuklar yerine CD4 mikro 20 ul ekleyin.
      3. B cel için tercih edilen antijen ekleLS (örneğin, 20 ug / ml'de MOG 35-55), 96-yuvarlak dipli oyuklu her B hücre kültür ortamında 100 ul 5 x 10 4 hücrelerini karıştırın ve tohum.
      4. Her T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleme 96 yuvarlak dipli çukurlu T hücresi izolasyon Protokolü hazırlanır.

4. Kurma ve TEER Ölçümü Sahne

  1. Laminer akış kaputun altında TEER aletinin 24 kuyu modülünü yerleştirin. forseps kullanarak enstrüman MBMECs ile kapakları ve yer ekler çıkarın.
  2. Modül kuyu alt bölmesine taze ortam 810 ul pipet: uç ve de modülün duvarı arasında dikkatli bir şekilde ekleyin.
  3. kapaklarını kapatın ve inkübatör aleti koyun. kendi bilgisayarına aleti bağlayın; Gösterge denetleyicisi açmak ve yazılımı açın.
  4. Pop-up pencerede 'yeni ölçüm' seçeneğini seçin. Check 'şov TEER' ve 'gösteri CCI' kutuları; tuşuna basın 'start'. İlk ölçüm tamamladıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için 'sonuçları' sekmesinde 'tüm kuyuları kontrol' seçeneğini seçin.
  5. 'Dosyanızın adı'> Farklı kaydet> Dosya: Dosyayı kaydedin.
    NOT: TEER ve Ccl sürekli olarak, otomatik bir şekilde ölçülür olarak, üç ila beş günlük bir süre boyunca değerlerini izler. hücre canlılığı, optimal olmadığı sürece TEER artış eksikliği ile gösterildiği gibi orta değiştirme gerekli değildir.
  6. Ccl istikrarlı ve daha düşük 1 mF / cm 2 ve TEER maksimum seviyeye ulaştığında T hücreleri ile MBMECs kültür eş zamanlı noktasını seçin.
  7. Dikkatle mutlak TEER ve Ccl değerlerini incelemek ve MBMECs bu tür kuyular işaretini kaldırarak konfluan yeterli mono tabakaları gelişmemiş olan kuyular hariç.
  8. Grup kuyuların kalanı: Bir kuyu üzerinde sağ tıklayın ve 'yeni ortalama kuyu iyi eklemek' seçeneğini seçin. namPop-up pencerede e; tüm bireysel kuyuları gruplandırılmış olması için de aynı şeyi.
  9. hepsi ko-kültür önce aynı başlangıç ​​koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyu kontrol edin. Bazı önemli ölçüde farklı mutlak TEER değerlere sahip veya TEER eğimli veya standart hatalar çok büyükse, gruplama kokan.
    NOT: Kuyular optimal gruplama içinde ve deney grupları arasında hem TEER değerlerinde minimum varyasyon sağlar.
  10. 'Deney' sekmesinde, basının 'pause', enstrüman ayırın ve inkübatör dışına götürün. Laminer akış kaputun altında kapaklarını çıkarın.
  11. Hazırlanan önceden aktive arzu edildiği gibi, veya belirli sitokinler, antikorlar ya da diğer maddeler olmadan ve / veya naif T hücreleri: hazırlanmış T saflaştırılmıştır mix NA / LE sıçan anti-fare IFN-γ antikoru (klon XGM1.2): Örnek hücreler, TEER aygıtının oyuk başına 20 ug / ml'de.
    NOT: Bu Granzim B inhibitörü olarak maddeler kullanıldığında, bunlar, birT hücresi stimülasyon başında olan T hücre kültürüne dded: örneğin, Granzim B inhibitörü II (Calbiochem) DMSO içinde 10 mM'lik bir son konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri ile karıştırılır. Daha fazla bilgi için malzemeler ve donatım bakın.
  12. Ovülden orta (üst kuyu bölmesi) bazı kaldırın: (Bu MBMEC tek tabaka rahatsız olabilir gibi tüm orta kaçınılmalıdır kaldırma), örneğin dikkatlice 150 ul dışarı pipetle.
  13. Dikkatli bir şekilde 2 x 10 5 hücre / parçasını içeren ortam 150 ul pipetleme MBMECs T hücrelerinin ekleyin.
    NOT: Önceden aktive T hücreleri hasat, yalnızca, Tripan Mavi-serbest hücreleri patlatma saymak.
  14. kapaklarını kapatın ve tekrar inkübatör cihazı yerleştirin. enstrüman ve basın 'özgeçmiş ölçümü' yeniden bağlayın. ve 'deney' sekmesinde 24 saat, basın 'dur' sonra dosyayı (Dosya> Kaydet) kaydedin.

5. Veri Aktarma ve İstatistiksel Analiz

  1. Dosya> Dışa Aktar'ı seçerek sonuçları ihracat.
  2. Pop-up pencere "ayarları" sekmesinde, "alan sınırlayıcı" seçeneğinde "ondalık ayracı" seçeneğinde ".dot" ve "sekme" seçeneğini seçin.
  3. "İhracat sonuçları" sekmesinde, dosya adı tüm kuyuları ihraç edilecek kontrol ve "verileri seçmek" seçeneğindeki "teer" ve "Ccl" onay kutularını.
  4. Basın "ihracat verileri," aktarılan dosyayı açın ve bir elektronik tabloya veri kopyalama.
  5. ko-kültür önceki son zaman noktasında Set TEER ve Ccl değerleri% 100 ve diğer tüm için buna göre değerleri değiştirmek: (Her çalışma (ölçüm için verilen TEER ve Ccl değerleri ile, her tekrarında sıralama kriteri:)) ihraç veri normalleştirmek '% 100' vadede göreceli çalışır.
  6. ayrı ayrı kuyuların kullanılarak ve her tedavi grubu için ortalama standart hata gösteren bir grafik oluşturmak için bir seçim yazılımı normalleştirilmiş verileri kopyalama.
  7. Pseçim istatistiksel yazılımı kullanarak, çoklu karşılaştırmalar için bir Bonferroni düzeltmesi İki yönlü ANOVA istatistik testi erform.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan in vitro BBB modelinin genel bir bakış sağlar. Deney üç ana adımdan oluşur. İlk adım beyin korteks primer MBMECs izolasyonu ve beş gün boyunca onların kültürüdür. Onlar hücre kültürü plakasına izdiham ulaştığınızda, MBMECs tripsinize ve sonra TEER enstrüman yerleştirilir geçirgen ekler, üzerine reseeded edilir. TEER ve MBMECs CCL sürekli olarak ölçülür ve üç ila beş günlük ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tarif edilen protokol birkaç adım başarılı deney için gereklidir. Başlangıç ​​MBMEC izolasyonu ve kültürü sırasında, çalışma mantar sporları, bakteri veya hücre kültürünün bulaşmasını önlemek için, mümkün olduğu kadar, steril koşullar altında gerçekleştirilir çok önemlidir. EC saf bir kültür elde etmek için, bir EC hayatta kalmasını sağlayan, ilk üç gün puromisin içeren ortam, ancak diğer hücre türleri (özellikle perisitler) 41,42 kullanılması tavsiye edilir. özel dikkat gösterilmesi gereken bir diğer önemli ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl ve L. Klotz'un açıklayacak hiçbir şeyi yok. H.-J. Galla, otomatik hücre monitörü üreticisi nanoAnalytics GmbH'nin bilimsel danışmanıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz TEER ölçümlerine ilişkin yararlı tartışmalar için Annika ENGBERS ve mükemmel teknik destek için Frank Kurth ve Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) minnettarız. Bu çalışma, HW ve LK, CRC TR128, için SFB1009 proje A03 A08 projeleri Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir; Z1 ve B01 LK ve LK HW ve (Münster Tıp Fakültesi) Klinik Araştırma Disiplinlerarası Merkezi hibe sayısı Kl2 / 2015/14 için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.com şunlarıiçerir: 24 kuyulu Hücre Modülü, Kontrolör, cellZscope yazılımı v2.2.2 
UltrasantrifüjTermo Bilimselwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; MBMEC izolasyon
akış sitometresiBeckman Coulterwww.beckmancoulter.comT hücresi transmigrasyonunun analizi için
FlowJo7.6.5 yazılımıT hücresi transmigrasyonunun analizi içinTree Starwww.flowjo.com
Oak Ridge santrifüj tüpleri, PCThermo Fisher Bilimsel3118-005050 ml; MBMEC izolasyonu için
Transwell membran ekleri - gözenek boyutu 0.4 ve mikro; Anaokuma olarak TEER ölçümü içinCorning3470
Transwell membran ekleri - gözenek boyutu 3 ve mikro; mCorning3472T hücresi transmigrasyon testinden önce kalite kontrol olarak TEER ölçümü için
24 oyuklu hücre kültürü plakasıGreiner650 180düz tabanlı; MBMEC kültürü için
96 oyuklu hücre kültürü plakasıCostar3526yuvarlak tabanlı; bağışıklık hücre kültürü için
QuadroMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-090-976T hücresi ve B hücresi izolasyonu için; destekler Dendritik hücre izolasyonu için MACS LS
sütunları OctoMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-109; MACS MS sütunlarını destekler
Hücre sayımı içinNeubauer sayma odasıMarienfeldMF-0640010
Hücre süzgeci, 70 & Bağışıklıkhücresi izolasyonu içinCorning352350
Hücre süzgeci, 40 & Bağışıklıkizolasyonu için m Corning352340Bağışıklık hücresi izolasyonu için
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303T
MACS LS ayırma sütunlarıT hücresi ve B hücresi izolasyonu içinMiltenyi Biotec130-042-401
Dendritik hücre izolasyonu içinMACS MS ayırma sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-201
Fare CD4 Mikro BoncuklarCD4 + < / sup>130-049-201
Fare CD19 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-201B hücresi izolasyonu için
Fare CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001Dendritik hücre izolasyonu için
İnsan plasentasından kollajen tip IVMBMEC kaplama çözeltisi içinSigmaC5533
Fibronektin MBMEC kaplama çözeltisi içinSigmaF1141-5MG
MBMECKollajenaz 2 (CSL2)WorthingtonLS004176
Kollajenaz/Dispas (C/D)MBMEC izolasyonu içinRoche11097113001
MBMEC izolasyonu içinDNase ISigmaDN25
Fetal Sığır Serumu (FBS)SigmaF7524
MBMEC izolasyonu içinSığır Serumu Albümini (BSA)Amresco0332-100G
MBMEC izolasyonu içinPercollSigmaP1644-1L
MBMEC izolasyonu ve MBMEC kültür ortamı içinDMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021
MBMEC izolasyonu ve MBMEC kültür ortamı içinPenisilin / StreptomisinSigmaP4333
Fosfat Tamponlu MBMEC ve bağışıklık hücresi izolasyonu içinSigmaD8537
MBMEC kültür ortamı içinHeparinSigmaH3393
İnsan Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF)MBMEC kültür ortamı içinPeproTech100-18B
PuromycinSigmaP8833;sadece ilk üç gün için
% 0.05 Tripsin-EDTAGibcoMBMEC'lerin hasadı için
Dendritik hücre izolasyonu içinKollajenaz Tip IASigmaC9891
Tripan Mavisi çözeltisi, hücresayımı içinThermo Fisher Scientific15250061
EDTAİmmün hücre izolasyonu içinSigmaE5134
IMDM + %1 L-GlutaminGibco21980-032T hücre kültürü ortamı
X-VIVO için 15LonzaBE04-418Qışıktan koruyun; B hücre kültürü ortamı
ve beta; - merkaptoetanolGibco31350-010için B hücre kültürü ortamı
L-Glutamin (100x Glutamax)Gibco35050-061B hücre kültürü ortamı için
fare MOG35— Antijeneözgü T hücresi aktivasyonu içinBiotrendBP0328
saflaştırılmış anti-fare CD3 AbBioLegend100302klonu 145-2C11; poliklonal T hücresi aktivasyonu için
saflaştırılmış NA/LE anti-fare CD28 AbBD Pharmingen553294klonu 37.51; poliklonal T hücresi aktivasyonu için
Rekombinant Murin IFN-&gama;T hücresi transmigrasyon testleri içinPeproTech315-05
Rekombinant Murin TNF-&alfa;T hücresi transmigrasyon testleri içinPeproTech315-01A
NA/LE saflaştırılmış anti-fare IFN-&gama; antikorBD Biosciences554408klonu XMG1.2; önerilen son konsantrasyon: 20 & g/ml
Granzyme B İnhibitörü IICalbiochem368055önerilen son konsantrasyon: 10 &mikro; M
PE anti-fare CD4 antikoruBiolegend116005klonu RM4-4; T hücresi transmigrasyonunun analizi için
için m , m hücresi hücresi ve B hücresi izolasyonu içiniçin Miltenyi Biotec T hücre izolasyonu içinsığır plazması izolasyonu içinMBMEC izolasyonu için salin (PBS) MBMEC kültür ortamı için25300-054%0.4 55 peptit ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23(2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022(2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5(2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766(2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
  40. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  41. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  43. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  44. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889(2015).
  45. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  46. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  47. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  48. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  49. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  50. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784(2012).
  51. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Transendotelyal Elektriksel DirenH cre Tabakas KapasitansPrimer Fare Beyin Mikrodamar Endotelyal H creleriAktive T H creleriKo k lt r AnaliziGer ek Zamanl Bariyer Fonksiyon De erlendirmesiOtoimm n MSS Bozukluklar

İlgili makaleler