Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

6.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54619

⸱

13 Eylül 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

Bu makalede

Özet

Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır.

Özet

Kan retina bariyeri ihlalini iyileştirebilecek potansiyel tedavileri değerlendirmek için düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir model sistem kurulmuştur. Enflamatuar bir faktör olan histaminin, kan damarlarının dışında IgG'nin pozitif boyanması yoluyla kültürlenmiş retinadaki damar bütünlüğünü tehlikeye attığı gösterilmiştir. Histaminin kendisinin ve lipoksin A4 gibi potansiyel tedaviler için aday ilaçların etkileri üç parametre kullanılarak değerlendirilir: IgG immün boyama yoluyla kan damarı sızıntısı, GFAP boyama yoluyla Müller hücrelerinin aktivasyonu ve MAP2 boyama yoluyla nöronal dendritlerde değişiklik. Ayrıca, retinanın katmanlı organizasyonu, genişlik ve süreklilikteki değişiklikler gibi Müller ve ganglion hücrelerinin süreçlerinin ayrıntılı bir analizine izin verir. Sunulan veriler domuz retina kültürü ile ilgili olsa da, sistem birden fazla türe uygulanabilir. Bu nedenle, model, bozulmuş retina damar bütünlüğünün farklı hücre tipleri üzerindeki erken etkilerini araştırmak ve ayrıca tedavi için potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlar.

Giriş

Artan miktarda kanıt vücut kan retina bariyerinin (BRB) 1-5 ve kan beyin bariyeri (KBB) 6,7 olan benzerliği varlığını destekler. BBB Uzlaşma sıkıca böyle deliryum 10 olarak nedensel ya da Alzheimer hastalığı (AH) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar tanısal belirteç olarak 8,9 ve akut koşulları ile bağlantılı olmuştur. potansiyel ilaç hedefleri için bu patolojilerin ve keşifler içine mekanistik anlayışlar genellikle beynin sınırlı erişilebilirlik ve ağ karışıklık tarafından engellenmektedir. Bu, in vivo görüntüleme 11, beyin Organotipik kültürü 12, birincil hücre kültürleri 13,14 ve ko-kültür sistemleri 15 gibi alternatifler oluşturulmuştur. Ancak bu modellerin çoğu hücreleri tanımlamak için özel araçlar, uzun deneysel dönemleri veya birden fazla belirteçler gerektirir. Fonksiyonel ve yapısal BBB ile BRB arasındaki benzerlikler yanı sıra dy arasında bir korelasyoniki sfunctions 16-19 iddia edilmiştir. Buna ek olarak, daha kolay erişim, iyi tanımlanmış hücre tipleri ve tabakalı yapı beyne bir pencere olarak iyi karakterize edilmiş retina izin vermiştir. BBB ve BRB yapısal ve işlevsel kimlikler detaylı karşılaştırılması gerekmektedir. Bununla birlikte, retina hastalıkları, özellikle de BRB ihlali da sıkı bir şekilde diyabet 18-19 ve AD 21,22 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesinin ile ilişkilendirilmiştir. Bu durumda, bir BRB disfonksiyon sistemi mekanizmasını tanımlamak için değil, aynı zamanda, potansiyel ilaç taranması için sadece kurmak ilgi çekicidir. Bu raporda, basit bir akut retinal kültürünü kullanarak bir protokol sağlayan BRB disfonksiyonu gelişti ve sunulmuştur.

Artmış BBB geçirgenliği ve AD-benzeri patolojik değişiklikler histamin, bir pro-inflamatuar arabulucu 12 ile inkübe bir beyin Organotipik kültürü kurulmuştur. Bu nedenle, sunulan sistemde, histamin İçi olduBRB disfonksiyonu ikna etmek için ex vivo retina kültürüne ied. Böyle Mus musculus ve Bos Boğa gibi çeşitli türlerden gelen retinaları, test edilmiştir. Nedeniyle ticari kullanılabilirliği ve insan dokusuna benzediği için, taze domuz gözbebekleri burada bildirilen veri sağlamak için kullanılmıştır. Histamin ve / veya diğer ilaçlar ile inkübe edildikten sonra, retinalar immünoglobülin G (IgG), kan ana bileşenden biri olarak bir kaç protein 12 için immün değerlendirme için işleme alınmıştır; Glial fibriller asidik protein (GFAP), glial aktivasyon için iyi bilinen bir işaretleyici; ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (MAP2), mikrotübül montaj için gerekli bir nörona özgü sitoskeletal proteini. Bundan başka, retinanın tabakalı yapı gibi genişliği ve süreklilik değişiklikler olarak Müller hücrelerinin ve gangliyon hücreleri proseslerinin ayrıntılı bir analizini sağlar. Böylece birkaç ek parametreler sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilirBRB ihlali erken bir aşamada ve aynı zamanda potansiyel tedavilerin ters etkilerini değerlendirmek için.

kan damarlarının sızıntı (KZ), glial hücrelerin aktivasyonu ve nöronal hücrelerin hasar tepki: Bu protokol, ekranlı ilaçların potansiyel ters etkileri üç açıdan değerlendirilir. Çeşitli ölçümü yöntemleri, örneğin, ifade seviyesi immün bir süreç ve bir donanım filtresi tarafından gösterilen nöronal süreçlerin sürekliliği genişliği ölçüm yoğunluğu ile gösterilen, kullanılmaktadır. Daha iyi yöntemi göstermek için ve sonuçları yorumlamaya yardımcı olmak için, Lipoksin A4 (LXA4), endojen inflamatuar hasarına yanıt ve endotel disfonksiyonu 23 hafifletici sentezlenen bir bileşik, gösteri amaçlı seçilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm protokoller geçerli nereye Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi politikalarına uygun yürütülmüştür.

1. Hazırlık

  1. % 75 ile sabitleme ortamı hazırlamak Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM),% 25 Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS). kullanılana kadar -20 ° C'de, iyi kısım ve mağaza karıştırın.
  2. Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlanması ve otoklavda sterilize edilir. Oda sıcaklığında çözüm saklayın. Deney (oyuk başına 5 mi) daha önce 37 ° C'ye kadar PBS ısıtın.
  3. % 10,% 20 ve PBS içinde% 30 sukroz hazırlayın. ayrı sterilizasyon için ayrı 0.22 mikron filtre üzerinden tüm çözümleri filtre. 4 ° C'de çözüm kaydedin.
  4. 90 mM'lik bir konsantrasyona kadar PBS içinde histamin stok çözelti hazırlayın. 0.22 uM filtre üzerinde filtre edilerek çözelti sterilize edin. Kısım ve -80 ° C'da, çözelti kaydedin. Birden fazla donma-ve-çözülme döngüleri kaçının.
  5. deneyden önce PBS içinde taze% 4 paraformaldehid (PFA) yapın. Buz üzerine yerleştirin.
    Dikkat: Davlumbaz PFA tutun ve uygun koruyucu ekipman giyin.
  6. stabilizasyon orta (retinanın başına 20 ml) çözülme. 100 U / ml bir son konsantrasyona kadar Penisilin-Streptomisin ekleyin. Deney öncesi bir inkübatörde 37 ° C'ye kadar ortam (retinanın başına 15 mi) sıcak bölümü. buz üzerinde orta kalanı bırakın.
  7. buz üzerinde HBSS (retinanın başına 10 ml) koyun.

2. Retina Organotipik Kültür

  1. Bir doku kültürü kaputu örnekleri aktarın. lensin etrafında keserek Göz yuvası açın. Bir fırça yardımıyla hafifçe retina üzerine çekerek olmadan vitreus mizah kaldırın. Yavaşça optik diski ortaya çıkarmak için bir fırça ile kesilmiş kenarından retina ayırın. optik bir ustura ile sinir ve retina serbest ağır.
  2. Petri kabı içine retina aktarın ve dikkatle soğuk HBSS kullanarak bir kez retina durulayın. i üzerinde HBSS örnek yerleştirince. Adım 2.1 ve bu adımı tekrarlayarak gerektiği kadar retina parçalara ayır.
  3. simetrik bir jilet ile ikiye retina kesti. Yavaşça sabitleme ortamının 3 ml 6 yuvalı bir plaka örnekleri transferi ile sabitleştirilir. % 5 CO2 içeren bir atmosfer ile bir inkübatör içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca dengede izin verin.
  4. Adım 2.3 de inkübasyon sırasında aşağıdaki reaktifler hazırlayın: sıcak ortamda istenen konsantrasyona (450 uM) histamin stok solüsyonu sulandırınız. 250 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar bir ortamda (argon altında saklanan) LXA4 çözülür.
    Not: LXA4 etkisini ölçerken, diğer yarısı LXA4 ile histamin kullanılır ise, tek bir retina yarısı tek başına histamin kullanılır.
  5. dikkatli bir şekilde sabitleme ortamı aspire ve her bir (oyuk başına 3 mi) hazırlanan orta ekleyin. % 5 CO2 içeren bir atmosfer ile bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  6. durulamabir zamanlar sıcak, steril PBS örnekler.

3. immün için Örnekleri hazırlayın

  1. plakalardan aspire PBS. % 4 PFA (oyuk başına 3 mi) ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
  2. Çabuk PFA aspire. bir zamanlar PBS kullanarak örnekleri durulayın. % 10 sakaroza örnekleri (oyuk başına 5 mi) aktarın ve 4 ° C'de 2 saat ila 4 inkübe edilir.
  3. % 30 sukroz (oyuk başına 5 mi) örnekleri aktarın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Çalışma donma orta yapmak için% 20 sukroz, iki parça ticari dondurma orta bir bölümünü karıştırın. kabarcıklar kaybolur hava kadar 4 ° C gecede veya daha uzun bırakın.
  4. Çalışma dondurma ortamı örnekleri aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika için dengeleme sağlar. dikdörtgenler içine her retina (5 mm kabaca 3 mm) Trim.
  5. Dikkatle silindirik bir kap (yaklaşık 1 cm çapında x 2 cm yükseklik) dev içerdiği çalışan dondurma ortama örnekleri aktarmakAlüminyum folyodan ised. retina dilimleri ve sıvı nitrojen içinde bunları dondurmak (Kesit üzerine retinanın bir kesitini sağlamaya yönelik) dik olduğundan emin olun. kullanılana kadar -80 ° C 'de bloklar kaydedin.
  6. Bölüm her 14 mikron kalınlığında dilimler halinde bir kriyostat blok ve cam slaytlar bölümleri monte edin. kullanılana kadar -80 ° C 'de slaytlar saklayın.

4. immün

  1. bir kez% 5 sakaroz fosfat tamponu (SPB, PBS içinde% 5 sukroz, pH 7.4) ile bölümleri yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 10 normal keçi serumu ve% 0.5 Triton X-100 ile% 5 SPB) blokaj tamponunda bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma yerlerini bloke.
  2. Uygun primer antikor ile (slaytlar üzerinde) bölümleri inkübe (1'de seyreltilmiş GFAP ya MAP2'nin: 500 bloklama tamponu içinde) 1 saat boyunca. çözüm aspire. % 5 SPB içinde üç kez yıkayın. endojen IgG boyama için, bu adımı atlayın.
  3. İlgili secon ile bölümleri inkübe1 saat: dary antikorlar (bloke edici tampon içinde 800 Cyanine3 / FITC konjüge edilmiş eşek anti-fare / anti-tavşan IgG, 1 seyreltilmiş).
  4. iyice% 5 SPB üç kez bölümleri yıkayın. orta montaj DAPI içeren ve lamelleri ile kaplama onları monte edilerek mikroskopi için örnekler hazırlayın.
  5. Gruplar arasında, vb kalma süresi, lazer yoğunluğu, kazanç değeri olarak aynı parametreleri altında 20X merceğinden bir lazer konfokal mikroskop, yakalama görüntüleri kullanma. 488/525 nm olarak 561/785 nm olarak (Cyanine3 algılamak için) kırmızı kanal için, 408/447 nm olarak (DAPI tespit etmek) ve yeşil kanal için (FITC algılamak için) mavi kanal için uyarma / emisyon dalga boylarını ayarlamak .

5. Görüntü Analizi

  1. Aşağıdaki kriterlere 12'ye göre sızdıran kan damarlarının yüzdesini ölçmek: sayısında bölümün düzlemi içinde endotel hücre çekirdekleri ile sadece kan damarları dahil; o ag gösterirse bir kan damarı sızan düşününkabı çevreleyen immün radient.
  2. ifade seviyesini belirlemek için, ilgi alanları seçmek ve görüntü analizi yazılımı kullanılarak ortalama gri değeri ölçmek.
  3. sürecin genişliğini ölçmek için, süreçler (örneğin dış çekirdek katmanı, onl) farklı olan bölümün bir alanı seçin. Sonra bu süreçler görünür ve sürekli olan bir optik alanı seçin. Mikroskobik ayarına göre ölçek çıtayı süreci boyunca bir çizgi çizin ve ölçümü yapmak.
  4. sürecin devamlılığını analiz etmek için, ilgi seçkin bölgeleri, komşuluk varyans ile her pikseli değiştirerek Görüntüdeki kenarları artırır varyans denilen filtre uygulamak, otomatik olarak, kontrast ve parlaklık ayarı satırları saymak tarafından sayımı normale Konum.
  5. İki kuyruklu Student t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlara hesaplayın. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. Plot Mean olarak sonuç SEM ±.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz histamin tarafından uyarılan BRB ihlal karşı koruyabilecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için düşük maliyetli, zaman verimli ve kolay kullanımlı bir sistem sunuyoruz. IgG kontrol retina (Şekil 1A) damarlar içinde kısıtlı, ancak modelin başarıyla kuruldu doğrulayan histamin maruz (Şekil 1B) üzerine kan damarlarının, dışarı sızdırıyor.

LXA4 sunulan sistemde BRB ihlal karşı ilaçlar için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, domuz retinası kullanılarak BRB disfonksiyonunun güçlü bir ex vivo akut retina modelini sunuyoruz. Bu model sistem özel aletler gerektirmez ve çoğu laboratuvar ortamına kolayca uyarlanabilir. Ancak başarılı bir sonuç elde etmek için birkaç adım yakından takip gerektirir. Gözbebekleri kaynağından alındıktan sonra 4 °C'de veya buz üzerinde tutulmalı ve mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir. Bir tedavinin etkisi analiz edilirken, aynı retinanın iki yarısı kullanılmalıdır - bir yarısı yalnızca deneysel ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bringhurst Meats (Berlin, NJ), domuz gözbebeklerini sağlamadaki gerçek yardımları için kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMYaşam Teknolojileri 11965-092
HBSSYaşam Teknolojileri 14170-112
SükrozJ.T.Baker4072-05
Histamin SigmaH7125-1G
Penisilin-Streptomisin Invitrogen
PFAElektron Mikroskobu Bilimleri15710
Donma Ortamı Üçgen Biyomedikal BilimlerTFM-5
Normal Keçi Serumu RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAP AntikoruMilliporeAB5804
MAP2 AntikoruEMD MilliporeMAB3418
FITC konjuge Eşek anti-tavşan IgG JacksonImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 konjuge Eşek anti-fare IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
Vector Laboratories, Inc.içeren montaj ortamıH-1200
Lazer Konfokal MikroskopNikonEclipse Ti mikroskobu
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri1.45s
, , , DAPI

Kaynaklar

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782(2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055(2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Histamin UygulamasLipoksin A4IgG mm nboyamaGFAP BoyamaMAP2 BoyamaKonfokal MikroskopiEx Vivo K lt rla Tarama
Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.