Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Transdüksiyon-transplantasyon, farelerde insan hematolojik malignitelerini modellemenin hızlı ve etkili bir yoludur. Bu teknik, hematopoetik hücrelerde ilgilenilen genin ekspresyonu ile sonuçlanır ve genin normal ve/veya malign hematopoezdeki rolünü incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, örnek olarak miyeloproliferatif neoplazmda (MPN) yakın zamanda tanımlanan kalretikülin (CALR) mutasyonları kullanılarak transdüksiyon transplantasyonunun nasıl yapılacağı hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu protokolde, 5-flurourasil (5-FU) ile tedavi edilen donör farelerden alınan tüm kemik iliği hücreleri, mutant CALR kodlayan bir retrovirüs ile transdüksiyona tabi tutulur ve ölümcül şekilde ışınlanmış sinjeneik konakçılara nakledilir. Mutant CALR eksprese eden donör hücreler yeşil floresan proteini (GFP) ile işaretlenir. Nakledilen fareler, periferik kanda yüksek trombositler, kemik iliğinde megakaryositlerin genişlemesi ve kemik iliği fibrozu dahil olmak üzere bir MPN fenotipi geliştirir. Retrovirüsün nasıl üretileceğine, viral titrenin nasıl hesaplanacağına, tüm kemik iliği hücrelerinin nasıl dönüştürüleceğine ve ışınlanmış alıcı farelere nasıl nakledileceğine dair adım adım bir açıklama sunuyoruz.
Giriş
İletimi transplantasyon farelerde hematolojik maligniteler modellemek için yararlı bir yöntemdir. Bu teknik geri BCR-ABL1 ektopik ifadesi sadakatle farelerde 1 kronik miyeloid lösemi özetlemek olabilir ilk gösteriye kadar uzanan miyeloid malignitelerini çalışmak için özellikle değerli olmuştur. Bu teknik daha sonra miyeloproliferatif neoplazmı (MPN) mutasyona uğramış JAK2 V617F ve MPL W515K / L yoğun çalışma kolaylaştırmıştır.
MPN olgun miyeloid hücreleri ve kemik iliği fibrozisi aşırı ile karakterize hematolojik kanserlerde bir grup. Bu hastalıklar, genel olarak, JAK2, MPL veya CALR ya somatik mutasyon ka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma onaylanmış ve California, Irvine Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Tüm işlemler izofluran anestezi altında yapılan ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır.
Ekotropik retrovirüs 1. Üretim
- ticari bir maksi-hazırlık kiti ve sezyum klorür arıtma kullanarak en az 1 ug / ml bir konsantrasyonda yüksek kaliteli plazmidler hazırlayın.
Not: Bu, bir MSCV omurgası (CALR 7,8 bu durumda) ilgili geni kodlayan vektör ve (vs GFP, Neo) seçim işaretleyici olarak ekotropik bir paketleme plazmiti kodlayan gag-pol-env içerir (d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
transdüksiyon Nakil tekniği hücreler, ilgilenilen geni eksprese eden alıcı farelerin hematopoietik sulandırma ile sonuçlanır. Şekil 1 MPN mutasyona uğramış kalretikulin transdüksiyon-transplantasyon fare modelinin bir özetini göstermektedir. Kısaca, CALRwt ya CALRdel52 eksprese retrovirüs bir C57B / 6 verici fare BM hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Transduced hücreler ilk ay sonrası nakli sırasında meydana ışınlanmış C57B / 6 alıcı fare ve donör hücre engraftme.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, hastalığın şoförü olarak CALRdel52 mutasyonu myelofibrotik doğru ilerledikçe bir esansiyel trombositemi gibi hastalık özetlemek için farelerde kemik iliği nakli nasıl gerçekleştirileceği ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. artan trombositler, megakaryositler genişlemesi ve kemik iliği fibrozis CALRdel52 sonuçlarını ifade eden hücrelerin başarılı nakli. Kemik iliği nakli çok aşamalı bir süreçtir gibi, teknik bir hata çıkar, hatta fare ölüm geni eksprese eden hücrelerin kötü engraftman önlemek için önlenebilir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma V Foundation Scholar (AGF) ve MPN Research Foundation (AGF) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre Hatları< / güçlü > | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T hücreleri | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 hücreleri | ATCC | CRL-1658 | |
| < güçlü >Plazmidler< / güçlü > | |||
| EcoPak, pCL-Eco | Addgene | 12371 | olarak da bilinirEcoPak plazmid ve standart 293T hücrelerinin yerine EcoPack 2-293 gibi retroviral paketleme hücre hatları kullanılabilir. Ek γ-retrovirüs zarfı ve ambalaj plazmitleri Addgene ve diğerlerinden temin edilebilir. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene | 20672 | Ek γ-retroviral transfer plazmitleri Addgene ve diğerlerinden temin edilebilir. | |
| Sarf Malzemeleri< / güçlü > | |||
| 27 G x 1/2 "iğneler | BD | 305620 | |
| Fetal sığır serumu | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penisilin / streptomisin / L-glutamin | Corning | MT-30-009-CI | |
| Tripsin-EDTA (% 0.05) | Corning | MT-25-052-CI | Ev yapımı |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm tabaklar | Fisher | 172931 | |
| 15 ml konik tüpler | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm tabaklar | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 &# 181; m hücreli süzgeçler | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml konik tüpler | Fisher | 12565270 | |
| 6 oyuklu plaka | Fisher | 130184 | |
| FACS tüpleri | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 & mu; m şırınga filtreleri | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK tamponu | Lonza | 10-548E | Ev yapımı olabilir |
| Rekombinant murin IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Rekombinant murin IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Rekombinant murin SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfeksiyon reaktifi |
| 1.5 ml santrifüj tüpleri | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Ekipman | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ışını ışınlayıcı |
Kaynaklar
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
