Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Özet

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Özet

Scramblases çift yönlü bir ATP-bağımsız bir şekilde membran çift-tabakanın fosfolipidleri transloke. İlk scramblase tespit ve biyokimyasal, fotoreseptör rodopsin apoproteini opsin edilmiştir doğrulanmış olması. Rodopsin ışık algılama sorumludur retina çubuk fotoreseptör membranlarının lokalize bir G-protein bağlı reseptördür. Rodopsin adlı scramblase faaliyeti onun ligandı 11- sis -retinal, yani bağlı değildir, apoprotein opsin da bir scramblase olarak aktiftir. karıştırıcı konstitütif ve regüle fosfolipid hücre fizyolojisinde önemli rol oynamakla birlikte, sadece bir kaç fosfolipid scramblases kadar opsin yanında tespit edilmiştir. Burada opsin en scramblase aktivitesinin bir floresans bazlı analiz tarif eder. Opsin fosfatidilkolin, fosfatidilgliserol ve flüoresan NBD-etiketli bilgisayar (1-p izi miktardan oluşan büyük tek katmanlı lipozomlar içine kuruluralmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) amino] heksanoil} - sn -glisero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitesi vezikül iç broşürde bulunan NBD-PC molekülleri floresans kimyasal membranını geçemediği için bir indirgeyici madde ile elimine edilir dış yaprakçık erişebilir ne ölçüde ölçülerek belirlenir. Bu tarif yöntemler genel olarak uygulanmaktadır ve diğer membran proteinleri scramblase aktivitelerini belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Giriş

Fotoreseptör rodopsin (referans ^1, örneğin gözden) bir prototip G protein-eşli reseptör, tanımlanacak ilk fosfolipid scramblase ve biyokimyasal olarak ^2,3 sunmaktadır. Scramblases transbilayer fosfolipid hareketin özünde yavaş oranını artırmak fosfolipid taşıyıcıları olan bir çift yönlü fizyolojik uygun seviyelere, ATP-bağımsız bir şekilde ^4-6. Eylemlerinin örnekleri endoplazmik retikulum ve konstitütif karıştırıcı olarak glikosilasyon yolakları ⁵ çeşitli zar homeostaz ve büyüme için gerekli olan bakteriyel sitoplazmik membranda bulunur. Bu gibi etki ettiği Ayarlı fosfolipid apoptotik hücrelerin yüzeyi üzerinde fosfatidilse....

Protokol

Lipozomlar ve Proteoliposomes hazırlanması 1.

1. Lipozom oluşumu
   1. Bir cam şırınga kullanılarak, POPC bir molar oranda 52.5 umol lipidler elde etmek için bir yuvarlak tabanlı şişeye kloroform (25 mg / ml) ve 160 ul POPG (kloroform içinde, 25 mg / ml) 1.435 ul POPC ekleyin: POPG = 9: 1 arasındadır.
   2. (Su banyosu çözücünün, bu hacim için gerekli olan) 145 rpm'lik bir dönme hızında bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca lipidleri Kuru, daha sonra oda sıcaklığında, gece boyunca en az 3 saat, ya da bir elektrikli desikatöre balona (RT).
   3. 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCI, 10 ml ile kurutuldu lipid filminin hidratlanması y....

Sonuçlar

Bir flüoresan bazlı analiz kullanarak scramblase aktivitesinin karakterize edilmesi için luvs halinde opsin tekrar oluşturulmasını tarif eder. Biz çabalıyorlar opsin aracılı fosfolipid oranı üzerinde bir alt sınır koymak için ve opsin işlevsel veziküller içine yeniden oluşturulmasını hangi oligomerik durumunu belirlemek için sonuçları analiz.

uygun sulandırma koşullarını belirlemek için, deneysel da proteinin sokulmasından açı.......

Tartışma

Scramblase etkinlik tahlili olduğu opsin fosfolipid scramblase aktivitesi ² bulunmaktadır belirlemek için ilk olarak sağladı. Tahlil da bize özgüllük test ederek opsin en scramblase etkinliğini karakterize izin (biz böyle Şekil 1A NBD-PC için gösterilen, ya da gibi bir asil zinciri üzerindeki NBD ile etiketlenmiş NBD-fosfatidiletanolamin olarak NBD etiketli muhabiri lipidlerin çeşitli kullanılan ana grup, NBD-sfingomiyelin veya NBD- fosfatidilserin ^2), vezikül lipit kompozisyonu (e.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin	Avanti Polar Lipidler	850457C	POPC
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-rak- (1-gliserol) (sodyum tuzu)	Avanti Polar Lipidler	840457C	POPG
1-palmitoil-2-{6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il)amino]heksanoil}-sn-glisero-3-fosfokolin	Avanti Polar Lipidler	810130C	NBD-PC
4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit	VWR Bilimsel	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodesil-β-D-maltosid	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Florimetre küvetleri	sigma	C0918-100EA	küvetler
Spektroflorometre	Foton Teknolojisi Uluslararası, Inc.	florimetre
Sodyum hidrosülfit teknik sınıf,% 85	Sigma	157953-5G	ditiyonit
GraphPad Prism 5 yazılımı			Prizma
Tris Tabanı	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml ekstruder ve nbsp;	Kuzey Lipitler, Inc.		Ekstruder
Whatman, Drenaj diski, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disk desteği
Whatman Nuclepore Paletle Kazınmış Membranlar, 0.4 & m, 25 mm çaplı	Sigma	WHA110607	400 nm membran
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranlar, 0.2 & m, 25 mm çaplı	Sigma	WHA110606	200 nm membran
sodyum fosfat	Sigma	S3264-500G
VWR Kültür Tüpleri, Tek Kullanımlık, Borosilikat Cam, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	cam tüpler
Perklorik asit	Sigma	30755-500ML
Amonyum Molibdat Tetrahidrat	Sigma	A-7302	amonyum molibdat
(+)- Sodyum L-askorbat	Sigma	A7631-25G	sodyum askorbat
Bio-Beads SM2 adsorbanları	Bio Rad	1523920	polistiren boncuklar
2.0 ml Mikrotüpler şeffaf	VWR Scientific	10011-742	Sulandırma tüpleri
Sulandırma cam tüp	VWR Scientific	53283-800	Sulandırma cam tüpleri
Zetasizer	Malvern		Dls