Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Fotoreseptör rodopsin (referans ^1, örneğin gözden) bir prototip G protein-eşli reseptör, tanımlanacak ilk fosfolipid scramblase ve biyokimyasal olarak ^2,3 sunmaktadır. Scramblases transbilayer fosfolipid hareketin özünde yavaş oranını artırmak fosfolipid taşıyıcıları olan bir çift yönlü fizyolojik uygun seviyelere, ATP-bağımsız bir şekilde ^4-6. Eylemlerinin örnekleri endoplazmik retikulum ve konstitütif karıştırıcı olarak glikosilasyon yolakları ⁵ çeşitli zar homeostaz ve büyüme için gerekli olan bakteriyel sitoplazmik membranda bulunur. Bu gibi etki ettiği Ayarlı fosfolipid apoptotik hücrelerin yüzeyi üzerinde fosfatidilserin (PS) ortaya çıkarmak için gerekli olan her karıştırma bir makrofaj ⁷ -Sinyal "me-yemeği" ve protein faktörü üretimini katalize aktive kan plateletleri üzerinde prokoagülan yüzey sağlarkan pıhtılaşması için gerekli s. Fotoreseptör disk membranlarda, rodopsin en çabalıyorlar faaliyeti ATP-bağımlı, tek yönlü lipid tarafından oluşturulan iki tabakalı iki zar broşürleri arasındaki fosfolipid dengesizliği ortadan kaldırmak için önerilen ABCA4 ^{4,8,9 10-12} Flippase edilmiştir.

Rodopsin plazma membranında PS maruz için gereken ^{2 +} -bağımlı scramblases (referans ^2, TMEM16 protein ailesinin üyeleri, Ca olarak tanımlanmıştır fotoreseptör diskleri bir scramblase olarak rapor kadar scramblases fizyolojik önemine rağmen, kimlik elde edilememiştir ¹³⁾ ve bir lipid II peptidoglikan sentezinin ¹⁴ için gerekli olan scramblase gibi bakteriyel protein FtsW önerilmiştir. Bu keşifler yöntem describ Oluşan proteoliposomes lipozomlarda saflaştırılmış proteinlerin yeniden oluşturulması ve scramblase etkinliğinin gösterilmesi dayanmaktadırBurada ed. Diğer potansiyel scramblases ^15-21 - peptidoglikan biyosentezinde rol MurJ ve Amj proteinleri, WzxE ve ilgili proteinler O-antijeni öncüleri karıştırıcı karışmış, MprF proteini, bakteriyel sitoplazma zarından olarak amino fosfatidilgliserol yerini değiştirmek için gerekli olan ve Xkr8 aile üyeleri önerilmiştir bu apoptotik hücre yüzeyi üzerinde PS maruz - biyokimyasal test edilmesi gerekmektedir. Bu tespit ve scramblase etkinliğini karakterize etmek sağlam bir testin önemini vurgulamaktadır.

Burada, bir floresans bazlı deney kullanılarak elde edilen proteoliposomes büyük tek tabakalı veziküller (luvs) saflaştırılmış opsin tekrar oluşturulmasını, fotoreseptör rodopsin apoprotein ve scramblase aktivitesi daha sonra analiz tarif eder. heterolog ifade ve opsin saflaştırılması için literatürde mevcut birkaç iyi tanımlanmış protokoller bu nedenle olmaz, vardırBu protokolde tarif; yaklaşık 100 ng FLAG etiketli, ısı ayarlı opsin verir Goren ve ark. ^3'te tarif protokollerini kullanan /% 0.1 ul (ağırlık / hacim) dodecylmaltoside (DCM).

Sulandırma şişmeyen fakat çözünmez olduğu için, yeterli deterjan ile luvs muamele edilmesiyle elde edilmektedir. Bu koşullar altında, bir membran proteini - protein deterjan miseller halinde temin - lipozomlar entegre ve proteoliposomes sonuçlanan deterjanın alınması üzerine lipozom zarı içine yeniden hale gelir. (% 0.1 (ağırlık / hacim) DCM içinde saflaştırılmış proteini olarak elde edilmiştir) opsin tekrar oluşturmak için, LUVler POPC (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin) ve POPG karışımı (1-hazırlanır palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3- [fosfo-rak- (1-gliserol)]) ve opsin ve NBD-PC eklemeden önce DDM ile doyuruldu. Deterjan daha sonra polistiren boncuklar ile örnek muamele etmek suretiyle uzaklaştırılır.

lass = "jove_content"> floresans bazlı analiz temel ilkesi Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Luvs simetrik NBD-PC veya diğer NBD etiketli floresan fosfolipid muhabiri (Şekil 1A) bir eser miktarı ile yeniden edilmektedir. ditionit ilave üzerinde NBD nitro grubu gibi bir zar geçirgenliği olmayan dianyon, luvs dış broşürde NBD-PC molekülleri işlenen floresan olmayan bir floresan olmayan amino grubuna indirgenir. de NBD-PC molekülleri de ditiyonit deneyi (<10 dakika), zaman ölçeğinde membran hareket mümkün olduğundan, bu floresan sinyalin% 50 azalma ile sonuçlanır. Lipozomlar, bir scramblase ile yeniden Ancak, eğer, iç yaprakçıkta NBD-PC moleküller azaltılır dış hızla karıştırmak olabilir. Bu ideal bir durumda (Şekil 1C) floresans toplam kayıp ile sonuçlanır.

ES / ftp_upload / 54.635 / 54635fig1.jpg "/>
. Şekil 1: scramblase aktivite deneyinin şematik temsili tahlil, bir flüoresan NBD-etiketli raportör lipid kullanır; NBD-PC gösterilmiştir (A). Büyük tek tabakalı veziküller NBD-PC'nin eser miktarı ile tekrar kurulmuştur. Sulandırma dış ve iç broşürlerde eşit olarak dağıtılır NBD-PC ile, simetrik veziküller üretir. Ditiyonit _(S2 O ₄ ^2-) kimyasal olmayan bir floresan amino grubuna NBD nitro grubunu azaltır. Ditiyonit (B, yukarıda) ile birlikte protein içermeyen lipozomlar tedavisi azaltılır, dış sayfada tek NBD-PC moleküllerinin floresan bir% 50 azalmaya neden olan: ditiyonit negatif yüklü ve NBD-PC molekülleri ile tepkimeye zarı geçemez iç broşürde. Opsin içeren proteoliposomes (B, alt), bir ditiyonit tedavi, yani scramblase aktif proteoliposomes, f% 100 kaybına yol açaropsin olarak luorescence iç ve dış broşürde arasında NBD-PC hareketini kolaylaştırır. (C) ditionit ile protein içermeyen lipozomlar ve opsin içeren proteoliposomes tedavi elde edilen idealize floresan izlerini gösterir. floresans kaybı oranı ditionit ile NBD kimyasal indirgeme karıştırıcı kimyasal tepkime oranından daha büyük veya eşit bir hızda gerçekleşir, ve bu oran-sınırlayıcı olduğunu gösteren her iki durumda da aynıdır. Gerçek bir deneyde elde edilen izleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu tarif yöntemleri diğer saflaştırılmış proteinleri, hem de deterjan ²² mikrozomları ekstre, örneğin, elde edilen zar proteinlerinin karışımlarını sulandırmak ve analiz etmek için kullanılabilir.

Lipozomlar ve Proteoliposomes hazırlanması 1.

1. Lipozom oluşumu
   1. Bir cam şırınga kullanılarak, POPC bir molar oranda 52.5 umol lipidler elde etmek için bir yuvarlak tabanlı şişeye kloroform (25 mg / ml) ve 160 ul POPG (kloroform içinde, 25 mg / ml) 1.435 ul POPC ekleyin: POPG = 9: 1 arasındadır.
   2. (Su banyosu çözücünün, bu hacim için gerekli olan) 145 rpm'lik bir dönme hızında bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca lipidleri Kuru, daha sonra oda sıcaklığında, gece boyunca en az 3 saat, ya da bir elektrikli desikatöre balona (RT).
   3. 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCI, 10 ml ile kurutuldu lipid filminin hidratlanması yavaşça homojen, bulanık bir süspansiyon elde edilene değin balon dönen tarafından (bundan sonra tampon A olarak ifade edilecektir);
      NOT: Bu aşamada lipid konsantrasyonu hiçbir kayıp bugüne kadar meydana gelmiş gerektiği gibi 5.25 mM olması bekleniyor.
   4. Bir frekans O, oda sıcaklığında 10 dakika için bir su banyosu içinde süspansiyon sonikasyonf 40 kHz. Çözelti biraz daha net görünecektir.
   5. Bir ekstrüder kullanılarak 200 nm gözenek boyutuna sahip bir zar boyunca 4 geçiş ekstruderden bir ikinci döngü ve ardından 400 nm gözenek büyüklüğü olan bir membrandan süspansiyon 10 kez geçer.
      NOT: Elde edilen luvs ortalama çapı ~ 175 nm. Gerekirse, luvs büyüklüğü ve homojenliği, üreticinin talimatlarına uygun olarak dinamik ışık dağılımı ile kontrol edilebilir.
   6. Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi) LUV süspansiyonun fosfolipid konsantrasyonu ölçmek.
      NOT: ekstrüzyon sırasında kayıpların, konsantrasyon genelde yaklaşık 3.6 mM olduğu için.
   7. Hemen kullanılmadığı takdirde, yaklaşık 2 hafta boyunca 4 ° C'de luvs saklayın.
2. fosfolipid Niceleme
   Not: fosfolipid Sulandırma için kullanılan LUV süspansiyon konsantrasyonu, hem de en sonunda üretilen proteoliposomes olduğu gibi belirlemek için, numunenin bir alikotu subje olanperklorik asit ile oksidasyonu cted. Bu prosedür daha sonra aykırı ²³ ile karşılaştırıldığında kolorimetrik deneyi ile ölçülür, inorganik fosfat serbest bırakmak için fosfolipidleri parçalar.
   1. Iyonu giderilmiş damıtma suyu içinde sodyum fosfat, 40 mM stok çözeltisi (Na ₂ HPO ₄₎ hazırlanması.
   2. 4 mM ve kalibrasyon standartları olarak görev yapacak çözümler çalışan 0.4 mM elde etmek için deiyonize distile su ile stok solüsyonu sulandırmak.
   3. Çalışma çözüm kullanılarak, 0 ila 50 ul'lik nihai bir hacimde 80 nmol sodyum fosfat kadar 13 x 100 mm ² cam tüplerde standartlar hazırlandı.
   4. LUV ve proteoliposome numunelerin her sayısal olarak 10 ul alın ve 13 x 100 mm ² cam tüplerde GKD ₂ O 40 ul seyreltin.
      Not: luvs ve proteoliposomes lipid konsantrasyon aralığında olduğu 2.5-5 uM, örnek 10 ul 25-50 nmol yağ fosfor içermelidir.
   5. bir ısıtma bloğu içinde 145 ° C de 1 saat süre ile standart ve numuneleri ve ısı her 300 ul perklorik asit ekleyin. buharlaşmasını önlemek için tüplerde mermerleri koyun.
   6. Tüpler oda sıcaklığında soğumaya bırakılmıştır ve GKD ₂ O 1 ml ekle
   7. Yeni hazırlanmış 12 g / L amonyum molibdat ve 50 g / L sodyum askorbat ve vorteks her karıştırmak için 400 ul ekle.
   8. tüpler üzerine mermer ile 100 ° C 'de 10 dakika süre ile ısı. ısıtma bloğu tüpleri çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
   9. 797 nm'lik bir dalga boyunda bir spektrometre ile boş (0 nmol sodyum fosfat ihtiva eden standart bir örnek) karşı örneklerin absorbansı ölçülür.
   10. Kalibrasyon standart bir eğriye karşı örneklerin fosfat içeriğini belirlemek.
3. Opsin şifreden
   Not: deterjan doğasına bağlı, hem de yeniden oluşturma için en uygun şişme koşulların belirlenmesi için gerekli olanLuvs lipit bileşimi ve konsantrasyonu. Luvs süreci şişme kendi ışık saçılması özelliklerini değiştirmek olarak Rigaud ve Levy ²⁴ ve Geertsma ve ark., ²⁵ tarafından gözden absorbansı (Şekil 2) ölçerek izlenebilir.
   1. Pipet luvs 800 ul (bölüm 1.1, ekstrüzyondan sonra lipit geri kazanımı% 70 olarak, luvs beklenen konsantrasyonu 3.6 mM fosfolipiddir) 2 ml mikrofüj tüpüne.
   2. DCM tampon A içinde çözülmüştür (w / v) Tampon A 5.3 ul% 10 34.7 ul ekle
   3. sonu aşırı uç karıştırma ile, oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edilir.
   4. Bu arada polistiren taneler hazırlamak:
      1. örnek başına boncuk 400 mg kullanın ve bir cam beher tartılır.
      2. su ile, metanol ile iki kez, üç kez yıkayın ve bir kez tampon A ile her bir yıkama adımı kullanım için 5 ml sıvı, 10 dakika boyunca yavaşça karıştırın.
         NOT: polistiren hazırlamak için tavsiye edilirörneğin aynı anda birden fazla numune için boncuklardan 6 g tartın ve sıvının 75 ml ile yıkanır. Aşırı boncuklar birkaç gün boyunca buzdolabında saklanır.
   5. Numune başına, 0.4 mol% sonuçta NBD-PC 9.5 ul (1 mg / kloroform içinde mi,: vezikül destabilizasyonu son 30 dakika boyunca bir vida kapaklı bir cam tüp içinde NBD-etiketli fosfolipid ( 'sulandırma cam tüp') kuru Toplam fosfolipid) bir cam tüp içinde bir azot akımı altında kurutulur ve daha sonra,% 0.1, 45 ul (tampon a içinde ağırlık / hacim) DDM içinde çözüldü
   6. Vezikül destabilizasyonu 3 saat 1 ml nihai hacim% 0.36 içeren bir örneğin çözündürüldü-NBD-etiketli fosfolipid DCM çözülmüş protein ekleyin ve tamponlar (a / h), yani, 7 mM, DCM.
      1. Bu nedenle, (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) NBD-PC'nin 45 ul,% 0.1 DDM 60 ul tampon A 55 ul (bir kontrol numunesi olarak kullanılan) proteinsiz lipozomları üretmek için; proteoliposomes için Sınava eklemekple,% 0.1 DDM (~ 110 ng / | il tipik bir stok çözeltiden), proteinin 40 ul, NBD-PC'nin 45 ul,% 0.1 DDM 20 ul ve tampon 55 ul (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) .
         NOT: Ayrıca sırası olarak listelenmiş olmalıdır.
   7. Oda sıcaklığında sonuna göre ek bir saat sonu için örnek karıştırın.
   8. Hazırlanan polistiren boncuklar 80 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında 1 saat karıştırılarak, örnek inkübe edin.
   9. Sonraki polistiren boncuklar ilave 160 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında ilave bir 2 saat boyunca karıştırılarak inkübe edilir.
   10. Taze polistiren boncuklar 160 mg ihtiva eden bir cam vida kapaklı tüp örnek (arkasına harcanan polistiren boncuklar bırakarak) aktarın ve 4 ° C'de bir gece karıştırılır.
       NOT: örnek aktarmak ve boncuk emme kadar önlemenin en kolay yolu biraz pozitif basınç ile cam tüpün dibine itilir Pasteur pipeti kullanmaktır. pipet ucu sıkıca bir kezTüpün alt, daha sonra örnek bir boncuk müdahalesi olmaksızın kolayca çekilebilir.
   11. Ertesi sabah, scramblase aktivite deneyi için hazırlık olarak buz üzerinde boncuklar ve yeri üzerinde taşıyan olmayan bir mikrofüj tüpüne örnek aktarmak.

2. Scramblase Aktivite Deneyi

Not: tampon A ile seyreltilmiştir lipozomlar veya proteoliposomes floresans yoğunluğu bir floresan spektrometresinde ditionit ilave edildikten sonra zaman içinde izlenir. istikrarlı başlangıç ​​yoğunluğu elde etmek için, floresans sürekli karıştırılan örnek ditionit ilave edilmeden önce en az 50 saniye (ya da sabit bir sinyal elde edilene kadar) için kaydedilir ve daha sonra ditionit ilave sonra en az 500 saniye boyunca takip edilir.

1. mini karıştırma-bar içeren plastik küvete tampon A 1950 ul ekleyin.
2. (Lipozomlar) hazırlanan Proteo 50 ul ekleyin ve örnek floresan spektrfotometrik dengeye izinBirkaç saniye sabit karıştırma ile ölçer.
3. Bu arada, 0.5 M tamponlanmamış Tris (iki numune mikrofüj tüpüne ditiyonit 20 mg tartılır ve 114 içinde çözülür örneğin; 1 M ditionit ihtiva eden bir çözelti hazırlamak ul buz soğukluğunda doğrudan kullanımdan önce ve sonraki için buz üzerinde tutulur, 0.5 M Tris örnek).
   Not: ditionit solüsyonu taze hazırlanmış olması ve hazırlandıktan sonra fazla 20 dakika kullanılmamalıdır; Birçok ölçümleri yapılacak olduğunda, ditiyonit alikotları önceden tartıldı ve hemen kullanım öncesi eritilebilir.
4. floresan izleme başlatın (uyarma 470 nm, emisyon 530 nm, genişliği 0.5 nm yarık).
5. kayıt floresan (mümkünse küvet odasının kapağındaki septum kullanın) başladıktan sonra küvet 50 sn 1 M ditiyonit çözeltisi 40 ul ekleyin ve bir daha 400-600 saniye floresan kaydetmeye devam ediyor.
6. Bölüm 3'te tarif edildiği gibi analiz edin.

3..Veri analizi

1. Scrambling kinetiği
   1. Başlangıç ​​floresans tanımlayarak scramblase aktivite deneyi ile elde edilen her bir numune floresans izleme karakterize, K _i ditiyonit ekleme ve son-nokta floresan, K, ulaştığı öncesinde> 400 saniye sonra. F _öncesinde ditiyonit ilavesinden 30 saniye süre ile floresans ortalama değer olarak, her bir örnek için tespit edildi.
   2. Floresan azalma ölçüde, R = 100 karşılık gelen uç nokta veri belirleme • F / F _i. Biz opsin içeren proteoliposomes için protein içermeyen lipozomlar ve R _P terimleri R _L kullanın.
2. Fonksiyonel Yeniden yapılandırılmış Scramblase molekül ağırlıklarının belirlenmesi
   1. aşağıdaki denkleme göre flüoresans indirgeme veri dönüştürme:
      p (≥1 scramblase) = (R _P - R _L) / (R _max - R _L) (Denklem 1)
      NOTR _max yeterli protein örnekteki tüm veziküller en az bir işlevsel scramblase sahip olacak şekilde yeniden zaman elde edilen maksimum azalma ve p sulandırılmış bir numune içindeki özel bir vezikül 'scramblase aktif' olduğu olasılığı olduğu durumda, örneğin, en az bir işlevsel scramblase sahiptir. R _max yerine beklenen% 100 (deneysel> 1 mg / mmol PPR ile opsin proteoliposomes için tespit edilebilir R _max) ve tipik% 82.5 ³ ise R _L değeri tipik olarak 45% ^3. R _max olarak <% 100 veziküllerin bir alt popülasyonunun sulandırma dirençli olduğu varsayılmıştır. R _max =% 82.5 için, protein kabul edemiyor veziküllerin kesir 0.35 olduğunu.
   2. aşağıdaki gibi Poisson istatistiklerine göre p (≥1 scramblase) ve PPR (mg protein / mmol fosfolipid) arasındaki ilişkiyi açıklar:
      e - p (≥1 scramblase) 1 = Not: Burada mg protein / mmol fosfolipid birimlerinde vezikül ve α = mono- üstel uygun sabit ortalama scramblases M = sayısı.
   3. veziküllerin bir kısmını (tartışma) bile yüksek ppr çabalıyorlar katkıda bulunmaz olarak, denklem için değiştirin:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Denklem 3)
      NOT: Burada f, bu durumda, PPR * = PPR / 0.65 (Denklem 4) içinde, veziküllerin refrakter nüfusu veya PPR * = PPR / (1- f).
      Not: uygun sabit bir α, bir mono- üstel fonksiyon PPR * karşı p (≥1 scramblase) 'in bir grafiğini uydurma ile belirlenir. Opsin (moleküler ağırlığı 41.7 kDa) işlevsel 175-nm çaplı veziküller içine yeniden oluşturulmasını Eğer bir monomer olarak, α = 0.187 mg mmol ^-1 (her vezikül 280.000 fosfolipid ²⁶ vardır). Opsin dimerleşir Eğer önceden α sonra, scramblase aktif veziküller vermek üzere ³ sulandırma için= 0.37 mg mmol ^-1. PPR yerine PPR * analizi için kullanılacak olsaydı, o zaman gelen α değerleri 0.122 ve 0.244 mg mmol ^-1 olacaktır. a bu tahmin değerleri tüm opsin molekülleri fonksiyonel yetkili olduğunu varsayıyorum. moleküllerin yalnızca bir kısmını lipidler karıştırmak için yetkili ise, o a karşılık gelen değerleri daha büyük olacaktır.

Bir flüoresan bazlı analiz kullanarak scramblase aktivitesinin karakterize edilmesi için luvs halinde opsin tekrar oluşturulmasını tarif eder. Biz çabalıyorlar opsin aracılı fosfolipid oranı üzerinde bir alt sınır koymak için ve opsin işlevsel veziküller içine yeniden oluşturulmasını hangi oligomerik durumunu belirlemek için sonuçları analiz.

uygun sulandırma koşullarını belirlemek için, deneysel da proteinin sokulmasından açık olacak şekilde luvs şişirmek için kullanılmalıdır deterjan miktarını belirlemek gereklidir. Böyle bir deney, Şekil 2A'da gösterilmiştir. POPC alikotları: POPG LUVler 3 saat DDM farklı miktarları ile tedavi edilir ve numunenin absorbansı 540 nm, dolayısıyla vesikül boyutta bir bulanıklık ölçümü ve ölçülür. 540 nm (OD 540) grafik ölçülen optik yoğunluk veziküller DDM concentr olarak şişer olduğunu gösterirasyon 4-6 mM'den artar, DCM yükseltilirken (bulanıklık kaybına ve OD 540 sinyale karşılık gelen) çözündürülmesi için başlamadan önce yaklaşık 7 mM bir doyma noktasına ulaşabilir. NBD-PC deterjan tedaviden sonra ilave edildi ve numuneler daha deterjanı çıkarmak için polistiren boncuklar ile muamele edilmeden önce bir saat boyunca inkübe edilir. (Yukarıda anlatıldığı gibi) NBD-PC'nin transbilayer dağılımı veziküllere ditionit ilave edildikten sonra flöresan kaybı ölçülerek belirlenir. Bu nedenle, NBD-PC ditiyonit için komple erişilebilirlik ile gösterilen deterjan yokluğunda, veziküller dış sayfada içine yerleştirir. > 2 mM DDM ile muamele veziküller NBD-PC DCM çıkartıldıktan sonra bu NBD-PC'nin 50% ditiyonit korunur, böylece her iki broşür içine simetrik olarak dağıtmak edebilmektedir.

Şekil 2B referans 2 yeniden çizilmesi benzer istikrarsızlık-sulandırma deney (gösterir </ Sup>), opsin tekrar oluşturulmasını takip bu sefer. Bu deneyde, 7 mM DCM erişilebilir NBD-PC niceliksel hale gelir (>% 80) bu tür opsin aracılı sinyal karıştırıcı sonucu ditiyonit için opsin sulandırma için gerekli olduğu görülmektedir.

Şekil 2:. Deterjan destabilize vezikülleri içine NBD-PC ve opsin yeniden oluşturulması (A) veziküllerin alikoları, oda sıcaklığında 3 saat boyunca sonu aşırı uç karıştırılarak deterjan konsantrasyonları (0-9 mM) bir dizi ile muamele edilir . 540 nm'de numunelerin absorbans ölçülür inkübasyon süresi (siyah çizgi) sonunda. (DDM a / h% 0.1 içinde çözülmüş) NBD-PC ilave edilir ve deterjan polistiren taneleri işlenerek çıkartılır önce örnek oda sıcaklığında 1 saat daha inkübe edilir. Elde edilen lipozomlar, flor ile analiz edilir escent azaltma deneyi (kırmızı çizgi) NBD-PC simetrik yeniden edildiği kapsamını belirlemek için. (A) 'daki gibi, (B), fakat yumurta fosfolipidlerinin oluşturulan bu deney veziküllerinde a sonuçlanan DDM ile destabilize edildi ve opsin NBD-PC ile birlikte ilave edildi (yumurta PC / yumurta fosfatidik asit, 9, 1 mol / mol), yaklaşık% 80 floresans azaltılması proteini bu tekrar oluşturulmuş ve NBD-PC'nin sinyal karıştırıcı kolaylaştırmak mümkün sonra (referans 2 değiştirilmiş). NBD-PC simetrik 2 mM DDM de yeniden rağmen, opsin yeniden oluşturulması için ideal koşullar OD 540 absorbans, yani gösterilen veziküllerin nedeniyle interkalar deterjan oldukça şişmiş ama henüz çözülmüş değil noktasının (zirve etrafında seçildi ok). POPC / POPG (9: 1 mol / mol) için veziküller, 8 mM bir DCM konsantrasyonu NBD-PC ve opsin sulandırma hem de uygun olduğu tespit edilmiştir./54635/54635fig2large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Floresan azalmanın büyüklüğü Sulandırma için kullanılan opsin miktarı artar. Şekil 3A (mmol fosfolipid başına mg protein, kırmızı izleri biriminde PPR) fosfolipid oranları farklı protein de opsin ile yeniden protein içermeyen lipozomlar (siyah iz) ve proteoliposomes-NBD-PC içeren için ditiyonit ekleyerek elde edilen floresan izlerini gösterir; hepsi daha kolay görselleştirme için aynı başlangıç ​​floresans (F i) bir değere sahip olduğunu, böylece izleri normalize edilmiştir. izleri monoexponential uyan 20-25 sn arasında değişen çok benzer zaman sabitleri göstermektedir; proteinsiz lipozomlar içinde ditiyonit aracılı NBD-PC azalma oranı proteoliposomes aynıdır olarak, (tex bakınız opsin aracılı sinyal karıştırıcı hızı üzerinde daha düşük bir tahmin yerleştirmek mümkündürDaha fazla bilgi için t). Şekil 3B * flüoresan azalması deneyden elde edilen analiz verileri p (≥1) scramblase (en az bir scramblase sahip olan bir vesikül olasılığı) deneysel olarak ölçülmüş PPR karşı (PPR ilişkin araziler vermek üzere gösterir gibi), yukarıda açıklanan. opsin tekabül varsayımsal uyan deneysel sonuçların monoexponential uyum karşılaştırması opsin bir dimer olarak işlevsel yeniden oluşturulmasını bir monomer, dimer ya da tetramerdir gösterisi olarak yeniden edilir.

Şekil 3:. Opsin arasında Scramblase aktivitesi ug 0-4,95 arasında değişen NBD-PC ve opsin miktarları ile yeniden vesiküllerin tedavi ditiyonit tekabül eden (A) Floresans izleri, kama ile gösterilir. yeniden opsin en düşük miktarı 0.21 mg / mmol'lük bir PPR, tekabülİkinci 0.43 mg / mmol en yüksek miktarı ve 1.3 mg / mmol, ya da ortalama vezikül başına 10 opsins en yüksek miktar. Ditionit belirtilen zaman (ok) ilave edildi ve NBD floresans bir başka 400 saniye izlenmiştir. Birçok deney içinde ortalama% 82.5 iken bu deneyde görülen floresan azalma azami ölçüde% 85 idi. Çabalıyorlar (B) Protein bağımlılık. Panel A benzer deneylerden edinilen veriler (protein, tekrar- nicelleştirilmiştir veziküller fosfolipid oranı (PPR) protein karşı en az bir scramblase (s ≥1 scramblase) 'e sahip veziküller olasılık bir grafik oluşturmak için Poisson istatistiklerine kullanılarak analiz edildi Batı benek analizi 3 ve fosfolipid ile tekrar asit hidrolizi üzerine salınan inorganik fosfat) ölçülmesi ile belirlendi. kırmızı çizgi verileri için bir mono-üstel bir yerleşmeyi temsil etmektedir; kesik gri çizgiler 170 nm çaplı v içine opsin sulandırılması için mono-üstel uyuyor temsilmonomerlerin önceden oluşturulmuş dimer ya da önceden oluşturulmuş tetramerler olarak esicles. X ekseni deneysel ölçülen PPR temsil gibi, uygun sabitler yerine PPR * değerlerden daha, ana metinde açıklandığı gibi. PPR uygun (yerine PPR * den () ana metne bakın) daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız bu figür.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.