Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

29.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54640

⸱

21 Ekim 2016

 ,  , 
1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

Bu makalede

Özet

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Özet

Protein-protein etkileşimi, bir canlı organizmanın işlevinde önemli bir rol oynamaktadır. bir etkileşim tespit ve doğrulandıktan sonra yapısal ve mekanik düzeyde bunu karakterize etmek gereklidir. Çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemler bu amaçla mevcut. Bir fluoroforla işaretlenmiş proteinin floresans yoğunluğu, protein-protein etkileşimi üzerine sabit kaldığı durumlarda Bunlar arasında floresan anizotropi, özellikle kullanılan güçlü bir tekniktir. Bu teknikte, bir florofor ile işaretlenmiş proteinin seçici gelen ışın ile göreceli yönelimine göre florofor bir alt kümesi uyaran bir uygun dalga boyunda dikey olarak kutuplanmış ışık eksite edilir. Ortaya çıkan emisyon ayrıca, dikey ve yatay düzlemlerde ilişki anizotropi (r) tanımlayan bir yönü vardır: r (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), ben VV ve ben = nerede

Giriş

Hücreler sürekli birbirleri ile etkileşim biomacromolecules çok sayıda içerir. Bu ilişki, sinyal iletimi, gen ifadesi ve diğerleri arasında, hücre göçünün düzenlenmesinde işleyişi sorumlu hücre yoluna katılabilir kompleksleri yol açar. bir hücrede meydana gelen tüm protein-protein etkileşimleri interaktom bilinen bir ağ ihtiva eder. Saccharomyces cerevisiae'de de proteinlerin% 70'den fazla etkileşim ortakları 1 sahip olduğu gösterilmiştir. Bir hücrenin interaktom anlamak ve fonksiyonları karmaşıklığı ve canlıların çeşitliliği ilgili bilgileri sağlar. Çeşitli metodolojiler, protein-protein etkileşimlerini belirlemek ve tanımlamak için tarif edilmiştir. Bu tür maya iki-hibrid 2, protein fragmanı tamamlama deneyleri 3, kütle spektrometrisi ve protein microarra bağlanmış afinite saflaştırma 4 olarak koyun yöntemlerle yüksek Farklıys bir etkileşim 5,6 tanımlamak için kullanılır. tespit kez, bunu doğrulamak için gerekli olan ve bu bir vaka ile ayrı ayrı değişebilir. Tipik haliyle, bu deneyler, gen silinmesi veya proteinlerin bir aşırı ifadesi ile etkileşim çifti, örneğin, tek tek üyelerin seviyesinde, etkileşim kendisini kesintiye içerir, ve daha sonra diğer üyesinin özelliklerindeki değişiklik ya da işlev için ideal hücresel düzeyde. Daha sonra, biyo-fiziksel teknikler 7 moleküler düzeyde protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için kullanılır. kalorimetri ve floresan spektroskopi nicelik ve mekanik olarak bunları tarif etmek için kullanılır ise, bu amaca yönelik olarak, protein kompleksleri yapısı X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans ve kriyo-elektron mikroskobu ile tespit edilir.

Bu çalışmada, floresan anizotropi GTPaz EFL1 ve SBD arasındaki etkileşimi karakterize etmek için bir teknik olarak kullanılanS proteini. Bu proteinler, 60S ribozomal alt birim 8 yüzeyinden ökaryotik başlatma faktörünün 6 salınmasını teşvik ederek ribozomların sentezine katılmadığını. SBDS proteini EFL1 guanosin difosfata 10,11 için afiniteye azaltılması için bir guanin nükleotid değişim faktörü olarak Shwachman-Diamond sendromu, 9 ve hareket olarak bilinen bir hastalık mutasyona uğrar. SBD'ler Hastalık mutasyonlar EFL1 ile etkileşimi ortadan kaldırmak ve böylece aktivasyonunu engeller.

Floresans anisotropi yaygın protein peptid veya protein, nükleik asit etkileşimleri incelemek için biyolojik uygulamalarda kullanılır. Bir fluorofor kısmen polarize emisyon polarize ışık sonuçları ile heyecanlı olduğu ilkesine dayanmaktadır. Floresans anisotropi Denklem 1 ile tanımlanır:

figure-introduction-1

Ben VV ve VH nerededikey 12 ışık polarize ile örnek heyecanlı olduğunda dikey olarak (VV) ve yatay (VH) floresan yoğunlukları emisyonu polarize. Floresans anisotropi fluorofor dönme difüzyon hızını etkileyen faktörlere karşı duyarlıdır ve bu nedenle sıcaklık, çözelti viskozitesi ve fluorofor görünür molekül büyüklüğüne bağlıdır. başka protein ve böyle bir değişiklik ile etkileşime girdiğinde bir florofor artar içeren bir proteinin bariz boyutu daha sonra anizotropide bir değişiklik olarak değerlendirilebilir. Daha spesifik olarak, kendi floresan ömrü çözüm göreceli yavaş dönen bir fluorofor nispeten büyük bir anizotropi sergileyecek bu nedenle büyük bir ben VV değeri ve küçük ben VH değerine sahip olacak ve. Onların floresan ömrü hızla göreceli takla fluorophores için, VV ve VH benzer olacaktır ve bunların anizotropi değeri küçük olacaktır 12 (Şekil 1). Buna ek olarak, gürültü ölçümü için iyi bir anizotropi sinyali için, ilgili molekülün dönme korelasyon zaman benzer bir floresan ömrü olan bir flüorofor olması gereklidir. Aksi takdirde, doğru bir kompleks serbest protein arasında ve anizotropi farkı kayıt yapmak mümkün değildir. Örneğin, 100 da düşük molekül ağırlıklı bir bileşiğin bağlanmış örneğin flöresin ve rodamin edildiği gibi 4 nsaniye yakın bir ömür süresi olan bir flüoresan probun anizotropi 0.05. kDa 0.29 olan anizotropi değerini artırır 160 bir moleküle bağlanması; doğru ölçülebilir bir fark. Bunun aksine, olan bir artış, moleküler boyut olarak değişmektedir 65 1.000 kDa bir bağlama reaksiyonda yer kişi aynı flüoresan prob sadece doğru bir şekilde ölçülmesi için çok küçük olan 0,3 0.28 bir anisotropi değişikliği ile sonuçlanacaktır. Bu senaryoda, 400 nsaniye bir ömür boyu bir prob 12 daha uygun olacaktır.

figure-introduction-2
Floresan anizotropi ve prosedürü ölçmek için kullanılan ekipmanın 1. şematik gösterimi Şekil. Bir protein-protein etkileşim deneyi ölçüm floresan anizotropi gerçekleştirmek için kullanılan ekipman şematik gösterimi. Bir etkileşim ortağı bağlanması üzerine artar hızlı ekran küçük anizotropi takla flüoroforlan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Floresan uygulamaları ele moleküllerin herhangi bir fluorofor varlığını gerektirir. florofor üç türü vardır, protein-protein etkileşimleri incelemek için: 1) proteinleri içinde mevcut triptofan kalıntısı, 2), yeşil flüoresan protein (GFP) ve deriva gibi kimyasal bağlanmış fluorophores ve 3) flüoresan füzyon partnerleritives. Çoğu protein, yapısı bir etkileşimi ölçmek için en kolay yol, ilgili floresans spektrumları değişiklikleri izleyerek veya triptofan artıklarının floresan yoğunluğu değişiklikleri izleyerek, triptofanı kalıntılarına sahip olacak şekilde. Bununla birlikte, triptofan artıklarının analizi karmaşıklaştıran iki protein içinde mevcut olabilir. Bir fluorofor nedeniyle bir etkileşim onun floresan özelliklerini değiştirmek için Öte yandan, bu ya da bağlanma yeri yakınında bulunan gerekiyor ve bu etkileşim kendisi müdahale olabilir. GFP gibi hacimli fluorophores kullanıldığında bu özel dikkat gerektirir. Bu florofor hiçbiri bağlanma çalışmaları için kullanılabilir, bu süreden sonra katılan proteinlerin birine dışsal fluorophores tanıtmak gereklidir. Birçok kimyasal olarak sentezlenmiş fluorophores biri kovalent gibi amin grupları (bir lisin ya da N-terminal yan zincir) ve sistein tiyol grupları olarak reaktif gruplar yoluyla proteinlere bağlanabilir. Fiodoasetamid ve maleimid tiol-reaktif gruplar, 13 ise izotiyosiyanat ve süksinimidil esterlerin ile luorophore türevleri amid grubu ile reaksiyona girer. Floresan uygulamalarda en yaygın olarak kullanılan boya fluoresein türevleri ve rodamin, yeşil boya, kumarinler, BODIPY fluorophores ve Alexa Fluor boyalardır. Piyasada mevcut fluorophores ve bunların kullanımı ayrıntılı bir listesi referanslar 14,15 bulunabilir. Başarılı bir etiketleme için, reaktif grup proteinin yüzeyi ile açık olmalıdır, fakat polipeptidler tipik olarak reaktif işlevsel grupların çok sayıda, mevkiye-özgü modifikasyonu almak çok zordur. Bu çalışmada, ilgili protein, SBDS, birden fazla site etiketleme ile sonuçlanabilir 5 serbest sistein ve 33 lisin bulunmaktadır. Sigara üniforma etiketleme bağlama etkileyebilir ve farklı fluorofor molekülleri bağlanması üzerine farklı floresan yoğunluğu sinyallerini ortaya çıkarabilir olarak veri analizi zorlaştıracaktır. ove içinBu sorunu rcome biz FLASH florofor, 4 'site doğrudan etiket, 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) floresein SBDS proteini kullanılır. Bu motifi X sistein 16,17 dışında herhangi bir amino asit olduğu sekansı CCXXCC oluşan flaş etiketi olarak bilmek dört aralıklı sistein için büyük bir benzerliği olan bir arsenoxide boyadır. Bu Tetracysteine ​​motifi birlikte proteinin genel kat bozulmasını önlemek için, uygun bir bağlayıcı ile genetik mühendisliği ile N- veya proteinin C-terminaline ilave edilmiştir. FLASH boya ve FLASH etiketinin oluşan bir çift ilk hücreler 17 oturma yeri belirli etiket protein için tasarlanmıştır, ancak, aynı zamanda, burada örnek olarak olduğu gibi, in vitro olarak, saflaştırılmış proteinleri etiketlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, enzimatik stratejiler aynı zamanda, proteinlerin 18 site-spesifik işlevselleştirilmesini sağlamak için geliştirilmiştir.

Bu yazıda floresan anizotropi a yararlılığını açıklarsa aracı protein-protein etkileşimleri incelemek için. niceliksel bilgi deneysel verilerin uyum elde edilebilir ise ciltleme eğri şeklinin basit bir muayene ile değerlendirilebilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. SBDS-Flash etiket Protein Ekspresyonu ve Saflaştırılması

Not: anizotropi deneyler için, bir flaş-eklentisi Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, PCR ile kodlama sekansı, insan SBD'ler C-terminaline ilave edilmiştir sekansına karşılık gelir. Bu konstrukt, sentezleme vektörü pRSET-A alt klonlandı ve N-terminali hekzahistidin etiketi (His-tag) kodlayan bir proteini ifade etmek üzere E. coli C41 hücrelerine transforme edildi, sekansı ve bir C-terminus Flash etiket 10 kodlama insan SBDS.

  1. SBDS-Flaş protein ifadesi
    1. Yetkili E. Transform Standart bir ısı şok protokolü 19 kullanılarak plazmid pRSET-HisSBDS-Flash ile coli C41 hücreleri. 100 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş bir katı Luria-Bertani (LB) ortamı içinde, hücreler plaka. LB katı ortam bileşimin 10 g NaCI, 5 g maya ekstresi, 10 g tripton, 1 L hacminde 20 g agar oluşur.
    2. 37 ° C 'de kültür dönüştürülmüş bakteriler kadar600 nm'de (600) absorbans 100 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş LB sıvı ortam 1 L 0.5-0.7 ulaşır.
    3. kültüre 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid eklenerek proteinin ifadesini uyarmak ve tekrar 5 saat boyunca inkübasyona devam edin.
    4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3800 x g'de santrifüj ile bakteriyel bir süspansiyon toplayın. süpernatantı. Bu noktada, -20 ° C'de hücre pelletini depolamak ya da protein saflaştırma için hemen kullanın.
  2. SBDS-Flaş protein saflaştırma
    Not: tüm kromatografi adımları hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi veya bir peristaltik pompa kullanılarak gerçekleştirilir. Ni2 + -affinity kromatografisi 5 ml hızlı akış kolonu kullanır. Anyonik değiştirme kromatografisi, 5 mi, güçlü sülfopropil katyon değiştirici kolon kullanılmıştır. 3 ml / dakika akış hızı, tüm kromatografi adımları için kullanıldı.
    1. SBDS Lizis B 35 ml hücrelerin tekrarUffer 4 dk 10 saniye ve 30 saniye arasında çevrimleri kullanılarak bir toplam süre için sonikasyon ile 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve parçalanmasıyla ile takviye (50 mM fosfat tamponu pH 7.5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol), 4, ° C.
    2. 4 ° C'de 50 dakika boyunca 9000 x g'de santrifüjleyin.
    3. süpernatant tutun ve hücresel enkaz kaldırmak için pelet atın.
    4. SBDS Lizis tamponunun 3 sütun hacmi (CV) ile Ni 2+ afinite sütunu dengelenmesi ve kolona süpernatan açıklık bütün getirmektedir.
    5. SBDS lizis tamponu 3 CV ile yıkanarak bağlanmamış protein çıkarın ve SBDS elüsyon tamponu 3 CV (50 mM fosfat tamponu pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol) ile elüte.
    6. 50 mM fosfat tampon maddesi pH 6.5 ile elüt edilmiştir Protein 6 kat seyreltilir ve 0.22 um selüloz zar içerisinden filtre edilerek mümkün olan agrega kaldırmak.
    7. Düşük bir tuzu S sütunun 3 CV sülfopropil katyon değiştirme sütunu dengeyetampon maddesi (50 mM fosfat tampon maddesi, pH 6.5, 50 mM NaCI) ve önceki adımda elde edilen protein örnek getirmektedir.
    8. Yıkama ilişkisiz düşük tuz S kolon tamponu 3 CV malzeme ve 50 mM fosfat tamponu pH 6.5, 1 M NaCI ile tek bir adımda proteinini ayrıştırmak.
    9. 50 mM fosfat tampon maddesi pH 6.5 ile elüt edilmiştir, protein 3.3 kat seyreltilir. 15 dakika boyunca 3800 x g'de santrifüj ile ultrafiltrasyon cihazları ile protein konsantre edilir. Sıvı nitrojen içinde protein dondurma ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
    10. SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile 20 proteinin saflığını teyit.

2. EFL1 Protein Expression and Purification

NOT: EFL1 Gal 1/10 farklı promotör 21 ve vektör pRS426 içinde Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR'sinden düzenlemesi altında ifade edildi. Rekombinant protein, bir Tütün Etch Virüsü proteaz birleştirilmiş insan EFL1 izoformunu 1 (kodlarTEV) tanıma alanı, ve C-terminalinde bir hekzahistidin etiketi.

  1. EFL1 protein ekspresyonu
    1. S. Transform Standart bir lityum asetat ile protokolü 22 kullanılarak plazmid pRS426-EFL1TevHis ile cerevisiae BCY123 hücreleri. % 2 (a / h) glukoz ile desteklenmiş urasil (SD-Ura) olmadan ortam üzerinden sentetik damla tüm dönüştürülmüş hücreler plaka. SD-ura oluşan kompozisyon, amino asitler olmadan 8 g maya nitrojen bazı, 11 g kasamino asitleri, 55 g adenin sülfat, 55 g tirosin, 60 mg lösin ve 1 L hacminde 60 mg triptofan içerir.
    2. 600% 0.5 (a / h) glukoz ile desteklenmiş SD-ura 1.8 1 L ulaşıncaya kadar Kültür, 30 ° C 'de maya dönüştürdü.
    3. kültüre galaktoz (ağ / hac)% 2.8 eklenerek proteinin ifadesini uyarmak ve 30 ° C de 18 saat inkübasyona devam edin.
    4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3800 x g'de santrifüjleme ile, maya süspansiyonu toplanır. süpernatantı.Bu noktada, -20 ° C'de hücre pelletini depolamak ya da protein saflaştırma için hemen kullanın.
  2. EFL1 protein saflaştırma
    Not: tüm kromatografi adımları bir FPLC sistemi veya peristaltik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir. Ni2 + -affinity kromatografisi / dakika 3 ml bir akış oranında bir 5 ml hızlı akış kolonu kullanır. Ebat eksklüzyon kromatografisi 125 ml kolon, 1 ml / dk'lık bir akış oranında Superdex 200 reçinesi ile önceden paketlenmiş kullanır.
    1. , 1 mM PMSF ve 1 mM benzamidin ile takviye EFL1 lisiz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 8, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol), 50 ml hücrelerin tekrar tarafından hücrelerin bozulması 4 ° C'de, 2 dak ve KAPALI 15 dakika için 6 dakika ile döngü, toplam zaman cam boncuk (çap = 0.5 mm) kullanılarak bir kordon çırpıcı sürtünme.
    2. 4 ° C'de 50 dakika boyunca 9000 x g'de santrifüjleyin.
    3. süpernatant tutun ve hücresel enkaz kaldırmak için pelet atın.
    4. EFL1 lizis tamponu 3 CV Ni2 + afinite sütunu dengeye ve sütun üzerine tüm berrak yüzer getirmektedir.
    5. EFL1 lizis tamponu 3 CV ile yıkanarak bağlanmamış protein çıkarın ve EFL1 elüsyon tamponu 3 CV (50 mM Tris-HCI pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol) ile elüte.
    6. Anizotropi tamponu 1.5 CV (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol, 5 mM β-merkaptoetanol) ile ebat eksklüzyon kolonu dengelenmesi.
    7. 1 ml istenen hacme 3,800 x g'de santrifüj ile ultrafiltrasyon cihazları ile Ni2 + afinite sütunundan elüt EFL1 proteini için konsantre edilir. Boyut dışlama kolonundan ilgili örnek tanıtılması.
    8. Tasfiye edilen proteini toplamak ve yaklaşık 30 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar ultrafiltrasyon yoluyla konsantre edilir. Flaş sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza protein dondurma. th doğrulayınSDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile 20 protein e saflık.

Flaş Floresan Boya 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Floresein ile SBDS-FLASH 3. Etiketleme

  1. , 4 '3 nmol olan 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Anizotropi tamponu, 5 ul hacminde Floresein boyası SBDS-Flash proteininin 3 nmol karıştırın.
  2. Reaksiyon, 4 ° C 'de 8 saat boyunca sürmesine izin verin. ücretsiz boya kaldırmak için gece boyunca anizotropi tampona karşı örnek dialyze.
  3. etiketli proteinin% ölçmek için Lambert-Beer yasası kullanın. 280 nm ve uygun hacimde bir kuartz küvet kullanarak bir spektrofotometre ile 508 nm'de absorbansı ölçülür. NOT: Aşağıdaki molar soğurma katsayıları (M -1 cm -1) düşünün:
    figure-protocol-1
  4. Denklem 2 kullanılarak etiketli SBDS-FLASH protein konsantrasyonu hesaplayın.
    figure-protocol-2
  5. Önceki adımdaki hesaplanan C SBDS-Flaş ikame ederek Denklem 3 kullanılarak toplam SBDS protein konsantrasyonu hesaplayın.
    figure-protocol-3
  6. Denklem 4 kullanılarak etiketli protein yüzdesini hesaplayın.
    figure-protocol-4

4. Floresan Anizotropi Deneyleri

Not: Anizotropi deneyleri, bir polarizasyon araç kutusu ve veri toplama aracı arasında yazılım Resim anizotropi programı kullanılarak yapıldı ile donatılmış bir spektrofotometreyi yapıldı. Eksitasyon dalga boyu 8 nm spektral bant genişliği ile 494 nm'de ve emisyon 530 ± 25 nm bant-geçiş filtresi kullanılarak kaydedildi. Ölçümler, 5 mm yol uzunluğu 10 ile 200 ul küvet içinde, 25 ° C de yapıldı.

  1. Bir floresan küvet içinde, anizotropi tamponunda 30 nM SBDS-FLASH 200 ul koyun ve 30 uM EFL1 2 ul titre. İyice karıştırın ve reaksiyon anizotropi değerinin ölçülmesi önce 3 dakika bekletin.
  2. EFL1 40 ul toplam hacme kadar adımı tekrar 4.1 eklenmiştir.

5. Veri Analizi

  1. Bir doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon algoritması kullanılarak uygun bağlanma modeline veri monte edin. En yaygın bağlayıcı modelleri için denklemleri Tablo 1'de sunulmuştur.
  2. Uygun 23 artıklar inceleyerek proteinler arasındaki etkileşimi açıklar iyi modeli değerlendirin. Ek deneyler ile seçilen modelini desteklemektedir.

Tablo 1. Ortak protein-protein etkileşim bağlayıcı modelleri ve onları tanımlayan matematiksel denklemler.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
figure-protocol-5

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Herhangi bir anizotropi deneyi gerçekleştirmek için türlerin bir karışımı gözlenen anizotropi Denklem 5 ile temsil edilir çünkü fluorofor floresan yoğunluğu büyük değişiklikler ekarte etmek önemlidir:

figure-results-1

F i her bir bileşenin ve r fraksiyonel floresan temsil nereye i<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

proteinleri ile en biyokimyasal deneyler kullanılan tekniğe bakılmaksızın, saf protein değil, aynı zamanda onların büyük miktarlarda sadece gerektirir. Burada sunulan olduğu gibi, bu nedenle, bu deney türü için kullanılan proteinler, heterolog ekspresyonu ile elde edilir. Floresans spektroskopisi çalışılan molekül içinde bir florofor varlığını gerektirmektedir. en çok protein için ortak olan ve her ikisi de mevcut olacağından aromatik artıklar, protein-protein etkileşimleri incelemek için analiz, sinyal zorlaştırmaktadı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur ve rekabet eden hiçbir mali çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, CONACyT proje numaraları 167359 ve 177138 ile DGAPA-UNAM proje numarası IN201615'den gelen mali desteği kabul ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 mm Cam boncuklarBiospec Ürünler11079105
Tris BaseFormediumTRIS01Ultra saf
GliserolSigma-AldrichG5516
boya 4',5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) floreseinThermoFischer ScientificLC6090Bu kit, bir FlAsH etiketini etiketlemek için boyayı içerir
AmpicilineIBI Shelton Scientific, IncIB02040
D (+) - Susuz GlikozOrtaGLU03
D (+) - GalaktozOrtaGAL03
L-LösinOrtaDOC0157
L-Triptofan ve nbsp;OrtaDOC0189
Bezamidin hidroklorürSigma-AldrichB6506-5G
PMSFAltın Biyoteknoloji, IncP-470-25Fenilmetilsülfonil florür
NaClFormediumNAC02Sodyum Klorür ve nbsp;
GliserolTecsiquim, S.A. de C.V.GT1980-6
MgCl2Merck Millipore Corporation1725711000Magnezyum Klorür
İmidazolSigma-AldrichI2399-500G
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM6250-100ML
K2HPO4Sigma-AldrichP3786-500GPotasyum fosfat dibazik
NaH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichS3139-500GSodyum fosfat monobazik
Maya azot bazı amino asitsizOrtaCYN0410
Maya özüFormediumYEM03Mikro Granül
L-TirozenFormediumDOC0193
Adenin sülfatOrtaDOC0230
kasamino asitleriçinmediumCAS03
TriptonIBI Shelton Scientific, IncIB49182
IPTGFormediumIPTG025
Filtrasyon üniteleriMerck Millipore CorporationUFC901096Amicon Ultra-15, membran PLGC Ultracel-PL, 10  kDa
Membran FiltreMerck Millipore CorporationGSWP04700Membran Filtre, karışık selüloz esterleri, Hidrofilik, 0.22  &mikro; m, 47  mm, beyaz, düz
Ni2+ afinite sütunuQIAGEN30760Kartuş önceden 5  ml Ni-NTA Süper Akışlı
Güçlü Sülfopropil katyon değiştirici kolonuGE Healthcare Life Science17-5157-01HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Boyut Dışlama sütunuGE Healthcare Life Science28989335HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Floresan hücresiHellma Analytics111-057-40
SpektrofotometreAgilent TechnologiesG6860AACary 60 UV-Vis
ÇalkalayıcıThermoFischer ScientificSHKA4000-7MaxQ 4000 Tezgah üstü sıcaklık aralığı Ortam-15 ° C ila 60 ° C; C
SantrifüjThermoFischer Scientific75004271Heraeus Megafuge 16R
FPLCPharmacia BiotechDurdurulanFPLC sistemi iletkenliği UV-MM II monitör P500 pompa fraksiyonu
Spektroflorometre OlisPolarizasyonAraç Kutusu ile uygulanabilir Olis DM 45
yok

Kaynaklar

  1. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  2. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  3. Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
  4. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  5. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
  6. Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).
  7. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
  8. Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
  9. Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
  10. Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
  11. Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
  12. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
  13. Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
  14. Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
  15. Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
  16. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  17. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  18. Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
  19. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  20. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
  21. West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
  22. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
  23. Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
  24. Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
  25. Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
  26. Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
  27. Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
  28. Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
  29. Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresans iddetiRotasyonel Dif zyonB lgeye zg EtiketlemeTetrasistein MotifiNikel Afinite KolonuBoyut D lama KolonuSDS PAGE AnaliziKuvars K vet
Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.