Basit mekanik Prosedür Mouse Limbal Kök Hücre Eksikliği oluşturma

Özet

aşağıdaki makale etkin bir limbal kök hücre yetmezliği (LSCD) sürdürülebilir bir fare modeli oluşturmak için kolay, tekrarlanabilir teknik sağlar. Bu hayvan modeli test ve limbal kök hücre hastalıkları için tedavi etkinliğini karşılaştıran yararlıdır.

Özet

Limbal kök hücre eksikliği (LSCD) arıza veya kornea epitel konjonktiva ile değiştirilir sonra limbal epitel kök hücrelerin, kaybı durumudur. Hastalar tekrarlayan kornea defektleri, ağrı, enflamasyon ve görme kaybı muzdarip.

Daha önce, LSCD bir fare modeli tarif ve diğer iki model ile karşılaştırılmıştır. amaç hem taklit insanlarda fenotip ve hastalık patofizyolojisini incelemek için ve yeni tedaviler değerlendirmek mümkün kılmak için yeterince uzun sürer LSCD tutarlı bir fare modeli üretmek oldu. Burada, tekniğin daha ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.

Dönen bir çapak ile bir motorlu araç kornea yüzeyinden pas halkaları çıkarmak için ya da hastaların pterjium yatak düzeltmek için tasarlanmıştır. İstenen LSCD model oluşturmak için uygun bir cihazdır. Sanki, küçük gözleri üzerinde çalışmak için uygun kılan bir ince ucu ile bir hazır, kolay kullanımlı bir araçtırFarelerde. Bu uygulama, göze gereksiz travma önler ve genellikle kimyasal yaralanma modellerinde olduğu gibi, istenmeyen yaralanmalara neden olmaz. künt kazıyıcı aksine, bu bazal membran ile epitel kaldırır. Bu protokolde, limbal alan iki kez aşınmış ve daha sonra bütün kornea epitel limbustan limbusa tıraş edildi. Stroma yaralanmasını önlemek için, bakım epiteli zaten kaldırıldı kez kornea yüzeyi fırça değil alındı.

Giriş

kornea epitel kornea netlik ve bütünlüğünü korumak için gereklidir. Sürekli kornea ve konjonktiva kavşağında Limbustan-dar bir bölgede yaşayan epitel kök hücreleri tarafından yaşamı boyunca yenilenir. Bunlar kendini sürekli yenileyen limbal kök hücreler hem normal ve yaralanma sonrası, kornea epitel rejenere önemli bir rol oynamaktadır. Bu kök hücrelerin kısmen ya da tamamen tükenmesi tekrarlayan kornea erozyonlar, ağrı, kornea yara ve neovaskülarizasyon, goblet hücre görünümü neden olacak ve tedavi edilmezse, korneal körlük bırakılırsa. Bu durum limbal kök hücre eksikliği (LSCD) olarak da bilinir ve idiyopatik olabilir; kalıtsal; veya bağlı kimyasal veya termal yaralanmalar, uzun süreli kontak lens takmak ve kronik inflamasyon ^1-6 kazandı.

LSCD üzerine yapılan araştırmalar, uygun bir hayvan modeli gerektirir, sadece taklit insanlarda hastalık, ancak en az olan, tekrarlanabilir ve sürdürülebilirdiğer kornea ve oküler yapıların yaralanma montaj. Bu model tedavileri değerlendirmek ve moleküler ve hücresel düzeyde hastalık mekanizmalarını açıklamak gereklidir. Dönen bir çapak kullanımı ile, ¹ Daha önce anlatıldığı gibi, kolayca bahsedilen avantajlara sahiptir ve en az üç ay boyunca devam LSCD bir fare modeli geliştirebilir. Bu çalışmanın amacı LSCD basit, tekrarlanabilir ve sürdürülebilir fare modeli sunmaktır.

Dönen çapak eşit altta yatan stroma ¹ zarar vermeden epitel kaldıran bir araçtır. Yara iyileştirici çalışmalarda kornea erozyon ^{7, 8} uyarılması için kullanılmıştır. Bir fare LSCD oluşturmak için vesile-sunulan teknik daha önce rapor edilmemiştir. Daha önce daha fazla restorasyon o ile, daha az homojen yaralanma-özellikle limbus-ve daha değişken bir fenotip ^{1, 9} bir künt spatula sonucu epitel kazıma yöntemleri tanıttıf Normal kornea epitel ^1. Kör kazıyıcı farklı olarak, döner çapak oyuk ^{7, 8, 10} gibi epitelyal bazal membran kaldırır. kök hücreleri ayırmak için bildirilen diğer metotlar, altta yatan göz yapılarına istenmeyen yaralanmalara neden olabilir, aynı zamanda önemli enflamasyon ve daha sonra kornea opasitesi ya yol açabilir, sadece sodyum hidroksit, n-heptanol, ve benzalkonyum klorür gibi kimyasal kullanılmasını içerir epitel skuamöz metaplazi ^11-15. Dönen çapak bu ciddi komplikasyonlar ile ilişkili değildir. Cerrahi, tek başına ya da kimyasal maddelerin ^{10, 11, 16} kullanımı ile, limbal epitel kaldırma gerçekleştirmek için daha zordur ve küçük gözler ve (fare gibi) ince limbal epitel hayvanlarda en iyi seçenek değildir. Buna ek olarak, şaşırtıcı, limbectomy hala ¹⁰ gerisinde limbal epitel bazı bırakabilir.

Aşağıda tarif edilen teknik, neovaskülarizasyon AN LSCD neden olurhastada tam LSCD sunumunu taklit ve en az üç ay ¹ sürer D konjonktiva. Bu farelerde LSCD veya yara iyileşmesi patofizyolojisi, immünoloji ve potansiyel tedavi çalışma amacı olanlar için uygundur. Muhtemelen, bazı değişikliklerle, bu prosedür sıçan ya da tavşan ¹⁰ gerçekleştirilebilir. Dönen çapak verimli epitel kaldırır gibi, korneal epitel aşınma / yaralama ve herhangi bir ilgili tedavi ya da moleküler biyoloji çalışmalarında ilgili herhangi bir araştırma kullanılabilir.

Protokol

Hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler vizyon araştırma hayvan kullanım için Vizyon ve Oftalmoloji tablolarında Araştırma Derneği ile uyumludur. Altı aylık erkek / kadın C57BL / 6J vahşi tip farelere Ondört dört kullanıldı: on yaralanma modeli için fareler ve kontrol hayvanlarına olarak dört (yaralı olmayan korneası).

1. Hayvan hazırlanması

1. Bir 100 mg / kg ketamin intraperitonal enjeksiyon ve 5 mg / kg ksilazin karışımı ile bir fare anestezisi. Anestezi etkisi almıştır sonra, anestezi derinliği onaylamak için ayak tutam; Hayvan tepkimeye girmemelidir.
2. herhangi bir önceki kornea hasarı yokluğunu doğrulamak için deneylerini önce bir yarık lamba altında göz kontrol edin.
3. gözün üzerine% 1 tetracaine hidroklorür bir damla aşılamak. 60 Sonra - 90 saniye, duyu yokluğunu doğrulamak için kornea refleksi test edin. Proparakain hidroklorür% 0.5 yerine kullanılabilir.
4. Ne zaman kornea duyu kaybıBelirli nazikçe göz ve göz çevresinde saç% 5 povidon-iyot bir damla yerleştirin. 1 dakika sonra damla silin ya da araç ipucu müdahale saç önlemek için göz çevresinde saç üzerine yayılır.

2. Kornea epiteli zımpara

1. cerrahi eldivenleri ve bir önlük giyin. Steril dönen çapak ve steril bir cımbız: gerekli araçları hazırlayın. Daha iyi kontrol için, bükülmüş cımbız kullanın. İşlem sırasında steril bir kağıda araçları yerleştirin.
2. bükülmüş cımbız kullanarak, burun tarafında kapaklarını kapma ve yavaşça göz proptosing ile göz stabilize. Çok fazla baskı kullanmaktan kaçının.
3. Cerrahi mikroskop altında, iki kez steril dönen çapak kullanarak limbal alanı çevresinde 360 ​​° tıraş. Tur başına 6 sn - 5 hızında limbusta etrafında gidin.
   NOT: çapak bir sabit hıza sahip. Ancak, kurulan hızda döndürmek için, "son fındık" tamamen sıkılmalıdır.
4. Dönen çapak ile limbusa limbustan bütün kornea epiteli çıkarın. Daha iyi sonuçlar için, dairesel bir şekilde aracı hareket ettirmek ve kornea yüzeyinin biraz paralel olarak ucunun yan tarafına çalışmak tutun. re-fırçalama tarafından değil epiteli zaten kaldırılmış alanları stroma kesmemeye dikkat edin. göz üzerinde herhangi bir baskı uygulamayın. gerektiği gibi fırça ucu temizleyin.
5. korneada steril fosfat tamponlu bir damla serum fizyolojik aşılamak ve yumuşak bir temizlik dokusu ile herhangi bir müstakil epitel sayfaları silin.
6. varsa kalan epitel tıraş.
7. Ameliyat sırasında fare kuyruğu dikkat edin.
   NOT: herhangi bir hareket oluşursa, anestezi derinliği soluk ve daha fazla enjeksiyon gereklidir. Birincil enjekte hacminin üçte ikisine üçte biri yeterli olmalıdır. anestetik ilaç ile hayvan aşırı doz etmeyin.
8. Başka bir göz bunları kullanmadan önce tüm araçları sterilize edin.

3. Onayla Komple epitel Kaldırma

1. kornea olarak 1 mg / ml floresein sodyum bir damla uygulanır. 30 saniye sonra kornea temizleyin ve epitel tümüyle kaldırılmasını doğrulamak için bir kobalt mavisi filtreli bir mikroskop altında incelemek.
   NOT: epitel defekti ile Kornea alanlar yeşil görünür hale gelir.

4. Post-işlem Bakımı

1. Bir ısıtma battaniye hayvan koyun ve kurtarma altında iken (kendi kafeste, örneğin) güvenli bir yerde saklayın. bilinçli olanların şirket bilinçsiz bir hayvan tutmayın.
2. % 1 eritromisin oftalmik merhem sürün. Bu aynı zamanda göz kuruluğu engelleyecektir. Uygulamayı bir hafta boyunca antibiyotik gazetesine devam edin.
3. kg buprenorfin subkutan işlemden sonra tekrar 12 saat sonra / 0.1 mg enjekte edilir. İki gün süre ile günde iki defa enjeksiyon devam edin.
4. anesteziden tam iyileşme kadar, 45 dakika - 30 hayvan gözlemleyin.
   NOT: Ventral yüzeyinde solunum kaslarının hafif hareket kurtarma altında iken hayvan welness gösterir.

Sonuçlar

Bu tekniği gerçekleştirdikten sonra bir ay içinde, kornealar% 100 yüzeyel neovaskülarizasyon gelişti (Şekil 1A. Fotoğraflar parlak alan ve kobalt mavisi filtrenin altına bir yarık lamba bağlı bir kamera ile çekildi). Gözün 18/20 (% 90) 'de, yeni damar oluşumu, kornea bütün yüzeyi (Şekil 1A) içeriyordu. 2/20 (% 10), neovaskülarizasyon üç dört kornea kadranlarda gözlendi, ama yine de kornea merkezine ulaştı.

Tartışma

Bu makalede, LSCD olan bir fare modeli oluşturmak için yeniden üretilebilir ve nispeten basit bir teknik açıklanmaktadır. fazlalaştı olan bu modelin bazı önemli yönleri vardır. İlk olarak, kimyasal madde ^{11, 12} kullanımı farklı modeller, yaralanma esas olarak altta yatan kornea stroma veya başka göz içi yapıların en az zararla yüzey epiteli (ve bazal zar) içerir. Böylece, prosedürü komplike ve daha zor limbal kök hücrelerin yönelik herhangi bir müdahalelerin sonucunu değerlendirmek için yapabileceğiniz her ik...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Döner çapak: AlgerBrush II pas halkası sökücü	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0,5 mm çapak. Ayrıca diğer şirketlerden de temin edilebilir.
Cerrahi mikroskop	Wild Heerbrugg, İsviçre	Wild M691
Dijital kamera	Nikon, Tayland
Nikon FS-2 yarık lamba	Nikon, Japonya
Poliklonal anti-CK12 antikoru	Santa Cruz Blotechnology, CA,SC-17101		1:100 konsantrasyon
Monoklonal anti-CK8 antikoru	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	1:50 konsantrasyon