Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri

8.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54666

⸱

31 Ekim 2016

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

Bu makalede

Özet

Olgun Drosophila oositlerinin toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, mayoz bölünme sırasında kromozom davranışının ve iğ montajının ve işlevinin görselleştirilmesine izin verir.

Özet

İnsan oositlerinde kromozom ayrışması hataya açıktır, bu da düşük ve doğum kusurlarının önde gelen genetik nedeni olan anöploidi ile sonuçlanır. Model organizmalardan alınan oositlerdeki kromozom davranışının incelenmesi, insan oositlerinin anöploidiye duyarlılığının moleküler temelini ortaya çıkarmak için çok umut vaat etmektedir. Drosophila melanogaster, 100 yılı aşkın araştırma, topluluk ve teknik geliştirme ile genetik manipülasyona uygundur. Bununla birlikte, Drosophila oositlerinde kromozom davranışını ve iğ düzeneğini görselleştirmek, esas olarak oositi çevreleyen ve antikorlara nüfuz edemeyen zarların varlığından dolayı belirli zorluklara sahiptir. Burada, bu önemli model organizmada kromozom ayrışmasının moleküler diseksiyonuna izin veren Drosophila oositlerinde mayoz I iğ düzeneğinin ve kromozom davranışının toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokolleri açıklıyoruz.

Giriş

Mayoz bölünme çalışması bazen "genetiğin genetiği" olarak tanımlanır. Bunun nedeni, kromozom kalıtımının ve bağımsız çeşitliliğin temel özelliklerinin, gamet üretimi sırasında kromozomların ayrılması yoluyla gerçekleştirilmesidir. Kromozom kalıtım teorisinin önemli bir gösterimi 1916'da Calvin Bridges'in Drosophila melanogaster1'deki çalışmasından geldi. Drosophila'daki bu ve diğer klasik genetik çalışmaları, genetik anlayışımıza büyük katkı sağladı. Bununla birlikte, Drosophila oositlerindeki mayotik kromozomların sitolojik incelemesi zor olmuştur. Bunun başlıca nedeni, iğ bir araya geldiğinde ve kromozomlar ayrışma için yönlendirildiğinde, geç evre Drosophila oositlerinin immünofloresansının, oositi antikorlara karşı geçilmez hale getiren zarların varlığı tarafından engellenmesidir.

Bu zorluğa rağmen, Drosophila oositleri, kromozom davranışı ve iğ montajı çalışmaları için çekici bir model olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni, Drosophila'da bulunan güçlü genetik araçların yanı sıra, kromozomlar yönlendirildiğinde ve iğ tamamen oluştuğunda, oositlerin metafaz I'de tutuklanmasıdır. Bu, hücre bölünmesinin bu önemli aşamasında çok sayıda oositin toplanmasını ve incelenmesini kolaylaştırır. Ek olarak, oosit kromozom ayrışmasının incelenmesi için genetik manipülasyona uygun basit bir model organizma, insan üreme sağlığı anlayışımıza önemli bir katkı sağlayabilir. Kromozom sayısındaki hatalar, insanlarda düşük ve doğum kusurlarının önde gelen genetik nedenidir2. Bu hataların çoğu oositte kadar izlenebilir ve artan anne yaşı ile ilişkilidir. ABD'deki annelerin ortalama yaşı artıyor ve bu da bunu önemli bir halk sağlığı sorunu haline getiriyor.

Burada, oosit zarlarının nasıl çıkarılacağının bir gösterimi de dahil olmak üzere, Drosophila oositlerinin sitolojik incelemesi için yöntemleri açıklıyoruz. Bu yöntemler, ilk olarak Theurkauf ve Hawley3, Zou ve arkadaşları tarafından tanımlanan protokollerin modifikasyonlarıdır.4 ve Dernburg ve ark.5. Ayrıca, ilk olarak Gilliland ve arkadaşları tarafından tanımlanan bir protokole dayanarak, oositlerin farklı aşamalarının zenginleştirilmesi için yöntemler de dahil ediyoruz.6. Son olarak, Drosophila oositlerinin ilaç tedavisi için talimatlar ekliyoruz. Bu yöntemler birlikte, Drosophila'da oosit kromozom ayrışması ve iğ montajının sitolojik olarak incelenmesine izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Aksi belirtilmediği sürece, işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Sıcaklık kontrollü inkübatör sinek yetiştirme için sıcaklıkları korumak için kullanılan ve aksi belirtilmediği sürece haçlar vardır.

1. hazırlıklar

  1. Sinekler hazırlayın.
    1. oosit koleksiyonları prometafaz zenginleştirilmiş.
      1. Net yetişkin sağlıklı, genç stok veya çapraz kültürlerinden uçar. 25 ° C'de iki gün için yaş şişe.
        Not: Genellikle, iki sağlıklı şişe yeterli olacaktır, daha çok bazı çapraz kültürler için gerekli olabilir, ancak.
      2. İki gün sonra, şişe (bu noktada, 0 ila 2 gün geçmiş) ~ 100 ila 300 kadın toplar. kadın bakire olması gerekmez. Bir şişenin yanına maya hamur dab ekleyin ve 30 kadın ve mayalı şişeleri içine 10 ila 15 erkek her koyun. 25 ° C'de iki gün için yaş şişeler.
    2. Oosit Koleksiyonlar metafaz zenginleştirilmiş.
      1. Hisse senedi veya çapraz KÜLTÜR gelen ~ 100 ila 300 kadın toplamakes. Bir şişenin yanına maya hamur dab ekleyin ve 30 kadın yer mayalı şişe içine (ilave hiçbir erkek ile birlikte) her biri. 25 ° C 'de üç ila beş gün için yaş şişeler.
  2. Çözümler hazırlayın.
    Not: Aksi belirtilmediği sürece, Solutions, oda sıcaklığında süresiz depolanabilir.
    1. Robb tampon Modifiye hazırlama (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sukroz, 275 mM sodyum asetat, 200 mM potasyum asetat, 50 mM glukoz, 6 mM magnezyum klorid, 5 mM kalsiyum klorid. 7.4 pH değerini elde etmek için potasyum hidroksit: 8 sodyum hidroksit: 10 K 11 kullanın. filtrasyon ile sterilize; kaynatmayın. -20 ° C'de saklayın. ~ 1x Robb'un oosit başına hazırlık 200 ml hazırlamak için gerekli olarak çözülme.
    2. Tespit Çözümleri.
      1. Seçenek # 1: formaldehit / heptan tespit hazırlayın. Sabitleme tampon hazırlayın: 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) artı 150 mM sukroz. kullanmak için, 687,5 ul Sabitleme Tampon ve 312,5 ul% 16 formaldehit ile taze yapmakoosit hazırlık başına.
        DİKKAT: Davlumbaz formaldehit çözümlerini kullanırken eldiven giyin. kurumsal kurallarına göre bertaraf edilmelidir.
      2. Seçenek # 2: formaldehit / kakodilat tespit hazırlayın. Düzeltme Mix hazırlayın: 250 mM sükroz, 100 mM potasyum asetat (pH 7.5), 25 mM sodyum asetat (pH 7.0) ve 25 mM EGTA (pH 8.0). kullanmak için, 400 ul taze karışımı saptamak yapmak 100 ul potasyum kakodilat (1 M, pH 7.2), ve oosit prep 500 ul% 16 formaldehid.
        DİKKAT: Potasyum kakodilat Arsenik içerir.
    3. 1x PBS artı% 1 veya% 0.05 Triton X-100 PBS / Triton X-100 hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
    4. 1 x PBS, (ağ / hac)% 0.5 BSA ve% 0.1 Tween-20: PBS-Tween 20 Sığır Serum Albumin (BSA) (PTB) hazırlayın. bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
    5. Situ Hibridizasyon (FISH) Çözümleri floresan.
      1. Hazırlama 20X Sodyum klorür-sodyum sitrat (SSC): 3 M sodyum klorür ve 0.3 M sodyum sitrat.
      2. Hazırlama 2x SSC-Tween-20 (SSCT) 2X SSC artı% 0.1 Tween-20. oosit hazırlık başına taze ~ 20 ml olun.
      3. formamid çözümler hazırlayın: 2 x SSC,% 0.1 Tween-20, ayrıca formamid. 1 ml% 20 formamid, 0.5 mL% 40 formamid, ve oosit hazırlık başına 2 ml% 50 formamid, taze olun.
        DİKKAT: Davlumbaz formamid çözümlerini kullanırken eldiven giyin. kurumsal kurallarına göre bertaraf edilmelidir.
      4. (Ağırlık / hacim) 2X SSC,% 50 formamid,% 10 dekstran sülfat: hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
    6. BALIK Probes.
      1. Order HPLC ile arıtma sahip oligonükleotid (dizileri için Tablo 1 'e bakınız) ve 5' flüoresan modifikasyonu (örneğin Cy3 veya Cy5) istenen. 50 ng / | il Tris-EDTA (TE) içinde süspanse edin.
        NOT: Her zaman ışık maruz oligos koruyun.

Geç evre Drosophila Oosit 2. Koleksiyonu

  1. Gibi plastik ve cam sopa intakt membranlı Drosophila oositlerin öncesi kat bir 5 ml tüp ve PTB ile oosit hazırlık başına bir süspanse içinde.
  2. karbon dioksit ile tüm ~ 100 ila 300 mayalı sinekler uyutmak ve ~ 100 ml 1x Robb'un Tamponu içeren bir blender ekleyin. Darbe üç kez (~ 1 sn her). aktivasyonunu önlemek için NOT: Alternatif olarak, oosit dişilerden el-disseke edilebilir. Bu yöntemin avantajı, daha az kadın gerektirmesidir. Ancak, bakım hipoksi 7 ile bağlantılı bozulmaları önlemek için sadece birkaç dakikaya kadar karbon dioksite maruz sınırlamak için dikkat edilmelidir.
  3. Büyük beden parçalarını kaldırmak için 250 ml behere büyük örgü (~ 1.500 mm) süzülür. Birçok bozulmamış karnı yine örgü, yeniden eziyet ek Robb'un Tampon kullanarak malzeme ve filtre üzerinde kalırsa. Daha sonra mümkün olduğunca büyük vücut parçaları gibi birçok kaldırarak, üst tabaka aspire ~ 2 dk dinlendiriniz.
  4. Fi250 ml'lik bir cam kaba, küçük elek (~ 300 um) vasıtasıyla ltresi. Ek Robb adlı ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak ilk beher dışına kalan oosit durulayın. yerleşmek ~ 3 dk edelim; oosit dışarı razı olacak. Aspire off ama ~ 10 ml.
  5. kaplanmış 5 ml tüp içine sığacak kadar 10 ml kadar dökün. , Yerleşmek sıvı kaldırmak ve kalanı tekrar edelim. Ek Robb adlı ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak kaptan dışarı kalan oosit durulayın. 3-5 dakika ~ 5 ml tüp dinlendiriniz.

3. İlaç Tedavileri (İsteğe bağlı)

  1. Coat her oosit hazırlık için PTB ile ikinci 5 ml tüp. 1 ml Robb birbirlerinin oosit hazırlık için, her (Tablo 2), uygun bir çözücü (kontrol) ya da ilaç ekleyin.
  2. İkinci kaplanmış 5 ml tüp içine bölünmüş oositler. , Yerleşmek Let sıvı kaldırmak ve bir tüp içine 1 ml Robb en artı çözücü eklemek ve 1 ml Robb en artı ilaç ikinci tüpe. Ilaç tedavisi (Tablo 2) uygun zaman miktarı için Nutate. Let yerleşmek.

4. Sabitleme

  1. Aspire tüm sıvı ve hemen 1 ml Fix ekleyin.
  2. Seçenek # 1: Formaldehit / heptan sabitleme (Fixation Tampon artı% 5 formaldehit).
    1. Bir nutator 2.5 dakika için düzelt. 1 mi heptan ve 1 dakika vorteksleyin ekleyin. yerleşmek ~ 1 dk olsun.
    2. tüm sıvı çıkarın ve sonra PBS 1x 1 ml ekleyin. Vortex 30 sn. yerleşmek ~ 1 dk olsun.
    3. tüm sıvı çıkarın ve sonra 1x PBS ile tüp doldurun.
      Not: Oositler hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir.
  3. Seçenek # 2: Formaldehit / kakodilat sabitleme (Mix artı% 8 formaldehit ve 100 mM kakodilat Fix).
    1. Bir nutator 6 dakika düzelt. 2 dakika dinlendiriniz. sıvı çıkarın ve sonra 1x PBS ile tüp doldurun.
      Not: Oositler hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir.

5. Membranlar çıkarma ( "Rolling")

  1. kaplanmış yeniden süspanse kullanarak, bir cam slayt buzlu (kumlanmış) kısmına ~ 500 ila 1000 oosit ekleyin. tüm vücut parçaları ve yabancı madde kullanarak forseps çıkarın. oosit kurumasına izin vermeyin; gerektiğinde 1x PBS ilave edin.
  2. Periyodik mikroskop altında ilerleyişini kontrol (. En iyi şekilde çalışır oosit genelinde lamel kenarına sürükleyerek) kaldırılır tüm membranların kadar oosit ve yavaşça "roll" oosit üstünde bir lamel yerleştirin gerektiğinde daha 1x PBS ekledi. oosit yok edecek çok fazla basınç olarak özen gösterin.
    NOT: immünfloresans sadece, (immünofloresan olan veya olmayan) FISH için Adım 6 ile devam için, Adım 7 ile devam edin.

Drosophila OOSİT 6. Antikor Boyama

  1. Ekstraksiyon ve Engelleme
    1. ~ 15 mi, PBS /% 1 Triton X-100 ihtiva eden 15 ml konik bir tüp içine haddelenmiş oosit durulayın. en az 1.5 saat için bu çözüm ve en fazla 2 saat içinde Nutate oositler.Bu adım, antikor nüfuz etmesini sağlar.
    2. oosit ~ 2 dk dinlendiriniz. Mümkün olduğunca çok sayıda membran ile birlikte sıvı çıkarın, daha sonra PBS ekleme /% 0.05 Triton X-100.
      NOT: Zarlar haddelenmiş oosit daha yavaş geçer.
    3. oosit ~ 2 dk yerleşmek izin, sonra tüm ama ~ 1 ml sıvı kaldırmak. Transfer oosit 1.5 ml tüp mezun oldu ve kalan sıvı çıkarın. 1 saat boyunca bloke etmek ve nutate 1 mi ATB ekleyin.
  2. antikor Boyama
    1. Embriyoların karşı sekonder antikor Ön emilim.
      Not: Bu adım, Drosophila proteinleri ile spesifik olmayan antikor reaksiyonları arka plan boyaması ortadan kaldırır.
      1. Toplayın ve tipik prosedür 8 uyarınca Drosophila embriyolar (~ 25 ul) düzeltmek. -20 ° C'de metanol içinde depolayın.
      2. , Embriyolardan, metanolün çıkması, 15 dakika boyunca 800 ul metanol artı PBS 1X 200 ul ve nutate ekleyin. süpernatan 500 ul çıkarın ve PBS 1X 500 ul ile değiştirin. Daha sonra 15 dakika boyunca nutate. (Yıkar ~ 1 saat olmak üzere toplam) iki kez tekrarlayın ve sonra PTB bitirmek.
        Not: Embriyolar hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir.
      3. , Sıvı çıkarın oosit hazırlık başına 200 ul PTB ile doldurun ve uygun dilüsyonlarda floresan etiketli sekonder antikor ekleyin (son hacim 300 ul olacağını göz önünde bulundurarak;. Adım 7.4) Nutate 4 ° C'de gece boyunca (tercih edilir) ya da 3 ila 4 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
        Not: önceden absorbe antikorlar Aşama 6.2.4 kullanılacaktır.
        NOT: mümkün olduğu kadar floresan antikorlar eklenmiştir kez karanlıkta örnekleri tutun.
    2. , Oosit sıvıyı çıkarmak 300 ul PTB ile doldurun ve uygun dilüsyonlarda primer antikorlar ekleyin. 4 ° C'de bir gece boyunca Nutate (tercih edilir) ya da 3 ila 4 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
    3. Yıkama 1 ml PTB 15 dakika her biri için dört kez oosit.
    4. Kaldıroosit, sıvı, embriyolar (sekonder antikor önceden absorbe) üstte yüzen madde 200 ul ekle. Ardından 300 ul PTB ile doldurun. 3 ila 4 saat (tercihen) veya gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında Nutate.
    5. 1 mi PTB ile 15 dakika boyunca bir kez oosit yıkayın, sıvıyı ayırın. Daha sonra, 7 dakika boyunca 0.5 ul Hoechst 33342 ve 500 ul PTB ve nutate ekleyin.
    6. 1 mi PTB ile her biri 15 dakika için iki kere oosit yıkayın.
      Not: Oositler hemen slayt üzerine monte edilebilir veya görüntüleme için hazır olana kadar 4 ° C'de PTB depolanabilir.

7. BALIK (Above Adım 5 Devam)

  1. ~ 15 ml 2x SSCT içeren 15 ml konik tüp içine yuvarlandı oosit durulayın. oosit ~ 2 dk dinlendiriniz. 0.5 ml sıvı mümkün olduğu kadar çok membran ile birlikte tüm ama ~ çıkarın.
    NOT: Zarlar haddelenmiş oosit daha yavaş geçer.
  2. Transferi 0.5 ml tüp oosit ve kalan sıvıyı çıkarın. Arda eklemek ve 500 ul kaldırmak% 20,% 40,% 50 formamid çözeltiler, her çözelti içinde 10 dakika için nutating.
    NOT: Oositler formamid yüksek oranları ile yavaş geçer.
  3. daha sonra 1 5 saat boyunca 37 ° C'de 500 ul% 50 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin sıvıyı ayırın.
    NOT: Daha uzun inkubasyon daha sonda penetrasyon ile sonuçlanır.
  4. En fazla 100 ° den ul oosit bırakarak sıvı çıkarın ve 36 ul hibridizasyon çözeltisi artı prob 2 ul (50 ng / | il) ve 2 ul su veya 2. prob (Tablo 1) 2 ul ekle.
  5. gece boyunca 37 ° C'de su banyosunda kuluçkaya bırakılır, ardından 3 dakika boyunca (FISH için) ya da 20 dakika (balık artı immünofloresan), 80 ° C, 91 ° C de inkübe edilir.
    Not: Bu adımlar, bir PCR gerçekleştirilebilir.
  6. sıvı çıkarmayın. 1 saat boyunca 37 ° C'de 500 ul% 50 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin.
  7. , Sıvı kaldırmak, yerleşmek Let 500 ul% 50 formamid çözüm ekleyin, bir1 saat süre ile 37 ° C 'de D nutate.
  8. , Sıvının çıkması, yerleşmek izin 10 dakika için oda sıcaklığında 500 ul% 20 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin.
  9. (Tekrarlama birkaç kez ters, sonra sıvı ekleyin kaldır, yerleşmek izin verin.) 500 ul 2x SSCT üç hızlı yıkar gerçekleştirin yerleşmek edelim, sıvı kaldırmak, daha sonra 4 saat boyunca 500 ul ATB ve nutate ekleyin.

8. Antikor Boyama FISH sonra

  1. , Oosit sıvıyı çıkarmak 300 ul PTB ile doldurun ve FITC konjuge 10 ul anti-α-tubulin antikor ekleyin. Seçenek olarak ise, diğer antikorlar, yukarıda protokol izlenerek, kullanılabilir. gece boyunca, oda sıcaklığında Nutate.
  2. daha sonra, 7 dakika boyunca 0.5 ul Hoechst 33342 ve 500 ul PTB ve nutate ekleyin sıvının çıkması, 500 ul PTB ile 15 dakika boyunca bir kez oosit yıkayın.
  3. 500 ul PTB ile her biri 15 dakika için iki kere oosit yıkayın.
    Not: Oositler hemen slayt üzerine monte edilebilir ya da hazır olana kadar 4 ° C'de PTB depolanabilirgörüntüleme. mümkün olduğu kadar floresan antikorlar eklenmiştir kez karanlıkta oosit tutun.
Tekrarlama Ad Kromozom Oligo Sırası *
359 X GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeka 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4 (+ Y) AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* Eric Joyce, kişisel iletişim, Sullivan ve ark diğer dizilerden 359 dizisi. 8

Tablo 1: Drosophila sentromerine tekrarlar için FISH probları.

İlaç çözücü stok konsantrasyonu Nihai konsantrasyon Tedavinin zamanı Efekt
kolşisin etanol 125 mM 150 uM 10 dakika ya da 30 dakika olmayan kinetochore (10 dakika) 9 veya Tüm (30 dakika) mikrotübül destabilize
paklitaksel DMSO 10 mM 10 uM 10 dk mikrofona stabilizerotubules
Binucleine 2 DMSO 25 mM 25 uM 20 dakika Aurora B kinaz 10 inhibe

Tablo 2: İlaç tedavisi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada tarif edilen metodlar mayoz üç aşamadan (Şekil 1) temsil eden geç evre Drosophila oosit toplama neden olur. Profaz Oositler karyosome (Şekil 1A) çevreleyen bölgede tübülin sinyal eksikliği ile görünür çekirdek zarfına varlığı ile ayırt edilir. Prometafaz nükleer zarf arıza sırasında iğ monte ediyor sonra dönemdir. Prometafaz sırasında karyosome, farklı bir şekil alır, ana karyosome kütlesi (Şekil 1B) ayrı 4. kr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Drosophila Oositler evreleme

bir ince uzun karyosome genellikle metafaz oositlerden prometafaz ayırt karyosome şeklini kullanarak, prometafaz oositlerinde görülmekle birlikte sorunlu olabilir. prometafaz sırasında, karyosome, yuvarlak bir şekil olarak başlar uzar ve daha sonra oosit metafaz tutuklama yaklaştıkça bir yuvarlak şekle geri çekilir. Bu, pek çok prometafaz oositler uzatılmış karyosome yok demektir. mutant ya da ilaçla tedavi oosit incelendiğinde ek olarak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

CENP-C antikorunu sağladığı için Christian Lehner'e ve FISH önerileri için Eric Joyce'a teşekkür ederiz. McKim laboratuvarındaki çalışmalar, NIH'den (GM101955) bir hibe ile finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ml konik tüplerÇeşitli
% 16 formaldehitTed Pella, Inc.18505TEHLİKELİ; Açıldıktan sonra bir ay sonra atın
250 ml beherlerÇeşitli
5 ml'lik tüplerÇeşitli
aktif kuru mayaBirmacun yapmak için çeşitli su ile karıştırın fıstık ezmesi
SigmaB1186TEHLİKELİ
blenderÇeşitli
sığır serum albüminiSigmaA4161
kalsiyum klorürÇeşitli
kolşisinSigmaC-9754TEHLİKELİ
lamellerVWR48366-227No. 1 1/2
dekstran sülfatÇeşitli
DMSOÇeşitli
EGTAÇeşitli
etanolÇeşitli
forsepsTed Pella, Inc.5622Dumont cımbız yüksek hassasiyetli sınıf stil 5
formamidSigma47670-250ML-F
cam slaytlarVWR48312-003
glikozÇeşitli
dereceli 1.5 ml tüplerÇeşitli
HEPESVWREM-5330çeşitli satıcılardan temin edilebilir
Hoechst 33342Çeşitli
magnezyum klorürÇeşitli
metanolÇeşitli
büyük ağ (~ 1.500 & mikro; m)VWRAA43657-NKçeşitli formatlar ve diğer tedarikçiler, 12 veya 14 gözenekli
küçük ağ (~ 300 ve mikro; m)Spektrum laboratuvarları146 424çeşitli formatlar, örneğin , 146 422 veya 146 486
nutatörÇeşitli
Pasteur pipetleriÇeşitli
potasyum asetatÇeşitli
Kakodilik asitSigmaC0125TEHLİKELİ; Alternatif olarak, sodyum kakodilat potasyum ile ikame edilebilir
hidroksitÇeşitli
sodyum asetatÇeşitli
sodyum klorürÇeşitli
sodyum sitratÇeşitli
sodyum hidroksitÇeşitli
sükrozÇeşitli
taksol (paklitaksel)SigmaT1912TEHLİKELİ
Triton X-100FisherPI-28314
Tween 20FisherPI-28320
girdapÇeşitli
anti-&alfa;-tubulin antikoru FITC Sigma F2168 klonu DM1A Binucleine 2 ile konjuge edilmiştir

Kaynaklar

  1. Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
  4. Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
  5. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
  6. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544(2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).
  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
  11. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  12. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  13. Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
  14. Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
  15. Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
  16. Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İğ İplikleri DüzeniKromozom DavranışıMembran UzaklaştırmaİmmünofloresanKonfokal MikroskopiAntikor PenetrasyonuOosit FiksasyonuKaryozom Analizi
Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.