Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronları kullanarak nöronal morfolojilerinden Çalışmaları Immünofloresan nöronal ve epidermal proteinlerin in situ görselleştirme yarar. Larva vücut duvarı kas dokusu kaldırarak da nöronlar ve çevresindeki epidermal hücrelerin immünoflüoresans analizi artıran bir prosedür açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronların nöronal morfolojilerinden mekanizmaları araştırmak için popüler bir modeldir. Da nöronlar böylece epidermal inerve ettikleri hücreleri ve immünofloresan hem nöronal ve epidermally ifade edilen proteinlerin in situ görselleştirme kendi analiz yararları ile iletişim gelişir. immünofloresan deneyleri için larva filetosu hazırlamak geleneksel yöntemler nöronal ve epidermal proteinleri görüntüleme için çeşitli zorluklar sunarak, vücut duvarının en kapsar kas dokusu bozulmamış bırakın. Burada Drosophila larva filetosu gelen kas dokusunu çıkarmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, aksi takdirde kas dokusu tarafından gizlenmiş olan proteinlerin görüntüleme sağlayan sinyal gürültü oranını artırır ve da nöron gelişimini incelemek için süper çözünürlük mikroskobu kullanımını kolaylaştırır.
Giriş
Drosophila larvalarının dendritik arborization (DA) nöronları dolayı genetik manipülasyona amenability ve görüntülenebilir kolaylığına nöronal gelişim çalışmak için değerli bir model sunmaktadır. Bu duyusal nöronlar dendrit morfolojilerinden 1-3 kontrol sayısız yolların belirlenmesinde etkili olmuştur.
da nöronların dört sınıfları (sınıf I - IV) larva epidermis innerve. Bu nöronlar kendi dendritler büyük ölçüde iki boyutlu diziler 4,5 oluşturan, bazal membran ve epidermis arasında yalan. Dört sınıfların, sınıf IV da nöronların diğer hayvanların duyusal nöronlar gibi en çok dallı milleri ve sahip, bu milleri detaylandırılması onların gelişiminde 6-9 komşu dokulardan içsel faktörlerin yanı sıra kuyruklar, özellikle epidermis gerektirir .
Çalışmalar nasıl böyle nöronal ve ekstra nöronal gerçeği belirlemek içinors Immünofloresan in situ protein ifade algılamak için yeteneği dendrit morfolojilerinden fayda kontrol eder. Larva dış kütikül antikorlara aşılmaz, ama bu engel kolayca köklü diseksiyon yöntemlerinin 10,11 ile larva filetosu hazırlanması ile aşılır. Ancak, bazal membran sadece iç yatıyor vücut duvarı kas dokusu da nöron ve epidermal hücrelerin görselleştirme yönelik çeşitli zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kas dokusu, vücut duvarının en çizgileri, büyük ölçüde nöronal veya epidermal dokudan kaynaklanan floresan sinyalleri örttüğü. Bu esas olarak örnek sinyal gürültü oranını azaltır. İkinci olarak, çok sayıda alakalı proteinler kas dokusu, hem de nöronlar veya epidermis eksprese edilebilir. Bu, kas kaynaklı floresans sinyali nöron veya epidermis bir floresans sinyalinin daha belirsiz algılama muhtemeldir. Son olarak, mikroskopi teknolojilerinde gelişmeleralt difraksiyon çözünürlükte numune B izin görüntüleme ve epidermal hücrelerin 12,13 nöronlarda ifade edilen proteinleri lokalizasyonu ayırt ve çevresindeki özellikle yararlı olabilir. Ancak gürültü oranı ve lamel numune yakın güçlü bir sinyal süper çözünürlük mikroskopi faydaları aracılığıyla görüntüleme. sinyal gürültü oranını azaltmak için ek olarak, larva vücut duvarı kas mesafeleri böylece süper çözünürlük mikroskobu yöntemlerle elde edilebilir, geliştirilmiş görüntü çözünürlüğü sınırlayıcı lamel gelen da nöronlar. immünofloresan analizi için zorluklar yanında, kas dokusu larva vücut duvarı duyusal nöronlardan elektrofizyolojik kayıt için bir engel sunar. Onun kaldırma bu nedenle duyu nöronlarının 14 nörofizyolojik manipülasyon yararlanır.
Burada Drosophila larvalarının kas dokusunun elle çıkarılması için bir yönteme ilişkindir açıklanmaktadır. Bizim protokol p göstermektediraksi kas dokusu tarafından bulanıklaştırılmaktadır proteinlerin ermits immünofloresan görüntüleme, sınıf IV da nöronlar görselleştirilmesi için sinyal gürültü oranını iyileştirir ve daha da nöronlarda protein ve hücresel yapıların mekansal ilişkileri ayırmak için süper çözünürlük mikroskobu kullanılmasını sağlar ve epidermis.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: kas kaldırma (Şekil 1) için prosedür larva fileto hazırlanması için daha önce tarif edilen yöntemlerin bir modifikasyonudur. Önce ve kas kaldırılmasını takip adımlar kısaca özetlenen ve okuyucu daha detaylı açıklamalar için önceki çalışmaların 10, 11 anılır.
Soğuk tuzlu su içinde 1 Dissect Larva
- Soğuk HL3.1 tuz 15 veya soğuk Ca 2 + içermeyen HL3.1 tuzlu 11 (Tablo 1) bir çalışma seyreltme hazırlayın. çanak alt kapak için yeterli, soğuk tuz ile bir silikon elastomer çanak larva yerleştirin.
NOT: tuzlu seçimi ile ilgili Tartışma bakın.
| 1x HL3.1 tuzlu su (pH 7.2) |
| 5 mM HEPES |
| 70 mM NaCI |
| 5 mM KCI |
| 1.5 mM CaCl2 (Ca 2 + içermeyen tuzlu için ihmal) |
| 4 mM MgCl2 |
| 10 mM NaHCO 3 |
| 5 mM trehaloz |
| 115 mM sükroz |
| 4 ° C'de filtre sterilize ve mağaza |
| Not: hemolimf böcek Kompozisyon taklit |
Soğuk Tuzlu Tablo 1. Bileşimi.
- ventral yüzü yukarı bakacak şekilde larva yerleştirin. larva ventral yüzeyi anteriordan posterior çalışan birincil larva trakea tüpler tarafından karın Dentical kemer ve sırt tarafında ile tespit edilebilir. ön-arka yönde larva gerin ve bir baş ve kuyruk pinböcek pimleri kullanarak çanak diseksiyon silikon elastomer. bir ucunda başlayan ve diğer doğru ilerlemektedir, ventral orta hat boyunca kesmek için ince diseksiyon makas kullanın.
NOT: Bu yönelim da nöronların yaygın çalışılan dorsal küme korur. - Larva açık kesildikten sonra, bir kitap açma gibi diseksiyon çanak dört köşe pin. MSS, gut, ve trakea gibi iç organları kapmak ve çıkarmak için forseps kullanın. fileto gergin ama maksimum gerilir böylece böcek işaretçilerine ayarlayın.
NOT: Kaslar segmental sınırları vücut duvarına bağlı kalır. kas gövde duvarının en kapak rağmen, sırt orta çizgisi yakınındaki dar bölgede mevcut değildir.
2. Kas Kaldırma
- kas dokusu yoktur larva, dorsal orta hat bulun. Bu en düz olan oryantasyon kas dokusunun altında eklenir öyle ki tek bir forseps çatal yerleştirin.
- Buradan başlayarakdorsal orta hat, segmentinde ön sınırına yakın, dikkatli forseps ve epidermis arasındaki teması en aza indirmek için özen kas ve epidermis arasında forseps çatal kaydırın.
- bir çapa noktada vücut duvarına kas eki kırmak için yukarı forseps çekin. ilgi kalan hemi-segmenti (ler) için bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Bu protokol, her da nöron dendrit alanının arka korunması optimize eder. dendrit alanın ön kısmını korumak için, her segmentin arka ucundaki forseps çatalı eklemek için en iyisidir. - larva fileto maksimum her yöne gerilir şekilde böcek pimleri tekrar ayarlayın.
- yine de, 25 dakika süreyle PBS içinde soğuk taze hazırlanmış% 4 formaldehit ile kesme çanak tutturulmuş iken fileto düzeltildi.
- PBS 5 kez durulayın.
- conta en aza indirmek için özen dikkatle kalan bağlantı noktalarından kas dokusu çekmeye için forseps kullanabilirepidermis ile ct.
- Sabitlemesini ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne diseksiyon çanak fileto çıkarın. Daha önce 11 açıklandığı gibi, sonraki tüm yıkama, engelleme ve immünofloresan boyama adımları uygulayın.
3. Dağı Larva Fileto
- İlk mümkün olduğunca örnek olarak düz hale getirmek için ince diseksiyon makas kullanarak baş ve kuyruk çıkarın. Lamel bakan fileto iç yüzeyi ile antifade mountant bir lamel fileto monte edin.
- lamel bir mikroskop lamı yerleştirin ve montaj orta dağıtmak için hafifçe bastırın. üzerinde bir mikroskop lamı çevirin ve tırnak cilası kullanarak slayt lamel mühür. Slaytlar, en az bir ay süreyle -20 ° C'de saklanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Birlikte zar işaretleyici ile etiketlenmiş sınıf IV da nöronlar ile Septat birleşme proteinleri Coracle (Cora) ve Diskleri-büyük (DLG) co-görselleştirmek için immünofloresan deneylerinde sinyal gürültü oranını artırmak için, kas kaldırma prosedürü yararını göstermektedir CD4 tdTomato.
Cora önce da nöron dendritler epidermal hücreler tarafından alınmış ve da nöronun morfogenezine ve fonksiyonu ile ilişkili olarak ele 4,6-9,16 dendritlerindeki olan b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İşte bir protokol Drosophila larva filetosu kas dokusunun elle çıkarılması için açıklanmıştır. Bu protokol daha önce larva diseksiyon teknikleri 10,11 tarif değiştirir. Larva bir silikon elastomer çanak disseke sonra, dorsal orta hat yer almaktadır. Tek bir forseps uçlu olarak, en düz mümkün olan yönde, dikkatli bir şekilde dorsal orta hattın yakınlarındaki, kas dokusu ve epidermis arasına yerleştirilir. forseps yavaşça ilgi her larva segmentinde bir çapa noktasından ayrı kas dokusuna yukarı doğru çe...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz mikroskobu üzerinde yararlı tartışmalar için Gary Laevsky teşekkür ederiz. NIH tarafından finanse edildi Bu çalışma ERG R01GM061107 ve R01GM067758 verir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 cımbız | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 72701-D | |
| Mikro Makas, 8 cm, düz, 5 mm bıçaklar, 0,1 mm uçlar | Dünya Hassas Aletler | 14003 | |
| Sylgard 184 silikon elastomer kiti | Dow Corning | 3097358-1004 | diseksiyon plakaları için |
| Austerlitz böcek pimleri, 0,1 mm | Güzel Bilim Araçları | 26002-10 | |
| Fostec 8375 ışık kaynağı | Esnaf Teknoloji Grubu | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Mikroskopi | ||
| Vectashield antifade montaj ortamı | Konfokal mikroskopi için | Vektör Laboratuvarları | H-1000 |
| Prolong Elmas antifade mountant | Yapısal aydınlatma mikroskobu için | Life Technologies | P36970 |
| Mikro kapak camı, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus mikroskop slaytları, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Fare anti-Coracle antikoru | Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank | C615.16 | süpernatant, seyreltik 1:50 |
| Fare anti-Diskleri büyük antikor | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 4F3 | süpernatant, seyreltik 1:50 |
| Tavşan anti-dsRed antikoru | Clontech | 632496 | 1:1.000 |
| Keçi anti-tavşan antikoru, Alexa Fluor 568 konjuge | ThermoFisher Scientific | A-11011 | seyreltik 1:1.000 |
| Keçi anti-fare antikoru, Alexa Fluor 488 konjuge | ThermoFisher Scientific | A-11001 | seyreltik 1:500 |
Kaynaklar
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111(2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
