Yöntem makalesi

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

DOI:

10.3791/54673

⸱

11 Kasım 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sirkadiyen saatler günlük çevresel değişimleri öngörerek dış dünyaya bir uyum sağlayarak, tüm ışığa duyarlı organizmalarda işlevseldir. sirkadiyen saat ve fizyoloji çoğu yönleri arasında sıkı bir bağlantı anlayışımızda önemli ilerleme son on yılda bu alanda yapılmıştır. Ancak, insanlarda sirkadiyen osilatör işlevini temelini moleküler temelini çözülüyor yüksek teknik meydan kalır. Burada, kültürlü insan primer hücrelerinde uzun süreli (2-5 gün) biyolüminesans kayıt ve çıkış ortamı koleksiyonu için deneysel bir yaklaşım ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu amaçla, hormon sekresyonu ve sirkadiyen biyolüminesans paralel değerlendirmeye olanak sağlayan bir çekirdek saat gen promotörünün kontrolü altında bir lentiviral lusiferaz raportör ile birincil hücreler transdüksiyona var. Ayrıca, pr sirkadiyen saat bozan koşullarını tarifsiRNA hedef SAAT transfekte edilmesiyle imary insan hücreleri. insan pankreatik adacıkların insülin salgılanmasının sirkadiyen düzenleme ile ilgili sonuçlar, insan iskelet kası hücreleri tarafından myokine salgılanması, bu yöntemin uygulanmasını göstermek için sunulmaktadır. Bu ayarlar, insan periferal saatler moleküler makyaj çalışma ve fizyolojik veya patofizyolojik koşullarda primer hücrelerde fonksiyonel etkisini analiz etmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(Latince "Circa diem" dan) sirkadiyen zamanlama sistemi Dünya'nın dönüşüne adaptif mekanizma olarak, tüm ışığa duyarlı organizmalarda ortaya çıkmıştır. Memelilerde, bu ventral hipotalamusun suprakiazmatik çekirdeğinde yer alan merkezi saat, kapsayan, hiyerarşik bir şekilde organize edilir ve periferik (veya köle) farklı organlarda ameliyat olan osilatörler. Ayrıca, bu hücre bağımsız kendini sürdüren osilatörler gövdesinin 1 neredeyse her hücrede işlevseldir. SCN kaynaklanan sinirsel ve humoral sinyaller periferik saatler reset ise photic sinyaller, SCN nöronlar için baskın bir senkronizasyon ipucu (Zeitgeber) temsil eder. Dönüş besleme-açlık döngüleri sürücü ekleme dinlenme-faaliyet ritimleri, içinde, çevresel saatler 2 hakkında daha fazla synchronizers vardır. Mevcut anlayışa göre, çekirdek saati moleküler makyaj transkripsiyon ve abancı dayanmaktadırorganizmalar arasında muhafaza edilir tional geri besleme döngüleri. Bu arada negatif çekirdek saat PER ve CRY genlerin transkripsiyonunu aktive transkripsiyonel aktivatörleri BMAL1 ve SAAT içerir. PER ve Cry proteinlerinin yüksek seviyede BMAL1 / SAAT kompleksinin inhibisyonu yoluyla kendi transkripsiyonunu inhibe edecektir. Yardımcı bir halka da BMAL1 ve saat transkripsiyonu düzenleyen nükleer reseptörler REV-Erbs ve Oto- oluşur. Ayrıca, fosforilasyon, sumoylation, asetilasyon, O-GlcNAcylation, bozulması ve çekirdek saat proteinlerinin nükleer girişi de dahil olmak üzere posttranslasyonel olaylar 24 saat salınım döngüsü 3 kurulmasında bir ek önemli düzenleyici katmanı temsil etmektedir.

Biriken deliller kemirgen modellerinde çalışmalardan kaynaklanmaktadır ve metabolik ve endokrin fonksiyonların 4-5 koordinasyonunda sirkadiyen sistemin kritik rolünü vurgulamaktadır. larg bir sayıaçlık döngüleri periferik osilatörler 6-8 senkronizasyonu merkezi bir rol oynar - e-ölçekli transcriptome analizi besleme öneririz. Bu çalışmaların bir uyumlu olarak, kemirgenlerde ve insanlarda metabolomic ve lipidomic analizi metabolitlerin çok sayıda sirkadiyen şekilde 9-11 doku, plazma ve tükürük salınım olduğunu ortaya koymuştur. Önemlisi, çoğu hormonlar kan 5,12-13 sirkadiyen ritimleri gösterirler. Ayrıca, periferik doku üreten karşılık gelen hormonun sirkadiyen saatler yerel hormon salgılanmasını düzenleyen olabilir. Hücre özerk sirkadiyen osilatörler kemirgen ve insan pankreas adacık hücresi 14-16 de tarif edilmiştir. Bu osilatörler pankreas adacık transcriptome düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir ve 15,17-18 çalışır. Bundan başka, insan iskelet miyotüplerinin göre myokine salınımı en son hücre özerk oscillato düzenlenmiş olan bir sirkadyen desen sergilediği gösterilmiştirBu hücrelerde 19 ameliyat rs.

In vivo olarak, insanlarda sirkadiyen ritimler incelemek için çeşitli yaklaşımlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, (referanslar 3,20 gözden) plazma melatonin veya kortizol seviyeleri yanı sıra göğüs deri yüzeyi sıcaklığı endojen sirkadiyen saatler değerlendirmek için çalışılmıştır. Bu yöntemler, in vivo sistemik sirkadiyen salınımlar okuyan izin rağmen, çok farklı organ ve dokularda serbest çalışan özerk sirkadiyen ritim güvenilir bir değerlendirme sağlayarak vardır. Bununla birlikte, sistemik yönetmelik böyle diseksiyon bu hücrelerin fonksiyonu hücre içi moleküler saatlerin belirli etkisini anlamak için vazgeçilmez bir araç olacaktır. Bu nedenle, önemli bir çaba in vitro senkronize immortal veya primer kültür hücrelerinde insan saatler çalışmak için güvenilir yaklaşımlar geliştirmeye taahhüt edilmiştir. Daha da önemlisi, bu gösterilmiştirkültürlü birincil deri fibroblast hücreleri ölçülen saat özellikleri yakından tüm organizmanın 21 bireysel saat özelliklerini yansıtmaktadır. Floresan ve bioluminescent sirkadiyen gazetecilere gelişimi büyük ölçüde bu yaklaşımı 22-27 ilerlemiştir. Ayrıca, farklı çevresel organlar türetilir okuyan birincil hücre saatler insan dokusuna-özgü saatler 3,5,16,19-20,28 moleküler özelliklerinin araştırılması için izin verir. Bu nedenle, in vitro olarak senkronize primer eksplantlar ya da hücrelerde gündelik saatler değerlendirilmesi biyolüminesens muhabir kullanılarak, molekül insan periferik saatlerin makyaj ve organ fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için oldukça yararlı bir yöntemi temsil eder.

Bu yazıda, özerk hücresel saatin etkisi yanı sıra in vitro senkronize insan primer adacık ve iskelet kası hücrelerinde sirkadiyen gen ifadesini değerlendirmek için ayrıntılı protokoller sunacakBu hücrelerin salgı fonksiyonu bozulması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik bildirimi: Bu protokolde yer manipülasyonlar Cenevre Üniversitesi Hastanesi Etik Komitesi tarafından ve Etik Kurulu SUD EST IV (Anlaşma 12/111) 19 tarafından onaylanmıştır. Ticari bir kaynaktan referans 16,18 bize tarif ya da elde edilen insan adacıklar Cenevre Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi (İsviçre) Adacık Transplantasyonu Merkezi'nde beyin ölümü çoklu organ donörlerin pankreaslarından izole edilmiştir.

Primer Hücre Kültürü 1. Hazırlık

  1. İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu, Ayrışma ve Kültür
    Not: kat Connaught Tıbbi Araştırma Laboratuarları (CMRL) hücre malzemenin önemli bir kayba neden olabilir plastik yüzeye, yapışmasını adacıkları veya doku adacığı hücre önlemek amacıyla orta her tüp, plastik uç veya pipet.
    1. hücre ayrışma laminin-5-zengin hücre dışı matriks 1 ml ekleyin adacık bir gün önce (descri olarak 804G hücrelerinden elde edilen3.5 cm çanak başına referans 29) yatak. hücreleri kaplama önce, matris aspire ve steril bi-distile su ile çanak 3 kere yıkayın. çanak, 5 dakika boyunca laminer akış kabini altında kurumaya bırakın.
    2. Laminer akış kabini içinde, 15 ml tüp (lar) içine CMRL ortamında elde edilen adacıklar dağıtın. 5 dakika boyunca 272 x g'de santrifüjleyin.
    3. kalsiyum ve magnezyum olmadan 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış süpernatanı havalandırın, ve daha sonra steril Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml (DPBS) içinde pelletini. 5 dakika boyunca 272 x g'de santrifüjleyin.
    4. Süpernatant aspire ve DPBS 1 ml hücre pelletini.
    5. Yeni 3.5 cm çanak içine adacıklar, pipet, 1 ml adacık süspansiyonu 10 ul toplam sayısını saymak için. mikroskop altında 10 ul damla adacıklar sayısını ve bu 1 ml adacık süspansiyon içinde adacıklar toplam sayısını hesaplayın. DPBS 14 ml ekleyin ve hücre süspansiyonu santrifüj bir daha5 dakika boyunca 272 x g'de saat.
    6. Adacık hücre ayrışma için, süpernatant aspirat ve 1000 adacık eşdeğerleri (IEQ) maksimum hücre dekolmanı solüsyonu 1 ml ekleyin. 37 ° C'de su banyosunda tüp yerleştirin ve yavaşça 6-10 dakika boyunca, her dakika kadar pipetleme ve birkaç kez aşağı adacıklar karıştırın.
      NOT: Bir bardak slayt süspansiyon 2 ul damla pipetlemeyin ve tüm hücreleri de ayrılır mikroskop altında kontrol sindirim kalitesini kontrol etmek ve hiçbir çiftlerin ya da hücre kümeleri kaldığını.
    7. takviyeleri (% 10 fetal bovin serumu (FBS),% 1 soğuk CMRL 14 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 penisilin-streptomisin (P / S),% 1 gentamisin, 1 % sodyum piruvat). 5 dakika boyunca 425 xg'de santrifüj. Süpernatant aspire ve hücre pelletine CMRL ortamında 15 ml ekleyin.
    8. takviyeleri CMRL küçük hacimde pelletini. Bir hemocyto kullanarak mikroskop altında hücrelerin sayısınımetre, ~ 650, 000 hücre / ml'lik bir hücre konsantrasyonunu elde etmek amacıyla CMRL ses seviyesini ayarlamak.
    9. Pipet 3 3,5 cm tabak laminin ile önceden kaplanmış aşama 1.1.8 'de elde edilen dağılmış hücre süspansiyonundan 100 ul her bir damla ayrıldı.
      NOT: Hücreler yaklaşık 24 saat içinde çanak eklemek.
    10. Nemli bir oda içinde, 37 ° C'de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, hücreler (Şekil 1A) inkübe edin. Her bir damla 100 ul aspirasyon ve taze ortam ile aynı hacmi ile değiştirerek hücre ortamı, her 2-3 günde damla değiştirin.
  2. Myotubes İnsan İlköğretim Miyoblast Kültür ve Farklılaşma
    1. Doku biyopsisi, uydu hücre izolasyonu ve myoblast kültürü
      Not: Kas biyopsileri Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Fransa) 19 grubu elde edilmiştir.
      1. Daha önce tarif edilen prosedüre 30'a göre primer iskelet miyoblastlar saflaştınlır.
    2. Farklılaşan pmyotubes rimary insan miyoblastlar
      1. Sıvı azot içinde saklanır, insan iskelet hücreleri bir vial (1 x 10 6 hücre) almak ve çalkalama ile 37 ° C'de bir su banyosu içinde 30 saniye ile 1 dakika için flakon koyarak hücrelerin hızlı bir şekilde eritin.
      2. oluşan büyüme ortamı 24 ml pipetleyin hücreleri (1 mi) HAM F-10,% 20 FBS,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B ile desteklenmiş
      3. 150 x g'de santrifüje 5 dak.
      4. 2.5 x 10 5 hücre başına taze büyüme ortamına 15 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
      5. F75 yapışık şişesi ortalama plaka en az 2.5 x 10 5 hücre. CO2 37 ° C'de bir hücre kuluçka makinesi içinde miyoblastlar tutmak ve% 5.
      6. Hücreler% 60-80 konfluense ulaştıktan sonra, 1-2 dakika boyunca tripsin-EDTA% 0.05 hücreleri ayırmak ve yapışkan 3,5 cm petri çanakları üzerine büyüme ortamına 2 ml bunları plaka.
      7. kaynaşmaya eriştikten sonra, büyüme ortamı çıkarın.
      8. farklılaşma proto başlatkültürlenerek myotubes insan miyoblastların sütun 2, 1 g / L glükoz,% 2 FBS,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B (farklılaşma ortamı) ihtiva eden Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde mi 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde bir hücre kuluçka makinesi içinde. her 2 ila 3 gün orta değiştirin.
        NOT: myotubes genellikle 7-10 gün içinde oluşur.
      9. -Çekirdekli miyotüplerinden 19 içine miyoblastların füzyon gözlemleyerek mikroskobu (Şekil 2A) altında kas hücre farklılaşması kontrol edin.

2. Küçük müdahale edici RNA (siRNA) Transfeksiyon

  1. İnsan adacık hücresi siRNA Transfeksiyon
    Not: transfeksiyon protokolü hücre ayrılma sonraki gün 100 ul (1.1.1-1.1.10 adım) damla damla gerçekleştirilir.
    1. Her açılan CMRL ortamında aspire 100 ul serumsuz minimum temel ortam (MEM), 2 saat aynı hacimde ile değiştirinpipetleme transfeksiyondan önce.
    2. Bir MEM bazlı transfeksiyon ayıracı karışımı ve hedef siRNA (siClock) ya da 50 nM, 50 nM Hazırlama üreticinin talimatlarına göre siControl olmayan hedefleme.
      1. 3 damla bir tabak için MEM, her biri 200 ul olan iki 1.5 ml tüpler hazırlanır.
      2. Bu tüplerin transfeksiyon reaktifi 4 ul birine eklemek.
      3. Uygun siRNA stok solüsyonu (20 mM) ikinci tüp 1 ul ekleyin.
      4. 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde yavaş bu iki boruyu karıştırın ve daha sonra birlikte tüplerin içerikleri karıştırmak ve 20 dakika daha çalkalayın.
    3. Aspire 100 her damlasında MEM ul ve pipetleme önceki adımda elde edilen transfeksiyon karışımı aynı hacimde ile değiştirin.
    4. 37 ° C'de inkübasyon 4 saat sonra CMRL ortamında transfeksiyon solüsyonu değiştirin. Adımları tekrarlayın 2.1.1-2.1.3 hücre yeniden transfeksiyon için ertesi gün.
  2. İnsan miyotüplerinin siRNA transfeksiyonu
    1. Transfeksiyondan önce, 3.5 santimetrelik bir petri tabağı başına taze farklılaştırma ortamının 2 ml ortam (adım 1.2.2.8 bakınız) değiştirin.
    2. Steril 1.5 ml'lik bir tüp içinde, 20 uM siRNA çözeltisi 2.4 ul ve farklılaştırma ortamının 100 ul seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi 12 ul karşılık gelen 20 nM siRNA (siControl ya siClock) 'in bir karışımı hazırlayın. Hafifçe çalkalama ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti inkübe edin.
    3. 37 ° C 'de, bir doku kültür inkübatörü içine 3.5 cm petri ve yeri hücre başına siRNA karışımı 114.4 ul% 5 24 saat boyunca CO2 ile transfekt hücre.

3. Sürekli Uzun vadeli Sirkadiyen Biyoparlaklık Kayıt Yaşayan İnsan İlköğretim Hücreleri Hormon salgısını Değerlendirilmesi ile paralel olarak gerçekleştirilen

  1. İnsan Primer Hücre içine Sirkadiyen Biyolüminesans Gazeteciler Tanıtımılentiviral İletimi
    NOT: lentiviral parçacıkları ile tüm işlemler personeline ve çevreye ılımlı bir potansiyel tehlikesi ajanlar ile çalışmak için ek önlemler almak için biyogüvenlik düzeyi 2 tesis yapılmalıdır.
    1. Tarafından muhabir lentiviral parçacıkları hazırlayın eş transfecting faiz pLenti6.4 vektörü / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc veya pLV156-Per2-dluc (sırasıyla denilen Bmal1-luc ve Per2-luc,) lentiviral vektörler pMD2G ile plazmid 31 ve polietilenimin yöntemi kullanılarak 293T hücrelerine psPAX (ayrıntılı prosedür için referans 16).
    2. (Titrasyon ile ilgili detaylar http://lentilab.unige.ch/ elde edilebilir) elde lentiviral parçacıkları titre edilir. Daha fazla deneyler için, titreleri 10 5 nakleden birimlerine [TU / ul] olarak 10 4 arasında değişen lentiviruses kullanın.
    3. laminar flow kabin içinde insan adacık hücreleri veya (% 30-50 confluency), insan iskelet hücreleri ile yer yemeklerive taze katkılı CMRL ortamında 2 ml orta yerine, sırasıyla, ya da büyüme ortamı (adım 1.2.2.2 bakınız) (adım 1.1.7 bakınız).
    4. Enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) (birimleri transducing yani bulaşıcı parçacıklar () hücre / sayı) hesaplayın.
    5. MOI = 3 elde etmek üzere çanak lentivirüs çözelti pipetleme birincil hücre kültürü transdüksiyonu (örneğin, 65,000 ekli hücreler 6.5 x 10 4 100 ul ortam damla titreye sahip bir virüs çözeltisi 3 ul).
    6. bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün orta değiştirin.
      Not: raportör yapısının yeterli ekspresyonunu elde etmek için, en az 4 gün önce biyoışıldama kayıt insan doku adacığı hücreleri nakletmek. Miyoblastlar sonra izdiham büyüdü, genleşme aşamasında transduced ve daha sonra myotubes ayrılır.
  2. İnsan İlköğretim hücrelerin Vitro eşitleme
    1. , daha önce adım 3.1.5 transdüksiyona birincil hücreler içeren 3.5 santimetrelik bir petri tabağı başına ortam, 2 ml 10 uM adenilil siklaz aktivatörü ekleyin.
    2. bir hücre kültür inkübatörü içinde 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
    3. 100 mcM luciferase içeren kayıt ortamının 2.5 ml adenilat siklaz aktivatörü içeren orta değiştirin.
      Not: İnsan adacık hücresi kullanmak için CMRL% 10 ile takviye edilmiş FBS,% 1 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 1 gentamisin; İnsan miyotüpleri, kırmızı fenol kullanım için - 1 g içermeyen DMEM / L glikoz,% 2 FBS ile takviye% 2 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B

Senkronize İnsan Salgı İlköğretim Hücrelerinde Sirkadiyen Biyoparlaklık Kayıt ve Hormon salgılanması Profilleri 4. Paralel Değerlendirme

  1. İnsan Primer Hücreleri Uzun vadeli sabit perifüzyon ve Biyoparlaklık Kayıt Kurma.
    NOT: Çalışma çıkışlarılaminar flow kabini, temiz, tüm temas yüzeylerini ide ve kontaminasyonu önlemek için havaya kültürleri ya da orta maruz kalma sınırı.
    1. , Perifüzyon orta hazırlamak ortama lusiferinin 100 mcM eklemek için.
      Not: İnsan adacık hücresi kullanmak için CMRL% 10 ile takviye edilmiş FBS,% 1 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 1 gentamisin; İnsan miyotüpleri, kırmızı fenol kullanım için - 1 g içermeyen DMEM / L glikoz,% 2 FBS ile takviye% 2 L-alanil-L-glutamin dipeptit,% 1 P / S,% 0.5 gentamisin ve% 0.2 amfoterisin B
    2. Laminer akış kabini içinde, yukarıda tarif edildiği gibi, transduse transfekte edilmiş ve senkronize primer hücre kültürleri (islet hücreleri ya miyotüpleri) ihtiva eden 3.5 cm yemekler açın. Silikon akını / akış bağlantı boruları (Şekil 1B1 / B5) ile donatılmıştır 3,5 cm yemeklerin içine (evde geliştirilen) steril metalik kapaklar (Şekil 1B2) yerleştirin.
    3. 37 ° C l ölçüm platformu üzerinde yemekleri yerleştirinight geçirmez inkübatör. Bir vidalanabilir adaptörü (Şekil 1B3) kullanarak platforma yemekleri sabitleyin. Kapak (Şekil 1B1 / B5) uygun bir silikon tüp içine perifüzyon sisteminin akını / akış tüpleri yerleştirin ve ~ bir akış oranında 1 saat başına 0.5 ml ortamda pompa hızını ayarlayın.
    4. photomultiplier tüp (PMT) detektörü gelen sinyalleri kaydeder in-house geliştirilen Damla-biolumicorder yazılımını açın. veriler saklanır ve "start" ikonuna tıklayarak her yemeğin kayıt sürekli biyoparlaklık başlayacaktır dizini seçti.
      NOT: Alternatif Damla biolumicorder yazılımı, diğer programlar (örn LumiCycle), PMT detektörü gelen sinyalleri kaydetmek için kullanılabilir.
    5. Buz üzerinde toplama kutusu steril 6 oyuklu doku kültür plakaları yerleştirin.
    6. toplama kuyuları arasında otomatik şalter zamanlamasını kontrol eden kontrol yazılımı açın. zaman w kurmakorta koleksiyonu (sn) Doq. çıkış ortamının her 4 saatte (14,400 saniye; zaman noktası başına ~ 2 ml) koleksiyonu Başlat "run" ikonuna tıklayarak.
    7. pipetle steril 2 ml tüpler içine her bir koleksiyonundan çıkış ortamı aktarın ve ölçün. Bir sonraki adımı başlamadan önce bir -20 ° C derin dondurucuda tüpler tutun. Adımları tekrarlayın 4.1.5-4.1.6 her 24 saat.
    8. biyolüminesans kayıt ve ilgili yazılım üzerinde "dur" ikonuna tıklayarak, orta akışını durdurun. metalik kapaklarını çıkarın ve yemekleri artık orta aspire.
    9. Farklı deneylerde elde edilen salgılanmış protein değerlerini normalize ya özü DNA (miyotüplerinin 19 genomik DNA içeriği ile normalleştirme), ya da (adacık hücresi 18 için toplam hormon muhtevası ile normalizasyonu) liziz asit-etanol 1 ml tampon eklemek için yemekler.

Çıkışlar 5. Ölçüm Adacık Hormon ve Myokine DüzeyleriOrta İnsan İlköğretim Endokrin Hücrelerinin Sürekli perifüzyon tarafından elde

  1. ensülin
    1. üreticinin talimatlarına göre bir insan insülini, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti kullanılarak toplandı zaman noktalarından dışarı akış ortam içinde temel insülin düzeylerini ölçmek.
    2. Deneme (aşama 4.1.9) 18 sonunda asit-etanol ile muamele edilmiş hücreler elde her bir ve toplam insülin içeriği toplandı ve ortamın mutlak hacmi verileri normalize.
  2. İnterlökin-6 (IL-6)
    1. ölçmek Bazal, IL-6, üretici talimatlarına göre, bir insan IL-6 ELISA kit ile toplandı zaman noktalarından dışarı akış ortamında seviyeleri.
    2. Her kuyudaki ve deney (aşama 4.1.9) sonunda genomik DNA içeriği toplandı ve ortamın mutlak hacmi verileri normalize.

Biolumines 6. Sirkadyan Veri kümesi Analizleriartmasına neden olmuştur ve Hormon Salgı Profilleri

  1. biyoparlaklık Analizi
    1. Sağlanan yazılımı 19 kullanarak biyoparlaklık profilini analiz.
  2. JTK döngüsü analizi
    1. JTK_CYCLE algoritması 32 ile hormon salgılanması profilleri ve biyolüminesans kayıt sonuçlarını analiz.
    2. 20-24 saat sonra sirkadiyen dönem genişliğini ayarlayın.
      Not: Deney koşulları paralel kaydedilmiştir durumda, çifterli istatistiki analiz deneyleri karşılaştırma yapılabilir.
  3. CosinorJ Analizi
    1. Alternatif olarak, hormon salgılanması ve CosinorJ yazılımı 28 ile sirkadiyen biyoparlaklık profillerini analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

^ Ayılacağmı İnsan Adacık Hücreleri Paralel Sirkadiyen Biyoparlaklık Kayıt ile Adacık Hormon salgısını Değerlendirilmesi

Sirkadiyen saat bir ilk moleküler karakterizasyonu sağladıktan sonra, insan adacık hücresi 16 ameliyat, biz adacık fonksiyonu ve transkripsiyon 18 saat bozulma etkisini incelemeyi amaçladık. Sirkadiyen biyoparlaklık profil 18 ile ölçülen gibi etkin bir siClock transf...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen deney ayarlar daha sonra in vitro olarak senkronizasyonu ve birkaç gün biyolüminesans sürekli kayıt ve aynı hücreler tarafından hormon Paralel analizi takiben, kültürlenmiş insan primer hücrelere sirkadiyen biyoışıldama muhabir lentiviral teslimat oluşmaktadır. Bunlar moleküler mekanizmaları ve insan primer hücrelerinde sirkadiyen saatler fonksiyonel yönlerini keşfetmek için verimli bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Donör malzeme kalitesi canlı birincil doku kültü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Cenevre Üniversitesinden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz: Jacques Philippe bu işin üzerinde yapıcı yorumlarda bulunan, Ueli Schibler perifüzyon sisteminin gelişmesiyle birlikte bilimsel ilham paha biçilmez yardım için, tasarım, imalat ve devreye tasavvur ettikleri için André Liani perfüzyon sistemi, perifüzyon sistemi ve Damla biolumicorder yazılım geliştirme konusunda yardım almak için Lesa-Teknoloji LTD şirketi, George Severi perifüzyon deneyler ile yardım için, Ursula LOİZİDES-Mangold için kritik lentivirüs hazırlıkları için el yazması okuma ve Anne-Marie Makhlouf ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon ve Hubert Vidal (İNSERM, Lyon) insan primer miyoblastları hazırlamak için için; ve insan adacıklar sağlamak için Domenico Bosco ve Thierry Berney (İnsan Adacık Nakli Merkezi, Cenevre Üniversitesi Hastanesi) için. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe sayılı tarafından finanse edildi 31003A_146475 / 1, Sinergia İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe No CRSII3-154405, Fondation Romande la Recherche sur diabete, Bo Hjelt Vakfı, Fondation Ernst ve Lucie Schmidheiny ve Société académique de Genève (CD) dökün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tripsin-EDTAInvitrogen25300-054Kas biyopsisi sindirimi için
DPBS kalsiyum yok magnezyum yokInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021Miyoblast kültürü için
FBSInvitrogen10270Kültür ortamına takviye
Penisilin-StreptomisinSigmaP0781-100Kültür ortamına ek
GentamisinAkson A1492.0001Kültür ortamı
FungizoneInvitrogen15290-026Amfoterisin B'ye takviye, kültür ortamına
takviye DMEM 1g / L glikoz + Na piruvat + glutamax & nbsp;Invitrogen21885-025Miyotüp kültürü için
DMEM 1g/L glikoz -Na Piruvat - glutamaxInvitrogen11880-028LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-alanil-L-glutamin dipeptid, kayıt ortamına ek
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojileriAT-104Adacık hücresi ayrışması için hücre ayırma çözümü
CMRLGibco21530-027Adacık hücreleri için kültür ortamı
Sodyum PiruvatGibco11360-039Kültür ortamına ek
15 ml Yüksek Berraklıkta Polipropilen Konik TüpFalcon352096
F75 şişesiBD Falcon353136
3,5 cm Petri kabı BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Adenilil siklaz aktivatörü, senkronizasyon için kullanılır
LuciferinProlume LTD260150Kayıt ortamına
ek OptiMEM Invitrogen51985-026İnsan adacık hücreleri transfeksiyonu için kullanılan serumsuz Minimal Esansiyel Ortam (MEM)
Lipofektamin RNAiMAX reaktifiInvitrogen13778-150Transfeksiyon reaktifi
HiPerFect reaktifiQiagen301705Transfeksiyon reaktifi
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET artı hedeflemeyen siRNA #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Kan ve Doku Kiti Qiagen69504Miyotüpler için DNA ekstraksiyonu
RNeasy Plus Mini kiti ve nbsp;Qiagen74104Miyotüpler için RNA ekstraksiyonu
QIAshredder Qiagen79654Miyotüpler için RNA ekstraksiyonu
2 ml toplama tüpleriAxygen311-10-051Ortamı perifüzyon ile toplamak için
Doku kültürü Plakası, 6 KuyuluBD Falcon 353046ile besiyerini toplamak için
 Qiagen74034Adacık, RNA ekstraksiyonu için
İnsan IL-6 Anında ELISA kiti eBioscience88-7066-22
İnsan İnsülin Kiti MercodiaMercodia10-1113-01
Hidroklorik asit, min,%37,paAcros organics124630010Lizis tamponunun hazırlanmasında kullanılır (375 ml Etanol +% 7.5 HCl +% 117.5 H < alt > 2 < / alt >O)
Etanol (% >99.8)Fluka Analitik02860-1LLizis tamponunun hazırlanmasında kullanılır (375 ml Etanol +% 7.5 HCl +% 117.5 H < alt > 2 < / sub >O)
Prodo Laboratuvarlarıİnsan Adacıkları
Name< / strong> Şirket< / strong>Katalog Numarası< / strong>Comments< / strong>
Equipment: < / güçlü >
SantrifüjHeraeusMegafuge 1.0R
Su banyosuVWR1112A& nbsp; 37 & derecede; C
Tissu kültür davlumbazıDaha hızlı SafeFastElite
Tissu kültür inkübatörüHeraeusHeraCell 150%5 CO2 37 °C'de; C, LumiCycle kurulumu nedeniyle su yok
Tissu kültür inkübatörüHeraeusHeraCell 150%5 CO2 37 ° C'de; C, LumiCycle kurulumu nedeniyle su yok
Tissu kültür inkübatörüThermo ScientificHera Cell 150i%5 CO2 37 ° C'de; C
ShakerHeidolph InstrumentsUnimax 1010siRNA karışımının çalkalanması için
LumiCycleActimetrics
LumiCycle yazılımıActimetrics
CosinorJ yazılımıEPFLÜcretsiz olarak şu adresten temin edilebilir: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX ERC GmbHOtomatik anahtarın zamanlamasını kontrol eden kontrol yazılımı
için kayıt ortamı Perifusion RNeasy Plus Micro kiti , Araştırma için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95(2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049(2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023(2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376(2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyol minesans KaydLentiviral Transd ksiyonsiRNA Transfeksiyonuns lin Sal n mMiyokin Sal n mAdenilil Siklaz Aktivasyonuk Ortam Toplama

İlgili makaleler