Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi İn Vivo A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Salome Murinello; Stacey K. Moreno; Matthew S. Macauley; Susumu Sakimoto; Peter D. Westenskow; Martin Friedlander

doi:10.3791/54677

Method Article

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi İn Vivo A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

Salome Murinello¹ , Stacey K. Moreno¹ , Matthew S. Macauley² , Susumu Sakimoto¹ , Peter D. Westenskow¹^,³ , Martin Friedlander¹

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, ³The Lowy Medical Research Institute

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (MSS) dokuda yerleşik makrofajlarıdır ve hasarlı sinapsların veya hücrelerin, döküntülerin ve/veya istilacı patojenlerin fagositozu dahil olmak üzere CNS homeostazını destekleyen çeşitli işlevleri yerine getirirler. Alzheimer ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi hastalıkların patogenezinde sırasıyla amiloid β plak ve druzenin biriktiği bozulmuş fagositik fonksiyon rol oynamaktadır. Önemine rağmen, mikroglial fagositozun in vivo olarak değerlendirilmesi zor olmuştur. Burada, retinal mikroglia'nın in vivo fagositik potansiyelini hassas bir şekilde izlemek ve ölçmek için basit ama sağlam bir teknik açıklıyoruz. Önceki yöntemler immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme tekniklerine dayanıyordu. Yöntemimiz, canlı kemirgenlerde göze intravitreal iletimden sonra floresan işaretli partiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisi kullanır. Bu yöntem, zahmetli doku kesiti, immünoboyama ve görüntülemeyi içeren geleneksel uygulamaların yerini alır ve mikroglia fagositik fonksiyonunun altı saatten kısa bir sürede daha kesin bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. Bu prosedür aynı zamanda çeşitli bileşiklerin fizyolojik ortamlarda mikroglial fagositozu nasıl değiştirdiğini test etmek için de uyarlanabilir. Bu teknik gözde geliştirilmiş olsa da, kullanımı sadece görme araştırması ile sınırlı değildir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemin genel amacı doğru değerlendirmek ve in vivo mikroglial fagositozda ölçümüdür. Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) doku ikamet makrofajlar. Onlar doku homeostazında bakım sağlamak için çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek. Bunlar bağışıklık gözetim, nörotrofik faktörlerin salgılanmasına ve pivotal önemi, fagositoz ¹ içerir. Mikrogliyal fagositoz gibi alakasız sinapsların (sinaptik budama) ve apoptotik nöronların ^2-4 çıkarılması fagositozu olarak beyin ve retina, geliştirilmesi sırasında birçok önemli olaylar anahtarıdır. Bundan başka, hasar görmüş veya apoptotik nöronların hücresel döküntü ve istilacı mikrop mikro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün hayvanlar Scripps Araştırma Enstitüsü tarafından kurulan etik kurallarına uygun olarak tedavi edildi.

Enjeksiyon için Materyallerin hazırlanması 1.

33 G iğne ve şırınga sterilize: C ^ο 115 ° sökmeye ve otoklav steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde artan enjeksiyon için iğneler hazırlayın.
10 dakika - 5, oda sıcaklığında floresan işaretli parçacıkları çözülme. Ca ^{+ 2} / Mg2 ⁺ steril PBS içinde 50 mg / ml solüsyon için sulandırılması, enjeksiyon için partikül çözeltisi hazırlayın.
Not: fagositoz deneyleri için doğrulanmıştır mantar kökenli AF488 etiketli parçacıklar bu protokol ^21-23

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hızlı ve güvenilir bir şekilde akış sitometrik analizi (Şekil 2) ile, bir fizyolojik ortamda fagositik retina mikroglia sayısını ölçmek için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem fagositik kapasitesi bileşiklerin ve / veya genetik manipülasyon etkisini test etmek için uyarlanabilir mikroglia (Şekil 3A, 3B). (- 20 gün postnatal 10) veya yetişkin farelerde (Şekil 3C) Bu genç kullanılabilir. Lipopolisakarit değişen dozlarda (LPS.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde, üç önemli basamak vardır: floresan etiketli partiküllerin (1) içi enjeksiyon; (2) Ürünün alınması ve retina dokusunun hazırlanması; ve (3) flow sitometri yöntemi. Biz araştırmacıların burada mevcut yöntemin gerçekleştirmeden önce intravitreal enjeksiyonlar deneme yapmanızı öneririz. Albino farelerde (ör Balb / c) ve bir renkli çözelti (örneğin, floresan etiketli parçacıklar) iğne kolayca görselleştirme ve enjekte edilen bir çözüm kullanılabilir. Intravitreal enjeksiyonlar zorlu ve gerçekle.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salome Murinello, Amerikan Diyabet Derneği hibesi #1-16-PDF-072 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (Ulusal Göz Enstitüsü EY11254 ve EY22025) ve Lowy Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden Martin Friedlander'a verilen hibelerle desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomikroskop	Nikon,	durdurdu
şırınga, 600 serisi	Sigma	26702
33 ölçü, Küçük Hub RN NDL, 0,5 inç, nokta stili 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) Biyopartiküller, Alexa Fluor 488 eşlenik	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Enjeksiyondan hemen önce hazırlayın
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 Forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-35	İki
Dumont #5SF Forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-00
Vannas Yaylı Makas - 3 mm Kesici Kenar	İnce Bilim Araçları	15000-10	Kavisli
Nöral Doku Ayrışma Kiti – Doğum Sonrası Nöronlar	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp	Falcon	352054
96 kuyulu U-alt plaka	Falcon	353077
Leke Tamponu (BSA)	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 Antikor	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium İyodür	BD Biosciences	556463
Saflaştırılmış anti-fare CD16 / 32	Antikor BioLegend	101301

Hamilton'ı gerekir 128025

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi İn Vivo A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles