Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi İn Vivo A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Bu yöntemin genel amacı doğru değerlendirmek ve in vivo mikroglial fagositozda ölçümüdür. Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) doku ikamet makrofajlar. Onlar doku homeostazında bakım sağlamak için çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek. Bunlar bağışıklık gözetim, nörotrofik faktörlerin salgılanmasına ve pivotal önemi, fagositoz ¹ içerir. Mikrogliyal fagositoz gibi alakasız sinapsların (sinaptik budama) ve apoptotik nöronların ^2-4 çıkarılması fagositozu olarak beyin ve retina, geliştirilmesi sırasında birçok önemli olaylar anahtarıdır. Bundan başka, hasar görmüş veya apoptotik nöronların hücresel döküntü ve istilacı mikrop mikroglial fagositoz erişkin ⁵ boyunca merkezi sinir sistemi homeostazın korunması için gerekli olduğu gösterilmiştir. Son olarak, mikrogliyal fagositoz Alzheimer hastalığı ve yaşa-bağlı dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde olmuşturkusurlu veya yetersiz fagositik kapasitesi amiloid-β (Aβ) plaklar ve druseni sırasıyla ^6,7 birikmesi katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür maküler dejenerasyon.

Mikroglial fonksiyon sıkı ve özellikle de tümör büyümesi faktörü p ya da hücre-hücre etkileşimleri gibi çözülebilir faktörler tarafından, bunların mikro düzenlenir. mikroglia münhasıran kendi reseptörleri CD200R ve CX3CR1 ifade ederken Nöronlar yapısal, böyle CD200 ve CX3CL1 gibi çeşitli hücre yüzey ligandları, ifade eder. Bu reseptörler, hücre içi kısmı immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifi (ITIMs) içerir. Bu reseptörler, nöro katkıda bulunabilir mikroglia aşırı stimülasyon önlemek için önemli olan inhibitör. Bu nedenle, normal fizyolojik koşullar altında, nöronlar ve mikroglia arasındaki hücre-hücre etkileşimleri hareketsiz bir durumda mikroglia tutun. Doku hasarı sırasında, ancak, nöronlar exp aşağı düzenlerBu ligandların dışarı yansıması, Mikroglia aktivitesi üzerindeki engelleyici etkisinin ortadan kaldırır. (Fagositoz dahil) mikrogliyal fonksiyonu bu yüzden sıkı bir şekilde bunların mikro ⁸ ile bağlantılıdır. Bununla birlikte, bugüne kadar, fizyolojik bağlamında veya tam olarak merkezi sinir sistemi mikro-kopyalayacak şekilde mikroglia fagositoz çalışma standart bir tahliller vardır.

Çeşitli deneyler birincil mikroglia veya mikroglia hücre çizgileri, hedef hücreler (örneğin, apoptotik nöronların) ya da flüoresan etiketli boncuklar ile kültürlenir in vitro, in mikroglia fagositik aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir. Hedef alımı daha sonra floresan görüntüleme mikroskopi kullanılarak ya da sitometri ^9-12 akış değerlendirilir. Bu testler, farmakolojik veya genetik manipülasyon bilgilendirici olurken, tam in vivo ortamda karmaşık çoğaltmak için başarısız, mikroglial fagositoz etkileyebilir ve nasıl test sağlar. mikrogliyal fagositozu incelemek için dolaylı yöntemlerin vivo bildirilmiştir: Bu mikroglia ve hedefleri, fagositoz için (örneğin tehlikeye nöronlar veya sinaptik elemanların) fiziksel yakınlığı değerlendirilmesi, fagositoz (örneğin, CD68) dahil olmak üzere düşünce moleküllerin boyanması ile gerçekleştirilebilir, ya da fagositik immünohistokimyasal tespiti ile olan mikroglial hücreleri içinde hedefler (örn, Aβ) ^13-17. İki çalışma in vivo mikroglia fagositoz değerlendirmek için daha doğrudan yaklaşımlar kullanmışlardır. Hughes ve arkadaşları intrakranial rota ¹⁸ ile teslim boncuk mikroglial alımını ölçmek için görüntüleme teknikleri kullandık. Sierra ve ark. Kantitatif karmaşık görüntüleme teknikleri kullanarak ⁴ apoptotik hücrelerin mikroglia fagositoz değerlendirmek için zarif bir yöntem geliştirdi. Bununla birlikte, bu yöntemler, doku terkibi, kesit, görüntüleme ve analiz için karmaşık bir protokol içerir. Biz daha önce dışarı fotoreseptör fagositoz değerlendirmek için akım sitometri analizi kullandıkkültür ¹⁹ retina pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından er segmentleri. Burada, hızla in vivo mikroglia fagositoz bir nicel ölçüsü olarak retina mikroglia tarafından floresan etiketli parçacıkları alımını değerlendirmek için bir protokol açıklar.

floresan etiketli parçacıkların (1) intravitreal teslimat, (2) hasat ve retina dokusunun hazırlanması, ve (3) akış: Biz burada açıklamak protokol güvenilir ve kantitatif üç kritik adımda hemen altında altı saat retina mikroglial fagositoz ölçümü için izin verir sitometrik analizi. Geliştirdiğimiz yöntem retinada mikroglial fagositoz değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir ve başarıyla çeşitli bileşikler veya genetik manipülasyon fizyolojik ortamlarda bu anahtar mikroglial işlevi nasıl değiştirdiğini test etmek için kullanılır. MSS özel bir alanı olarak retina mikroglia fonksiyonu ²⁰ incelemek için kolay ulaşılabilir bir model sistem. Bu yöntem, t geliştirilmesine rağmeno göz, biz mikroglia fagositik işlevini araştıran tüm nörologlar için yararlı olabilir inanıyoruz.

Bütün hayvanlar Scripps Araştırma Enstitüsü tarafından kurulan etik kurallarına uygun olarak tedavi edildi.

Enjeksiyon için Materyallerin hazırlanması 1.

1. 33 G iğne ve şırınga sterilize: C ^ο 115 ° sökmeye ve otoklav steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde artan enjeksiyon için iğneler hazırlayın.
2. 10 dakika - 5, oda sıcaklığında floresan işaretli parçacıkları çözülme. Ca ^{+ 2} / Mg2 ⁺ steril PBS içinde 50 mg / ml solüsyon için sulandırılması, enjeksiyon için partikül çözeltisi hazırlayın.
   Not: fagositoz deneyleri için doğrulanmıştır mantar kökenli AF488 etiketli parçacıklar bu protokol ^21-23 kullanılır. Optimal alımı için, taze ve enjeksiyondan hemen önce parçacıkları hazırlamak.
   Not 2: Parçacık konsantrasyonları her özel deney için optimize edilebilir.

Boncuk Çözüm 2. Intravitreal

NOT: İki people bir şekilde, enjeksiyon gerçekleştirmek için gerekli olan şekilde diğer kişinin yüklü şırınga geçer ve pistonu iter ederken, fare tuşunu basılı tutun ve göz küresi üzerindeki odağı koruyabilirsiniz enjeksiyon gerçekleştiren kişi.

1. 20 ul / vücut ağırlığı 10 g bir dozda 100 mg / ml ketamin ve 10 mg / ml ksilazin intraperitonal enjeksiyonu ile kemirgen anestezi uygulayın. Enjeksiyon öncesinde, anestezi düzeyini ölçmek için ayak tutam kullanın.
   Not: İzofluran miyeloid hücre fonksiyonu üzerinde bir etkisi vardır, ve böylece bu tahlil içinde kullanımı ^24,25 kaçınılmalıdır.
2. 0.5 ul floresan etiketli parçacık çözümü ile yük iğne.
3. Yanlara cerrahi mikroskop (Şekil 1A-B) altında fare yerleştirin. Fare daha iyi konumlandırılması için yumuşak bir malzeme, örneğin, bir jel paketi kullanın. Gözleri henüz açık değil hangi genç fareler için, hafifçe bir fissu oluşturarak ince 45 ^o açılı forseps yardımı ile göz kapaklarını açmakhangi göz kapakları olacak sonunda açık yarık boyunca yeniden.
   1. Göz küresi soket biraz dışına çıkması için açılı ^o 45 ince forseps yardımı ile dikkatlice göz kapağı çevresinde basınç uygulayın. sadece kulak üstünde iki parmak ile ve çene ile kafa tutun ve yavaşça yuvanın dışına hafifçe göz tutmak için göz kapağına paralel olarak cildi germek. Boğaz (Şekil 1B) çok yakın kavramak için dikkatli olun.
4. (Kornea ve sklera bağlamak nerede) kornea limbusta şırınga en iğneyi, gözü delinme. Bu pigmentli farelerde gri daire olarak görünür. vitreus sıvısı küçük bir hacim sınırdışı ve daha sonra enjekte hafifçe iğne geri çekin. nazikçe tek elle ve diğer iğne ile fare tutmak gerekir enjeksiyon gerçekleştiren kişi; İkinci kişi pistonu yavaşça zorlamalıyız.
5. Yavaş yavaş şırınga geri çekin. Uygula göz nemlendirici hidrate göz tutmak için düşer. </ Li>
6. kemirgen bir ısı yastığı üzerinde bir kafes içinde kurtarmak ve hayvan izlemeye devam edelim. yavrular ile çalışan varsa, nefes ve spontan hareket edebilen kadar diğer uyarı hayvanlarla bir kafesine hayvan dönmez. yetişkinlerle çalışan Eğer sternum recumbence kavuşur kadar, diğer uyarı hayvanlarla bir kafes kemirgen dönmez.

Retina Doku 3. Hasat

Not: floresan etiketli partikülleri enjekte edilmemiş gözlerden retinal doku akış sitometrik analiz için bir kontrol olarak toplanmalıdır. Deney, tek bir retina kullanılarak gerçekleştirilebilir olsa da, en iyi performans için, iki retinalar bir araya toplanmış olmalıdır.

1. floresan etiketli parçacıkların enjeksiyonundan sonra retinal doku 3 saat toplayın.
   NOT: parçacık solüsyonu enjekte edildikten sonra zaman belirli her deney için optimize edilebilir olsa da, biz 3 saat enjeksiyonundan sonra, parçacık alımı o en katmanları boyunca görülebilir bulunduretina (Şekil 1C-D) f.
2. servikal dislokasyon ile fareler kurban.
3. Nazikçe gözü proptose ince 45 ^o açılı forseps yardımı ile göz kapağı karşı basarak gözbebekleri toplayın. göz küresi ve çekme arkasında forseps yerleştirin.
4. Diseksiyon mikroskobu altında retina parçalara ayır. Ca ^{+ 2} / Mg2 ⁺ PBS küçük bir miktar ihtiva eden bir Petri kabı gözün aktarın. Petri kabı kuru bir alanda, ince forseps ucu ile kornea limbusta gözün perfore.
5. Korneal limbus çevresi kabaca yarısı kesilir kadar ince 45 ^o açılı forseps yardımı ile gözün tutun ve kornea limbus etrafında kesmek için yaylı makas kullanın.
6. İnce 45 ^o açılı forseps ile göz küresinin tutun ve PBS içine gözün getirin. İnce 45 ^o açılı forseps ikinci bir çift ile ayrı kornea ve sklera gözyaşı. Lens ve retina çıkıp ben olacakntact.
7. lens ve retina ayırın. Retina toplamak ve Ca ^{+ 2} / Mg2 ⁺ ile 2 ml PBS ihtiva eden bir 5.4 ml polistiren test tüpüne aktarılır.

4. Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması

1. üreticinin talimatlarına küçük değişikliklerle nöronal doku ayrılma kiti kullanılarak tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. Kısaca, yukarı pipetleme ve P1000 pipet ile aşağı ve sallayarak olmadan 37 ^o C'de enzimatik sindirimi gerçekleştirerek çiğnemek retina.

Akım sitometri analizi için 5. Boyama Tek Hücre süspansiyonlar

1. lekeleme tampon maddesi 200 ul hücreleri tekrar U-tabanlı 96-çukurlu plaka ve transfer (% 0.2 inek serumu albümini (BSA) ve% 0.09 sodyum azid ile Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu su). 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
   NOT: Sodyum azid insanlar ve çevre için zararlıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman a kullanınnd yerel yönetmeliklere uygun olarak atık atmak.
2. süpernatant atmak için bir lavabonun üzerinde plaka ters çevirin. 5 ug / anti-fare CD16 / CD32 antikorunun ml göz başına ihtiva eden boya tamponu 25 ul Fc reseptörleri, tekrar süspansiyon hücreleri engellemek için. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
3. anti-fare Ly6C APC-Cy7 0.5 ug / ml anti-fare Ly6G-Pe-Cy7 0.5 ug / ml ve anti-fare CD11 b-AF650 2.5 ug / ml ihtiva eden lekeleme tampon maddesi 25 ul ekle. karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
4. 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. süpernatantı atmak için plaka ters çevirin. lekeleme tampon maddesi 200 ul içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla yıkayın.
5. 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Propidium iyodür (PI), 0.5 ug / ml ihtiva eden boya tamponu 200 ul süspanse edin. 1.2 ml mikrotiter tüplere aktarın.
6. önceki 200 ul PI ve havuz 0.5 ug / ml ihtiva eden boyama tamponu ek bir 100 ul ile kuyu yıkayın1.2 mi mikrotiter borular. boyalı hücrelerin 300 ul toplam hacim elde edilir.

6. Akım Sitometrisi Analizi

1. geleneksel üç lazer (mor, mavi ve kırmızı lazer) kullanılarak, PE, PerCP-Cy5.5, BV510 ve son derece parlak floresan AF488-parçacıklar önemli yayılma nedeniyle PI boyaları kaçının. Bu (yerine PerCP Cy5.5 kanalının MCherry kanal) bir PE-etiketli antikorlar ve PI sağlar (Şekil 2) kullanılmak üzere, bu testte iyi duruma getirmek için, dördüncü (sarı) lazer kullanır.
   NOT: Sarı lazer mevcut değilse, başka bir kanalda ölü hücre dışlama boya kullanın.
2. PI negatif hücreler (PI) üzerinde Kapısı ölü hücreleri (Şekil 2B) dışlamak için.
3. Ölü hücreleri, CD11b pozitif hücrelerin (CD11 ⁺⁾ üzerine kapak hariç sonra, bütün miyeloid hücrelerin (Şekil 2C) içerir.
4. LY6C üzerinde CD11b ⁺ nüfusu, kapının içinde ^- / Ly6G ^- dışlamak içinNötrofiller (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺⁾ ve monositler (CD11 b ⁺ / Ly6C ^+, Şekil 2D). Mikroglia ^(- / Ly6G ^- burada CD11b ⁺ / Ly6C olarak tanımlanan basitlik için) üzerinde yolluk sonra, iki net popülasyonları görünür olmalıdır; bir negatif ve floresan etiketli parçacıklar için olumlu. Fagositik hücreler parçacıkları almış ve AF488 ⁺ (Şekil 2E) bu nedenle.
   NOT: Ly6C pozitif veya Ly6G pozitif popülasyonlar da bu boyama yaklaşımı kullanarak parçacık alımını ölçmek için analiz edilebilir. Fagositik CD11b ⁺ hücrelerin yüzdesi fagositik mikroglia yüzdesi (Şekil 2F) ile iyice ilişkilidir. Bu fagositik nötrofiller ve monositler gibi mikroglia içerecektir olsa akış sitometri deneyimi olmayan araştırmacılara için tek başına CD11b boyama ile daha basit bir analiz gerçekleştirilebilir. / Ly6G ^{- -} Bu CD11b ⁺ / Ly6C içinde ^</ Sup> nüfus, belirteçler F4 / 80 ve CX3CR1 ile boyanarak tarafından değerlendirilecek bu hücreler>% 99 mikroglia vardır; Bu belirteçler eklendi ama bizim elimizde gerekli değildir olabilir.

Burada, hızlı ve güvenilir bir şekilde akış sitometrik analizi (Şekil 2) ile, bir fizyolojik ortamda fagositik retina mikroglia sayısını ölçmek için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem fagositik kapasitesi bileşiklerin ve / veya genetik manipülasyon etkisini test etmek için uyarlanabilir mikroglia (Şekil 3A, 3B). (- 20 gün postnatal 10) veya yetişkin farelerde (Şekil 3C) Bu genç kullanılabilir. Lipopolisakarit değişen dozlarda (LPS) intraperitoneal olarak uygulanmıştır. 24 saat, LPS meydan okumasından sonra Burada açıklanan protokol retina mikroglia fagositik işlevi (Şekil 3A) değerlendirmek için kullanıldı. 26, beklendiği gibi, araç kontrolü (Şekil 3B) ile karşılaştırıldığında 1.42 mg'lık bir doz / LPS'nin kg fagositik mikroglia yüzdesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışı indüklemiştir.

Şekil 2: Yolluk Strateji fagositik mikroglia Seç (A) p10 fare retina dokusundan Tek hücreler süspansiyonlar analiz edilir (B) ölü hücreleri (PI +) ekarte edildikten sonra, (C) CD11b + hücreler seçilir (D) için... sadece mikroglia seçmek, CD11b + nötrofiller (Ly6G +) ve monositler (Ly6C +) hariçtir. (E) fagositik mikroglia kadar floresan etiketli parçacıkları almış olacaktır. (F) fagositik CD11b + hücrelerinin sayısı mikroglia benzerdir (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, üç bağımsız deneyden elde edilen; Hata çubukları ortalama ± SEM temsil etmektedir.rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Mikroglia Fagositik Fonksiyon LPS Etkinlikten sonra ve Pups ve Yetişkin farelerde Değerlendirilen (A) Genç fareler (p10) 24 saat fagositoz değerlendirirken önce, değişen dozlarda intraperitoneal LPS ile tehdit edildi (B) Mücadelesi 1.42 mg /. araç kontrol (p = 0.0021) kıyasla kg fagositik retina mikroglia belirgin bir şekilde artan yüzde sonuçlandı. (C) Bu protokol, hem yavru ve yetişkin farelerde retina mikroglial fagositik fonksiyonu ölçmek için kullanılabilir. LPS ile meydan değil genç (p10) farelerde (p = 0.019) ile karşılaştırıldığında, yetişkin farelerde fagositik mikroglia bir daha küçük bir yüzdesi vardır. n = üç ya da dört ila toplanmış 9 -12,bağımsız deney; Hata çubukları ortalama ± SEM temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.