Method Article

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi İn Vivo A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (MSS) dokuda yerleşik makrofajlarıdır ve hasarlı sinapsların veya hücrelerin, döküntülerin ve/veya istilacı patojenlerin fagositozu dahil olmak üzere CNS homeostazını destekleyen çeşitli işlevleri yerine getirirler. Alzheimer ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi hastalıkların patogenezinde sırasıyla amiloid β plak ve druzenin biriktiği bozulmuş fagositik fonksiyon rol oynamaktadır. Önemine rağmen, mikroglial fagositozun in vivo olarak değerlendirilmesi zor olmuştur. Burada, retinal mikroglia'nın in vivo fagositik potansiyelini hassas bir şekilde izlemek ve ölçmek için basit ama sağlam bir teknik açıklıyoruz. Önceki yöntemler immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme tekniklerine dayanıyordu. Yöntemimiz, canlı kemirgenlerde göze intravitreal iletimden sonra floresan işaretli partiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisi kullanır. Bu yöntem, zahmetli doku kesiti, immünoboyama ve görüntülemeyi içeren geleneksel uygulamaların yerini alır ve mikroglia fagositik fonksiyonunun altı saatten kısa bir sürede daha kesin bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. Bu prosedür aynı zamanda çeşitli bileşiklerin fizyolojik ortamlarda mikroglial fagositozu nasıl değiştirdiğini test etmek için de uyarlanabilir. Bu teknik gözde geliştirilmiş olsa da, kullanımı sadece görme araştırması ile sınırlı değildir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemin genel amacı doğru değerlendirmek ve in vivo mikroglial fagositozda ölçümüdür. Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) doku ikamet makrofajlar. Onlar doku homeostazında bakım sağlamak için çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek. Bunlar bağışıklık gözetim, nörotrofik faktörlerin salgılanmasına ve pivotal önemi, fagositoz 1 içerir. Mikrogliyal fagositoz gibi alakasız sinapsların (sinaptik budama) ve apoptotik nöronların 2-4 çıkarılması fagositozu olarak beyin ve retina, geliştirilmesi sırasında birçok önemli olaylar anahtarıdır. Bundan başka, hasar görmüş veya apoptotik nöronların hücresel döküntü ve istilacı mikrop mikroglial fagositoz erişkin 5 boyunca merkezi sinir sistemi homeostazın korunması için gerekli olduğu gösterilmiştir. Son olarak, mikrogliyal fagositoz Alzheimer hastalığı ve yaşa-bağlı dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde olmuşturkusurlu veya yetersiz fagositik kapasitesi amiloid-β (Aβ) plaklar ve druseni sırasıyla 6,7 birikmesi katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür maküler dejenerasyon.

Mikroglial fonksiyon sıkı ve özellikle de tümör büyümesi faktörü p ya da hücre-hücre etkileşimleri gibi çözülebilir faktörler tarafından, bunların mikro düzenlenir. mikroglia münhasıran kendi reseptörleri CD200R ve CX3CR1 ifade ederken Nöronlar yapısal, böyle CD200 ve CX3CL1 gibi çeşitli hücre yüzey ligandları, ifade eder. Bu reseptörler, hücre içi kısmı immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifi (ITIMs) içerir. Bu reseptörler, nöro katkıda bulunabilir mikroglia aşırı stimülasyon önlemek için önemli olan inhibitör. Bu nedenle, normal fizyolojik koşullar altında, nöronlar ve mikroglia arasındaki hücre-hücre etkileşimleri hareketsiz bir durumda mikroglia tutun. Doku hasarı sırasında, ancak, nöronlar exp aşağı düzenlerBu ligandların dışarı yansıması, Mikroglia aktivitesi üzerindeki engelleyici etkisinin ortadan kaldırır. (Fagositoz dahil) mikrogliyal fonksiyonu bu yüzden sıkı bir şekilde bunların mikro 8 ile bağlantılıdır. Bununla birlikte, bugüne kadar, fizyolojik bağlamında veya tam olarak merkezi sinir sistemi mikro-kopyalayacak şekilde mikroglia fagositoz çalışma standart bir tahliller vardır.

Çeşitli deneyler birincil mikroglia veya mikroglia hücre çizgileri, hedef hücreler (örneğin, apoptotik nöronların) ya da flüoresan etiketli boncuklar ile kültürlenir in vitro, in mikroglia fagositik aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir. Hedef alımı daha sonra floresan görüntüleme mikroskopi kullanılarak ya da sitometri 9-12 akış değerlendirilir. Bu testler, farmakolojik veya genetik manipülasyon bilgilendirici olurken, tam in vivo ortamda karmaşık çoğaltmak için başarısız, mikroglial fagositoz etkileyebilir ve nasıl test sağlar. mikrogliyal fagositozu incelemek için dolaylı yöntemlerin vivo bildirilmiştir: Bu mikroglia ve hedefleri, fagositoz için (örneğin tehlikeye nöronlar veya sinaptik elemanların) fiziksel yakınlığı değerlendirilmesi, fagositoz (örneğin, CD68) dahil olmak üzere düşünce moleküllerin boyanması ile gerçekleştirilebilir, ya da fagositik immünohistokimyasal tespiti ile olan mikroglial hücreleri içinde hedefler (örn, Aβ) 13-17. İki çalışma in vivo mikroglia fagositoz değerlendirmek için daha doğrudan yaklaşımlar kullanmışlardır. Hughes ve arkadaşları intrakranial rota 18 ile teslim boncuk mikroglial alımını ölçmek için görüntüleme teknikleri kullandık. Sierra ve ark. Kantitatif karmaşık görüntüleme teknikleri kullanarak 4 apoptotik hücrelerin mikroglia fagositoz değerlendirmek için zarif bir yöntem geliştirdi. Bununla birlikte, bu yöntemler, doku terkibi, kesit, görüntüleme ve analiz için karmaşık bir protokol içerir. Biz daha önce dışarı fotoreseptör fagositoz değerlendirmek için akım sitometri analizi kullandıkkültür 19 retina pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından er segmentleri. Burada, hızla in vivo mikroglia fagositoz bir nicel ölçüsü olarak retina mikroglia tarafından floresan etiketli parçacıkları alımını değerlendirmek için bir protokol açıklar.

floresan etiketli parçacıkların (1) intravitreal teslimat, (2) hasat ve retina dokusunun hazırlanması, ve (3) akış: Biz burada açıklamak protokol güvenilir ve kantitatif üç kritik adımda hemen altında altı saat retina mikroglial fagositoz ölçümü için izin verir sitometrik analizi. Geliştirdiğimiz yöntem retinada mikroglial fagositoz değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir ve başarıyla çeşitli bileşikler veya genetik manipülasyon fizyolojik ortamlarda bu anahtar mikroglial işlevi nasıl değiştirdiğini test etmek için kullanılır. MSS özel bir alanı olarak retina mikroglia fonksiyonu 20 incelemek için kolay ulaşılabilir bir model sistem. Bu yöntem, t geliştirilmesine rağmeno göz, biz mikroglia fagositik işlevini araştıran tüm nörologlar için yararlı olabilir inanıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün hayvanlar Scripps Araştırma Enstitüsü tarafından kurulan etik kurallarına uygun olarak tedavi edildi.

Enjeksiyon için Materyallerin hazırlanması 1.

  1. 33 G iğne ve şırınga sterilize: C ο 115 ° sökmeye ve otoklav steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde artan enjeksiyon için iğneler hazırlayın.
  2. 10 dakika - 5, oda sıcaklığında floresan işaretli parçacıkları çözülme. Ca + 2 / Mg2 + steril PBS içinde 50 mg / ml solüsyon için sulandırılması, enjeksiyon için partikül çözeltisi hazırlayın.
    Not: fagositoz deneyleri için doğrulanmıştır mantar kökenli AF488 etiketli parçacıklar bu protokol 21-23 kullanılır. Optimal alımı için, taze ve enjeksiyondan hemen önce parçacıkları hazırlamak.
    Not 2: Parçacık konsantrasyonları her özel deney için optimize edilebilir.

Boncuk Çözüm 2. Intravitreal

NOT: İki people bir şekilde, enjeksiyon gerçekleştirmek için gerekli olan şekilde diğer kişinin yüklü şırınga geçer ve pistonu iter ederken, fare tuşunu basılı tutun ve göz küresi üzerindeki odağı koruyabilirsiniz enjeksiyon gerçekleştiren kişi.

  1. 20 ul / vücut ağırlığı 10 g bir dozda 100 mg / ml ketamin ve 10 mg / ml ksilazin intraperitonal enjeksiyonu ile kemirgen anestezi uygulayın. Enjeksiyon öncesinde, anestezi düzeyini ölçmek için ayak tutam kullanın.
    Not: İzofluran miyeloid hücre fonksiyonu üzerinde bir etkisi vardır, ve böylece bu tahlil içinde kullanımı 24,25 kaçınılmalıdır.
  2. 0.5 ul floresan etiketli parçacık çözümü ile yük iğne.
  3. Yanlara cerrahi mikroskop (Şekil 1A-B) altında fare yerleştirin. Fare daha iyi konumlandırılması için yumuşak bir malzeme, örneğin, bir jel paketi kullanın. Gözleri henüz açık değil hangi genç fareler için, hafifçe bir fissu oluşturarak ince 45 o açılı forseps yardımı ile göz kapaklarını açmakhangi göz kapakları olacak sonunda açık yarık boyunca yeniden.
    1. Göz küresi soket biraz dışına çıkması için açılı o 45 ince forseps yardımı ile dikkatlice göz kapağı çevresinde basınç uygulayın. sadece kulak üstünde iki parmak ile ve çene ile kafa tutun ve yavaşça yuvanın dışına hafifçe göz tutmak için göz kapağına paralel olarak cildi germek. Boğaz (Şekil 1B) çok yakın kavramak için dikkatli olun.
  4. (Kornea ve sklera bağlamak nerede) kornea limbusta şırınga en iğneyi, gözü delinme. Bu pigmentli farelerde gri daire olarak görünür. vitreus sıvısı küçük bir hacim sınırdışı ve daha sonra enjekte hafifçe iğne geri çekin. nazikçe tek elle ve diğer iğne ile fare tutmak gerekir enjeksiyon gerçekleştiren kişi; İkinci kişi pistonu yavaşça zorlamalıyız.
  5. Yavaş yavaş şırınga geri çekin. Uygula göz nemlendirici hidrate göz tutmak için düşer.
  6. kemirgen bir ısı yastığı üzerinde bir kafes içinde kurtarmak ve hayvan izlemeye devam edelim. yavrular ile çalışan varsa, nefes ve spontan hareket edebilen kadar diğer uyarı hayvanlarla bir kafesine hayvan dönmez. yetişkinlerle çalışan Eğer sternum recumbence kavuşur kadar, diğer uyarı hayvanlarla bir kafes kemirgen dönmez.

Retina Doku 3. Hasat

Not: floresan etiketli partikülleri enjekte edilmemiş gözlerden retinal doku akış sitometrik analiz için bir kontrol olarak toplanmalıdır. Deney, tek bir retina kullanılarak gerçekleştirilebilir olsa da, en iyi performans için, iki retinalar bir araya toplanmış olmalıdır.

  1. floresan etiketli parçacıkların enjeksiyonundan sonra retinal doku 3 saat toplayın.
    NOT: parçacık solüsyonu enjekte edildikten sonra zaman belirli her deney için optimize edilebilir olsa da, biz 3 saat enjeksiyonundan sonra, parçacık alımı o en katmanları boyunca görülebilir bulunduretina (Şekil 1C-D) f.
  2. servikal dislokasyon ile fareler kurban.
  3. Nazikçe gözü proptose ince 45 o açılı forseps yardımı ile göz kapağı karşı basarak gözbebekleri toplayın. göz küresi ve çekme arkasında forseps yerleştirin.
  4. Diseksiyon mikroskobu altında retina parçalara ayır. Ca + 2 / Mg2 + PBS küçük bir miktar ihtiva eden bir Petri kabı gözün aktarın. Petri kabı kuru bir alanda, ince forseps ucu ile kornea limbusta gözün perfore.
  5. Korneal limbus çevresi kabaca yarısı kesilir kadar ince 45 o açılı forseps yardımı ile gözün tutun ve kornea limbus etrafında kesmek için yaylı makas kullanın.
  6. İnce 45 o açılı forseps ile göz küresinin tutun ve PBS içine gözün getirin. İnce 45 o açılı forseps ikinci bir çift ile ayrı kornea ve sklera gözyaşı. Lens ve retina çıkıp ben olacakntact.
  7. lens ve retina ayırın. Retina toplamak ve Ca + 2 / Mg2 + ile 2 ml PBS ihtiva eden bir 5.4 ml polistiren test tüpüne aktarılır.

4. Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması

  1. üreticinin talimatlarına küçük değişikliklerle nöronal doku ayrılma kiti kullanılarak tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. Kısaca, yukarı pipetleme ve P1000 pipet ile aşağı ve sallayarak olmadan 37 o C'de enzimatik sindirimi gerçekleştirerek çiğnemek retina.

Akım sitometri analizi için 5. Boyama Tek Hücre süspansiyonlar

  1. lekeleme tampon maddesi 200 ul hücreleri tekrar U-tabanlı 96-çukurlu plaka ve transfer (% 0.2 inek serumu albümini (BSA) ve% 0.09 sodyum azid ile Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu su). 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
    NOT: Sodyum azid insanlar ve çevre için zararlıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman a kullanınnd yerel yönetmeliklere uygun olarak atık atmak.
  2. süpernatant atmak için bir lavabonun üzerinde plaka ters çevirin. 5 ug / anti-fare CD16 / CD32 antikorunun ml göz başına ihtiva eden boya tamponu 25 ul Fc reseptörleri, tekrar süspansiyon hücreleri engellemek için. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. anti-fare Ly6C APC-Cy7 0.5 ug / ml anti-fare Ly6G-Pe-Cy7 0.5 ug / ml ve anti-fare CD11 b-AF650 2.5 ug / ml ihtiva eden lekeleme tampon maddesi 25 ul ekle. karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  4. 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. süpernatantı atmak için plaka ters çevirin. lekeleme tampon maddesi 200 ul içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla yıkayın.
  5. 130 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Propidium iyodür (PI), 0.5 ug / ml ihtiva eden boya tamponu 200 ul süspanse edin. 1.2 ml mikrotiter tüplere aktarın.
  6. önceki 200 ul PI ve havuz 0.5 ug / ml ihtiva eden boyama tamponu ek bir 100 ul ile kuyu yıkayın1.2 mi mikrotiter borular. boyalı hücrelerin 300 ul toplam hacim elde edilir.

6. Akım Sitometrisi Analizi

  1. geleneksel üç lazer (mor, mavi ve kırmızı lazer) kullanılarak, PE, PerCP-Cy5.5, BV510 ve son derece parlak floresan AF488-parçacıklar önemli yayılma nedeniyle PI boyaları kaçının. Bu (yerine PerCP Cy5.5 kanalının MCherry kanal) bir PE-etiketli antikorlar ve PI sağlar (Şekil 2) kullanılmak üzere, bu testte iyi duruma getirmek için, dördüncü (sarı) lazer kullanır.
    NOT: Sarı lazer mevcut değilse, başka bir kanalda ölü hücre dışlama boya kullanın.
  2. PI negatif hücreler (PI) üzerinde Kapısı ölü hücreleri (Şekil 2B) dışlamak için.
  3. Ölü hücreleri, CD11b pozitif hücrelerin (CD11 +) üzerine kapak hariç sonra, bütün miyeloid hücrelerin (Şekil 2C) içerir.
  4. LY6C üzerinde CD11b + nüfusu, kapının içinde - / Ly6G - dışlamak içinNötrofiller (CD11b + / Ly6G +) ve monositler (CD11 b + / Ly6C +, Şekil 2D). Mikroglia (- / Ly6G - burada CD11b + / Ly6C olarak tanımlanan basitlik için) üzerinde yolluk sonra, iki net popülasyonları görünür olmalıdır; bir negatif ve floresan etiketli parçacıklar için olumlu. Fagositik hücreler parçacıkları almış ve AF488 + (Şekil 2E) bu nedenle.
    NOT: Ly6C pozitif veya Ly6G pozitif popülasyonlar da bu boyama yaklaşımı kullanarak parçacık alımını ölçmek için analiz edilebilir. Fagositik CD11b + hücrelerin yüzdesi fagositik mikroglia yüzdesi (Şekil 2F) ile iyice ilişkilidir. Bu fagositik nötrofiller ve monositler gibi mikroglia içerecektir olsa akış sitometri deneyimi olmayan araştırmacılara için tek başına CD11b boyama ile daha basit bir analiz gerçekleştirilebilir. / Ly6G - - Bu CD11b + / Ly6C içinde </ Sup> nüfus, belirteçler F4 / 80 ve CX3CR1 ile boyanarak tarafından değerlendirilecek bu hücreler>% 99 mikroglia vardır; Bu belirteçler eklendi ama bizim elimizde gerekli değildir olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hızlı ve güvenilir bir şekilde akış sitometrik analizi (Şekil 2) ile, bir fizyolojik ortamda fagositik retina mikroglia sayısını ölçmek için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem fagositik kapasitesi bileşiklerin ve / veya genetik manipülasyon etkisini test etmek için uyarlanabilir mikroglia (Şekil 3A, 3B). (- 20 gün postnatal 10) veya yetişkin farelerde (Şekil 3C) Bu genç kullanılabilir. Lipopolisakarit değişen dozlarda (LPS...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde, üç önemli basamak vardır: floresan etiketli partiküllerin (1) içi enjeksiyon; (2) Ürünün alınması ve retina dokusunun hazırlanması; ve (3) flow sitometri yöntemi. Biz araştırmacıların burada mevcut yöntemin gerçekleştirmeden önce intravitreal enjeksiyonlar deneme yapmanızı öneririz. Albino farelerde (ör Balb / c) ve bir renkli çözelti (örneğin, floresan etiketli parçacıklar) iğne kolayca görselleştirme ve enjekte edilen bir çözüm kullanılabilir. Intravitreal enjeksiyonlar zorlu ve gerçekle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salome Murinello, Amerikan Diyabet Derneği hibesi #1-16-PDF-072 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (Ulusal Göz Enstitüsü EY11254 ve EY22025) ve Lowy Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden Martin Friedlander'a verilen hibelerle desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
StereomikroskopNikon,durdurdu
  şırınga, 600 serisiSigma26702
33 ölçü, Küçük Hub RN NDL, 0,5 inç, nokta stili 4 - 12oHamilton7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) Biyopartiküller, Alexa Fluor 488 eşlenikThermoFisher ScientificZ-23373Enjeksiyondan hemen önce hazırlayın
DPBSCorning21-030-CV
Dumont #5/45 ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-35İki
Dumont #5SF ForsepsGüzel Bilim Araçları11252-00
Vannas Yaylı Makas - 3 mm Kesici Kenarİnce Bilim Araçları15000-10Kavisli
Nöral Doku Ayrışma Kiti – Doğum Sonrası NöronlarMiltenyi Biotec130-094-802
5 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı TüpFalcon352054
96 kuyulu U-alt plakaFalcon353077
Leke Tamponu (BSA)BD Biosciences554657
CD11b-BV650 AntikorBioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
Propidium İyodürBD Biosciences556463
Saflaştırılmış anti-fare CD16 / 32Antikor BioLegend101301
Hamilton'ı gerekir 128025

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527(2010).
  3. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
  4. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
  6. Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
  7. Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
  8. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  9. Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
  10. Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196(2012).
  11. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  12. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
  13. Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
  14. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
  15. Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
  16. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
  17. Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
  18. Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
  19. Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
  20. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
  21. Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501(2011).
  22. Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
  23. Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
  24. Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
  25. Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
  26. abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
  27. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
  28. Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
  29. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636(2016).
  30. Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal MicrogliaPhagocytic FunctionFlow CytometryIntravitreal InjectionFluorescent ParticlesTissue DissociationCell SuspensionFc Receptor BlockingViability DyeLPS Challenge

Related Articles