Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

Özet

Hedeflenen DNA hasarı, DNA'ya zarar veren bir ajanın tripleks oluşturan bir oligonükleotite (TFO) bağlanmasıyla elde edilebilir. Modifiye TFO'lar kullanılarak, DNA hasarına özgü protein ilişkisi ve DNA topolojisi modifikasyonu, burada açıklanan modifiye kromatin immünopresipitasyon testleri ve DNA süper sarma testlerinin kullanılmasıyla insan hücrelerinde incelenebilir.

Özet

Yüksek mobilite grubu kutusu 1 (HMGB1) proteini, transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı gibi genomunda çok önemli fonksiyonları, düzenlenmesinde görev olmayan bir histon mimari proteindir. HMGB1 standart B-DNA'ya daha yüksek afinite ile yapısal olarak bozuk DNA'ya bağlanır. Örneğin, biz HMGB1 DNA sarmalının bozulmalarına neden kovalent DNA iki ipliklerini bağlamak çapraz bağlantılar (ICLs), zincirler arası ve bırakılırsa unrepaired hücre ölümüne neden olabilir bağlanan bulundu. Bağlı sitotoksik potansiyel birçok ICL-uyarıcı maddeler, şu anda klinik olarak kemoterapötik maddeler olarak kullanılmaktadır. ICL oluşturucu maddeler belli baz dizilerine (örneğin, '-TA-3 5'psoralen için tercih edilen çapraz site) için tercihleri gösterirken, büyük ölçüde gelişigüzel bir şekilde DNA hasarına neden. Ancak, kovalent olarak dizi-spesifik DNA'ya bağlanan bir üçlü oluşturan oligonükleotid (TFO), ICL-indükleme maddesinin birleştirilmesi suretiyleşekilde, hedef DNA hasarı elde edilebilir. Burada, bir araç olarak kullanmak için bir mutasyon raportör plasmid üzerinde bir site-spesifik ICL oluşturmak için kovalent 8-Trimethylpsoralen (HMT) psoralen 5 'Bir 4'-hidroksimetil-4,5' ucuna üzerine konjuge edilmiş bir TFO kullanımı insan hücrelerinde HMGB1 karmaşık DNA lezyonlarının mimari değişiklik, işleme ve onarım incelemek için. Biz deneysel teknikler muhabiri plazmidler üzerinde TFO yönettiği ICLs hazırlamak ve kromatin immünopresipitasyon deneyleri kullanılarak bir hücresel bağlamda TFO yönettiği ICLs ile HMGB1 ilişkisini sorgulamak için açıklar. Buna ek olarak, HMGB1 ile psoralen çapraz bağlı plazmid üzerinde kişiye süpersarmal dönüş miktarı ölçülerek hasarlı DNA spesifik mimari modifikasyonu değerlendirmek için, DNA sarılma analizler açıklanmaktadır. Bu teknikler, TFO-yönlendirilmiş ICLs veya ilgi duyulan herhangi bir hücre hattı için diğer hedef DNA hasarının işlem ve onarımında yer alan diğer proteinler rollerini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Üçlü-helikal bir yapı oluşturmak için ^1-5 Hoogsteen-hidrojen bağlanması yoluyla bir dizi-spesifik şekilde oligonükleotid (TFOlar) bağlama dupleks DNA tripleks-oluşturan. Tripleks teknolojisi, transkripsiyon, DNA hasarı tamir ve gen hedefleme (referanslar ^6-8 gözden) olarak biyomoleküler mekanizmalar, çeşitli sorgulamak için kullanılır olmuştur. TFOlar muhabiri plazmidler ^9,10 site-spesifik zarar ikna etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Laboratuar ve diğerleri daha önce plazmid pSupFG1 ^5,10-12 ilgili supF genindeki bölgeye spesifik DNA kol içi çapraz bağlantılar (ICLs) ikna etmek için bir psoralen moleküle gergin bir TFO, AG30, kullandık. ICLs bu lezyonlar kovalent iki DNA ipliklerini çapraz gibi son derece sitotoksik olan ve unrepaired bırakılırsa, gen transkripsiyonunu bloke ve DNA replikasyonu makineleri ^13,14 engelleyebilir. Çünkü bunların sitotoksik potansiyel ICL-uyarıcı maddeler tedavisinde kemoterapötik ilaçlar olarak kullanılmış olanKanser ve diğer hastalıkların ^15. Bununla birlikte, insan hücrelerinde ICLs işleme ve tamir iyi anlaşılmamıştır. Bu nedenle, insan hücrelerinde ICLs işleme oluşumundaki mekanizmaların daha iyi anlaşılması ICL tabanlı kemoterapik rejimlerin etkinliğinin geliştirilmesi için yardımcı olabilir. TFO kaynaklı ICLs ve onarım ara DNA sarmalının önemli yapısal bozuklukların neden olma potansiyeli var. Bu tür bozulmalar kanonik B formu çift katlı DNA ^16-20 daha yüksek afinite ile bozulmuş DNA'ya bağlanan, mimari proteinleri muhtemel hedeflerdir. Burada, kromatin immunoprecipitation (ChIP) psoralen-çapraz plazmidler üzerinde deneyler yoluyla insan hücrelerinde ICLs ile son derece bol bir mimari protein dernek, HMGB1 okudu ve insan psoralen-çapraz plazmid DNA topolojisini modüle HMGB1 bir rol tespit kanser hücre lizatları.

HMGB1 son derece bol ve yayg ifade non-onunkanonik B formu DNA ^17-20 daha yüksek afinite ile hasar görmüş DNA ve alternatif olarak yapılandırılmış DNA alt tabakaları bağlanan sesi mimari proteini. HMGB1 örneğin transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı ^16,21-23 gibi çeşitli DNA metabolik süreçlerde, yer almaktadır. Daha önce HMGB1 yüksek afiniteyle ²⁰ ile in vitro TFO yönelik ICLs bağlanan olduğunu göstermiştir. Dahası, HMGB1 olmaması bir nükleotid eksizyon onarım (EŞ) ko-faktör ^23,24 olarak TFO yönelik ICLs mutajenik işleme ve tespit HMGB1 artış olduğunu göstermiştir. Son zamanlarda, HMGB1 insan hücrelerinde TFO yönelik ICLs ilişkili olan ve bu lezyonların olan alım NER protein, DA ¹⁶ bağlıdır olduğunu bulduk. DNA negatif süper NER ²⁵ DNA lezyonları randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını teşvik ettiği gösterilmiştir, ve HMGB1 TFO yönelik ICL içeren ÜLR'lerde tercihen negatif süper indükler bulmuşlardırBir NER ko-faktör olarak HMGB1 potansiyel rolü (ler) daha iyi anlaşılmasını sağlayan (non-hasarlı plazmidler yüzeylere göre) orta yüzeyler ^16. ICLs işleme tamamen insan hücrelerinde anlaşılmamıştır; Bu nedenle, burada tarif edilen moleküler araçlar göre teknikler ve gelişmiş deneyler da kanser kemoterapi rejimleri etkinliğini arttırmak için kullanılabilir farmakolojik hedefler olarak hizmet verebilir ICL onarımında yer alan ilave edilen proteinlerin tanımlanması için yol açabilir.

Burada, etkili bir yaklaşım tartışılmıştır agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon ile plazmid DNA TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini değerlendirmek. Bundan başka, TFO-yönlendirilmiş ICLs içeren plasmidler kullanılarak teknikler tarif edilmiştir Chip tahlilleri kullanarak hücresel bir çerçevede ICL hasarlı plazmidler ile HMGB1 ilişkisini belirlemek için. Ayrıca, bir uyduruk bir yöntem th tarafından tanıtıldı topolojik değişiklikleri incelemek içinözellikle insan hücre lizatlarında ICL hasarlı plazmid yüzeylerde e mimari proteini HMGB1, iki boyutlu agaroz jel elektroforez ile sarılma tahlilleri gerçekleştirilerek tespit edilmiştir. tarif edilen teknikler, insan hücrelerinde plazmid hedefli DNA hasarının işleme DNA tamiri ve mimari proteinlerin katılımı anlaşılmasını ilerletmek için de kullanılabilir.

Bu plazmid DNA, ve daha sonra plazmid çip ve sırasıyla, DNA topolojisi değiştirebilir lezyonlar ile ilişkilendirmek proteinler ve proteinleri belirlemek için deneyleri sarılma ilgili TFO-yönelimli site özel psoralen ICLs oluşumu için ayrıntılı protokoller tarif eder. Bu deneyler, diğer DNA hasar verici maddeler, TFOlar, plazmid alt tabakalar ve ilgi memeli hücre hatları ile gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Aslında, en azından bir olası benzersiz ve yüksek afiniteli TFO-bağlama bölgesi, insan genomunda ²⁶ her açıklamalı geni içinde olduğunu göstermiştir. NasılBiz Mukherjee ve Vasquez ^{2016, 16} kullanılan gibi bir zamanda, netlik sağlamak için, insan U2OS hücrelerinde spesifik mutasyon haberci plazmid (pSupFG1) belirli bir psoralen-konjuge TFO (pAG30) kullanımı için bu teknikleri tarif.

Protokol

Plazmid substratlar üzerinde TFO yönelik ICLs hazırlanması 1.

1. ^10,11, DNA tripleks bağlanma tamponu [% 50 gliserol, 10 mM Tris (pH 7.6), 10 mM MgC 8 ul psoralen-konjuge TFO AG30 (5 ug plazmid DNA, iyi bir başlangıç noktasıdır) plazmid pSupFG1 eşit molar miktarlarda inkübe _2] ve amber rengi bir tüp içinde 40 ul'lik nihai bir hacme kadar dH ₂ O. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. 12 saat boyunca 37 ° C su banyosunda reaksiyon inkübe edin.
2. Tam güç çıkışı sağlamak için UVA lamba ısıtın. parafin filmde tripleks reaksiyonu yerleştirin ve UVA (365 nM) lambası altında buz üzerinde parafin filmi yerleştirin. lamba ve tepki arasındaki bir Mylar filtre yerleştirin.
3. UVA 1.8 J / ^cm2 toplam doz için ışın tedavisi. Daha fazla kullanım için 4 ° C'de örnekleri saklayın.
   Dikkat: UVA ışınlama ile uygun koruyucu gözlük ve giysiler giyin.
4. RE yukarıda hazırlanan plazmid 200 ng Linearizeüreticisi kullanılarak 20 ul toplam hacmi sınırlandırması enzim Eko R1 10x tampon verilir. Isıtma 65 ° C'de 20 dakika süreyle enzim denatüre. 10,000 x g'de 10 dakika süre ile numuneler spin ve 4 ° C'de depolayın.
5. 50x alkalin tampon [1.5 M NaOH, 50 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)] hazırlanır. 50 ml dH ₂ O ile agaroz 0.5 mg ekle agaroz çözülür ve 50 ° C su banyosunda yerleştirmek için kaynatın.
6. çözündürüldü agaroz ısılar 50 ° C sonra, 50x alkali 1 ml tampon eklemek, karıştırmak ve daha sonra jel tepsiye jel dökün. Jel kullanmadan önce oda sıcaklığında katılaşmaya için zaman tanıyın.
7. Doğrusal hale getirilen DNA örneğin 20 ul 0.5 M EDTA 4 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
8. 6x alkali jel yükleme tamponu ekleyin (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, (w /% 18 hacim), yüksek molekül ağırlıklı polisakkarid,% 0.06 bromokresol dH ₂ O) örnekleri ve 1 kb DNA merdiveni.
   NOT: 6x alkali jel yükleme tamponu kullanılması önemlidir, tartışma bakın.
9. Yük soğuk oda jel üzerine örnekleri ve cm başına 3.2 volt gecede 1x alkali tampon (12-16 saat) çalıştırın. Örnekler jel girdikten sonra, yüzer önlemek için jel üstünde bir cam plaka yerleştirin.
10. nötralizasyon tamponu [1 M Tris-Cl (pH 7.6), 1.5 M NaCI, 3 M sodyum asetat (pH 5.2)], oda sıcaklığında 45 dakika boyunca jel ıslatılmasıyla, örnekleri nötrleştirmek.
11. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile 50 ml su içinde% 1, etidyum bromür (EtBr) 4 ul DNA jel leke. 15 dakika boyunca su ile destain. Bir görüntüleme sistemi ile DNA görselleştirmek.
    Dikkat: EtBr güçlü bir mutajen ve deri yoluyla absorbe edilebilir. EtBr ile doğrudan temastan kaçının.

İnsan hücrelerinde TFO yönelik ICL-içeren plazmidlerin 2. transfeksiyonu ve immüno-çökeltme

1. Plaka 400,000 memeli hücreleri (örneğin, U2OS ODulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 60 mm tabak başına steosarcoma hücre) 24 saat transfeksiyondan önce antibiyotikler olmadan,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe hücreleri.
2. Bir su banyosu içinde 37 ° C transfeksiyon sıcak büyüme ortamı ve fosfat tamponlu tuz (PBS) önce. Oda sıcaklığına kadar transfeksiyon reaktifi ısıtın.
3. 10 dk için 500 1 x büyüme ortamı ul (karışım 1) ve 2 ayrı 14 ml 1 x büyüme ortamı (karışım 2) 500 ul plazmidler ICL içeren TFO yönelik yuvarlak tabanlı tüp ug transfeksiyon reaktifi 30 ul inkübe oda sıcaklığı.
4. 2, mix yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın karışımı 1 ekleyin. Oda sıcaklığında 25-30 dakika inkübe edilir.
5. sıcak PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücrelerin plaka boyunca eşit dağıtarak damla damla moda transfeksiyon karışımı ekleyin. plakasına büyüme ortamının 1 ml ilave edilir ve 2 ml nihai hacim getirmek. biz mixll. 4 saat% 5 _CO2 ile 37 ° C inkübatör kültür plakaları yerleştirin.
6. % 10 FBS ile takviye edilmiş 3 mi büyüme ortamı ile değiştirin ve 16 saat daha inkübe edilir. Antibiyotik kullanmayın.
7. yaklaşık olarak% 1 bir son konsantrasyona plaka başına% 37 taze formaldehit 80 ul hücreleri tedavi ve ışıksız ortamda, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
   Dikkat: Formaldehit toksik ve güvenlik talimatlarına göre ele alınmalıdır. Formaldehit maruziyeti deri, göz ve solunum yollarında zarar verebilir.
8. Plaka başına (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) soğutulmuş glisin 300 ul ilave edildikten ve 5 dakika için inkübe edilmesi ile formaldehid çapraz bağlanmasını Quench. Ortamı çıkarın ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır ve daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpü içine soğutulmuş (4 ° C) PBS, 1 ml kazınarak hücreleri toplamak. her zaman buz üzerinde örnekleri tutun.
9. Ve 5 dakika 4 ° C 'de santrifüj ile hücre pelletleri hazırlamakBir masa buzdolabında santrifüj kullanılarak 13.400 xg t. Pipet dışarı Süpernatantı ve buz üzerinde hücre pelet yerleştirin.
10. Homojen olarak 1 ml soğutulmuş (4 ° C) tampon A (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) pelet tekrar süspansiyon ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Tersine tüp bazen karıştırın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız).
11. Homojen soğutulmuş 1 ml pelet (4 ° C) tampon B (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) tekrar süspansiyon ve çevrilmesi ile ara sıra karıştırma ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile Pelet hücreleri (yukarıdaki adım 2.9).
12. Tampon B soğutulmuş 200 ul içinde tekrar hücrelerin tekrar micrococcal nükleaz (MNase) 2 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. tüp hafifçe vurarak bazen tepkisini karıştırın. Buz üzerinde tüp yerleştirilmesi ve 40 mM EDTA eklenerek MNase reaksiyonu durdurun. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız).
13. 100 ul 1x kromatin immunopr yeniden süspanse hücreleriproteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş ecipitation tamponu (ChIP) tamponu (piyasada mevcut kitler verilir).
14. ince duvarlı mikrofüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin. buz üzerinde 20 sn inkübasyon tarafından takip 20 saniye boyunca su banyosu sonikatör bunları yüzen tarafından örnekleri sonikasyon. Tekrarlayın sonikasyon ~ 800-1,200 bp parçaları üretmek için 9 kez yineleyin.
    1. sonike numunelerin 20 ul için vorteks yoluyla iyice 3 ul 5 M NaCl ve 1 ul RNaz A karışımını ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, 2 ul Proteinaz K ekleyip 65 ° C'de 2 saat inkübe edilir. PCR saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri arındırın. % 1 agaroz jel örnekleri çalıştırın ve EtBr ile görselleştirmek.
       NOT: Elde edilen DNA maksimum yoğunluğu veya 1000 bp altında olmalıdır.
15. Üç ayrı tüplerde, önceden soğutulmuş bir silikonlu bir tüp içinde lizat 30 ul ve ilave proteaz inhibitörleri ile soğutulmuş 1x ChIP tamponu 70 ul ekle. 1 u eklemeilgili borular anti-immünoglobulin G (IgG) (pozitif kontrol olarak), anti-histon H3, ya da anti-HMGB1 antikor örn. sürekli dönmesi ile soğuk bir odada gece boyunca inkübe edin.
16. homojen soğuk odada süspanse protein G boncuk. tüp başına protein G boncuk 4 ul ekleyin ve rotasyon ile soğuk bir odada bir 2-4 saat süre ile inkübe edilir.
17. manyetik raf kullanarak, boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak. pelet proteaz inhibitör kokteyli ile karıştırılmış 200 ul 1x ChIP tamponu ilave edin ve rotasyon ile soğuk bir odada 5 dakika yıkayın. iki kez yıkayın tekrarlayın.
18. yüksek tuzlu 1x ChIP tamponu (70 mM NaCl ihtiva eden) sahip bir ek yıkama yapın.
19. (Ticari olarak temin edilebilir kitler temin) 160 ul yıkama tamponu ile pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca rotasyon ile 37 ° C'de inkübe edin.
20. boncuk pelet ve taze bir tüp içinde süpernatant toplamak. 5 M NaCl 6 ul proteinaz K 2 ul ekleyin ve 65 ° C'de gece boyunca inkübe° C.
21. Bir PCR ürünü saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve 50 ul dH ₂ O kullanılarak DNA Zehir
22. PCR ilgi bölgesi (ler) primer setleri kullanılarak ¹⁶ reaksiyonları gerçekleştirmek ve EtBr ile boyanmış bir% 1 agaroz jeli üzerinde ürün çözümler.

3. süperburulma Testi ve 2 boyutlu Agaroz Jel Elektroforez

1. DNA tamir sentez tamponu hazırlayın (45 mM Hepes-KOH, pH 7.8; 70 mM KCI, 7.4 mM _MgCl2, 0.9 mM DTT, 0.4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 uM dNTP,% 3.4 gliserin ve 18 ug sığır serum albümini) . -80 ° C'de saklayın. buz ve önceki üzerinde çözülme 40 mM phosphocreatine ve 2.5 ug kreatin fosfokinaz eklemek kullanmak için.
2. Oda sıcaklığında 10 x sarılma tamponu [500 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCI, 25 mM _MgCI2, 1 mM EDTA] ve mağaza hazırlayın.
3. Tamamen 1x 1 ul Vaccinia Topoizomeraz I (5-15 U / ml) kullanılarak süper-plazmid pSupFG1 DNA 300 ng Linearize10 ul reaksiyon tampon maddesi sarılma. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe karışımı.
4. Buz üzerinde HeLa hücre içermeyen özü ²⁴ çözülme. tamamen rahat plasmidler için, 25 ul HeLa hücresi serbest özütü ve DNA onarımı sentez tamponu ilave edin. İyice karıştırın. karışımı, Vaccinia topoizomeraz I ilave 1 ul ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
5. sodyum dodesil sülfat (SDS) (% 1 son konsantrasyon) ve proteinaz-K (0.25 mg / ml son konsantrasyon) eklenerek reaksiyonlar sonlandırma. 2 saat boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
6. 1x Tris Borat EDTA (TBE) tamponu ile bir% 1 agaroz jeli Dökme. DNA yükleme boyası ekleyin ve en az 4 şerit dışında jel üzerine doğrudan tepkileri yükleyin. topoisomers çözmek için oda sıcaklığında 1 x TBE 2 V / cm (boyut 1) 8-10 st için jel üzerinde çalıştırıldı.
   Not: Tris bazı, 54 g ekleyerek dH ₂ O 1 L 5x TBE stok çözelti hazırlayın. borik asit 27.5 g ve 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mi.
7. 1x 2 L hazırlayın3 ug / ml miktarında klorokuin katılımının-fosfat TBE. 20 dakika için bu çözelti, 200 ml jel bekletin. alüminyum folyo ile jel tepsisi örtün.
8. İkinci boyutta jel Electrophorese için, saat yönünde moda, jele 90 ° çevirin ve pozitif ve negatif sarımları çözmek için 1x TBE içeren klorokin 2 V / cm 4-6 saat çalıştırın.
9. bir rocker 1 saat süreyle EtBr ile jel Leke. 15 dakika dH ₂ O ile jel destain ve daha sonra bir görüntüleyici kullanarak topoisomers termal dağılımını görselleştirmek.

Sonuçlar

TFO-yönlendirilmiş ICL'in oluşumu insan hücrelerinde ICL işleme mimari proteinlerin rolleri sorgulamak için kullanılan plazmid bazlı deneyler için önemlidir. agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini belirlemek için, basit bir yöntemdir. TFO-yönlendirilmiş ICLs barındıran plasmidleri un çapraz bağlanmış kontrol plazmid (Şekil 1A, şerit 2) ile karşılaştırıldığında agaroz jel matrisi (Şekil 1A, yol 3) ile daha yav...

Tartışma

TFO-yönlendirilmiş ICLs etkili bir şekilde oluşumuna iki önemli faktörlere bağlıdır: hedefine TFO bağlanması afinitesine bağlı olarak hedef DNA alt-tabaka ile TFO inkübasyon uygun tampon bileşenleri (örneğin, _MgCI2) Birinci ve zaman (bağımlı dubleks ve konsantrasyonlar) kullanılan; ve ikinci, UVA uygun dozu (365 nm) ışınlama verimli psoralen çapraz bağlantılar oluşturmak için. Optimum tripleks oluşumu HPLC ya da jel saflaştırılmış TFOlar kullanılarak elde edilebilir. Tfo kirletici safsızlıklar daha f...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Sertifikalı Reaktif Co., Midland, TX	Özel sipariş	HPLC (veya jel) saflaştırılmış
Basit ChIP Enzimatik Kromatin IP Kiti	Hücre sinyalizasyonu A.Ş.	9003	Üretici tarafından önerilen protokol, plazmid IP için değil, kromatin IP için optimize edilmiştir. Kontrol IgG ve H3 antikorlarının yanı sıra Protein G boncukları ve mikrokokal nükleaz üretici tarafından sağlanır.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR ana karışımı
HMGB1 antikoru	Abcam	Ab18256
Sihirbaz Jeli ve PCR temizleme kiti	Promega	A9281
Klorokin-difosfat tuzu	Sigma	C6628-50G	İki boyutlu agaroz jel elektroforezi
için EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER transfeksiyon reaktifi	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoizomeraz I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray uzun dalga ultraviyole lamba	Upland, CA	B 100 AP	UVA lambası
EpiSonic Çok Fonksiyonlu Biyoişlemci 1100	Epigentek	EQC-1100	Su banyosu sonikatörü
Mylar filtre	GE Sağlık Yaşam Bilimleri
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD XRS	+ sistemi	DNA görüntüleme sistemi
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
%37 Formaldehit	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Çapraz bağlama için kullanılır
Proteinaz K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Hücre kültürü ortamı
PBS	ThermoFisher	70013073	Hücre kültürü
Tripsin-EDTA	ThermoFisher	25200056	Hücre kültürü
Bromokresol yeşili	Sigma-Aldrich	114-359	DNA yükleme boyası
Silikonize tüpler	Fisher Bilimsel	02-681-320	Düşük tutma mikrofüj tüpü
Tris tabanı	Fisher Scientific	BP152-1
Borik Asit	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
	Fotometre InternationalLight Technologies	ILT1400-A	UVA doz ölçümü
Hücre hatları< / güçlü>
İnsan U2OS osteosarkomu	ATCC	ATCC HTB-96	Tedarikçiye göre kültürlenmiş s tavsiyesi
İnsan servikal adenokarsinomu HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Tedarikçiye göre kültürlenmiş s önerisi
Proksimal ileri astar	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proksimal ters astar	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal ileri astar	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal ters astar	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc