Hedeflenen DNA hasarı, DNA'ya zarar veren bir ajanın tripleks oluşturan bir oligonükleotite (TFO) bağlanmasıyla elde edilebilir. Modifiye TFO'lar kullanılarak, DNA hasarına özgü protein ilişkisi ve DNA topolojisi modifikasyonu, burada açıklanan modifiye kromatin immünopresipitasyon testleri ve DNA süper sarma testlerinin kullanılmasıyla insan hücrelerinde incelenebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için
Bu makalede
Özet
Özet
Yüksek mobilite grubu kutusu 1 (HMGB1) proteini, transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı gibi genomunda çok önemli fonksiyonları, düzenlenmesinde görev olmayan bir histon mimari proteindir. HMGB1 standart B-DNA'ya daha yüksek afinite ile yapısal olarak bozuk DNA'ya bağlanır. Örneğin, biz HMGB1 DNA sarmalının bozulmalarına neden kovalent DNA iki ipliklerini bağlamak çapraz bağlantılar (ICLs), zincirler arası ve bırakılırsa unrepaired hücre ölümüne neden olabilir bağlanan bulundu. Bağlı sitotoksik potansiyel birçok ICL-uyarıcı maddeler, şu anda klinik olarak kemoterapötik maddeler olarak kullanılmaktadır. ICL oluşturucu maddeler belli baz dizilerine (örneğin, '-TA-3 5'psoralen için tercih edilen çapraz site) için tercihleri gösterirken, büyük ölçüde gelişigüzel bir şekilde DNA hasarına neden. Ancak, kovalent olarak dizi-spesifik DNA'ya bağlanan bir üçlü oluşturan oligonükleotid (TFO), ICL-indükleme maddesinin birleştirilmesi suretiyleşekilde, hedef DNA hasarı elde edilebilir. Burada, bir araç olarak kullanmak için bir mutasyon raportör plasmid üzerinde bir site-spesifik ICL oluşturmak için kovalent 8-Trimethylpsoralen (HMT) psoralen 5 'Bir 4'-hidroksimetil-4,5' ucuna üzerine konjuge edilmiş bir TFO kullanımı insan hücrelerinde HMGB1 karmaşık DNA lezyonlarının mimari değişiklik, işleme ve onarım incelemek için. Biz deneysel teknikler muhabiri plazmidler üzerinde TFO yönettiği ICLs hazırlamak ve kromatin immünopresipitasyon deneyleri kullanılarak bir hücresel bağlamda TFO yönettiği ICLs ile HMGB1 ilişkisini sorgulamak için açıklar. Buna ek olarak, HMGB1 ile psoralen çapraz bağlı plazmid üzerinde kişiye süpersarmal dönüş miktarı ölçülerek hasarlı DNA spesifik mimari modifikasyonu değerlendirmek için, DNA sarılma analizler açıklanmaktadır. Bu teknikler, TFO-yönlendirilmiş ICLs veya ilgi duyulan herhangi bir hücre hattı için diğer hedef DNA hasarının işlem ve onarımında yer alan diğer proteinler rollerini incelemek için kullanılabilir.
Giriş
Üçlü-helikal bir yapı oluşturmak için 1-5 Hoogsteen-hidrojen bağlanması yoluyla bir dizi-spesifik şekilde oligonükleotid (TFOlar) bağlama dupleks DNA tripleks-oluşturan. Tripleks teknolojisi, transkripsiyon, DNA hasarı tamir ve gen hedefleme (referanslar 6-8 gözden) olarak biyomoleküler mekanizmalar, çeşitli sorgulamak için kullanılır olmuştur. TFOlar muhabiri plazmidler 9,10 site-spesifik zarar ikna etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Laboratuar ve diğerleri daha önce plazmid pSupFG1 5,10-12 ilgili supF genindeki bölgeye spesifik DNA kol içi çapraz bağlantılar (ICLs) ikna etmek için bir psoralen moleküle ge....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Plazmid substratlar üzerinde TFO yönelik ICLs hazırlanması 1.
- 10,11, DNA tripleks bağlanma tamponu [% 50 gliserol, 10 mM Tris (pH 7.6), 10 mM MgC 8 ul psoralen-konjuge TFO AG30 (5 ug plazmid DNA, iyi bir başlangıç noktasıdır) plazmid pSupFG1 eşit molar miktarlarda inkübe 2] ve amber rengi bir tüp içinde 40 ul'lik nihai bir hacme kadar dH 2 O. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. 12 saat boyunca 37 ° C su banyosunda reaksiyon inkübe edin.
- Tam güç çıkışı sağlamak için UVA lamba ısıtın. parafin filmde tripleks reaksiyonu yerleştirin ve UVA (365 nM) lambası altında buz üzerinde parafin filmi yerleştirin. la....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TFO-yönlendirilmiş ICL'in oluşumu insan hücrelerinde ICL işleme mimari proteinlerin rolleri sorgulamak için kullanılan plazmid bazlı deneyler için önemlidir. agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini belirlemek için, basit bir yöntemdir. TFO-yönlendirilmiş ICLs barındıran plasmidleri un çapraz bağlanmış kontrol plazmid (Şekil 1A, şerit 2) ile karşılaştırıldığında agaroz jel matrisi (Şekil 1A, yol 3) ile daha.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
TFO-yönlendirilmiş ICLs etkili bir şekilde oluşumuna iki önemli faktörlere bağlıdır: hedefine TFO bağlanması afinitesine bağlı olarak hedef DNA alt-tabaka ile TFO inkübasyon uygun tampon bileşenleri (örneğin, MgCI2) Birinci ve zaman (bağımlı dubleks ve konsantrasyonlar) kullanılan; ve ikinci, UVA uygun dozu (365 nm) ışınlama verimli psoralen çapraz bağlantılar oluşturmak için. Optimum tripleks oluşumu HPLC ya da jel saflaştırılmış TFOlar kullanılarak elde edilebilir. Tfo kirletici safsızlıklar daha f.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar yararlı tartışmalar için Vasquez laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma [Kmv için CA097175, CA093279] Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü [RP101501] ve. açık erişim ücret karşılığında Fon: National Institutes Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü [KMV için CA093279].
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Sertifikalı Reaktif Co., Midland, TX | Özel sipariş | HPLC (veya jel) saflaştırılmış |
| Basit ChIP Enzimatik Kromatin IP Kiti | Hücre sinyalizasyonu A.Ş. | 9003 | Üretici tarafından önerilen protokol, plazmid IP için değil, kromatin IP için optimize edilmiştir. Kontrol IgG ve H3 antikorlarının yanı sıra Protein G boncukları ve mikrokokal nükleaz üretici tarafından sağlanır. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR ana karışımı |
| HMGB1 antikoru | Abcam | Ab18256 | |
| Sihirbaz Jeli ve PCR temizleme kiti | Promega | A9281 | |
| Klorokin-difosfat tuzu | Sigma | C6628-50G | İki boyutlu agaroz jel elektroforezi |
| için EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfeksiyon reaktifi | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoizomeraz I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray uzun dalga ultraviyole lamba | Upland, CA | B 100 AP | UVA lambası |
| EpiSonic Çok Fonksiyonlu Biyoişlemci 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Su banyosu sonikatörü |
| Mylar filtre | GE Sağlık Yaşam Bilimleri | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD XRS | + sistemi | DNA görüntüleme sistemi |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| %37 Formaldehit | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Çapraz bağlama için kullanılır |
| Proteinaz K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Hücre kültürü ortamı |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Hücre kültürü |
| Tripsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Hücre kültürü |
| Bromokresol yeşili | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA yükleme boyası |
| Silikonize tüpler | Fisher Bilimsel | 02-681-320 | Düşük tutma mikrofüj tüpü |
| Tris tabanı | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Borik Asit | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Fotometre InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA doz ölçümü | |
| Hücre hatları< / güçlü> | |||
| İnsan U2OS osteosarkomu | ATCC | ATCC HTB-96 | Tedarikçiye göre kültürlenmiş s tavsiyesi |
| İnsan servikal adenokarsinomu HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Tedarikçiye göre kültürlenmiş s önerisi |
| Proksimal ileri astar | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proksimal ters astar | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal ileri astar | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal ters astar | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
Kaynaklar
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses tran....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
