Yöntem makalesi

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

DOI:

10.3791/54690

⸱

14 Aralık 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Microbiology & Immunology, Weill Cornell Medical College, 2Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charcoal agar r esazurin assay (CARA), test ajanlarının replike eden, replike olmayan veya her ikisi olan mikobakterilere karşı aktivitesini değerlendirmek için yarı kantitatif, orta verimli bir yöntemdir. CARA, zamana ve konsantrasyona bağlı aktivitenin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir ve koloni oluşturan birim (CFU) tahlilleri ile izlenecek parametreleri tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

keşfetmek ve tüberküloz (TB) tedavi süresini kısaltmak anti-enfeksiyon ilerlemeye acil ihtiyaç vardır. Mycobacterium tuberculosis, TB etiyolojik ajan nedeniyle fenotipik ilaç direnci sergileyen basilinin bulunması hızlı ve kalıcı kemoterapiye dirençli. C harcoal bir gar bir ssay (CARA) esazurin r kopyalayan ve M. tüberküloz olmayan kopyalayan karşı yüksek verimli tarama kampanyaları tarafından keşfedilen aktif molekülleri karakterize etmek için bir araç olarak geliştirilmiştir. bakteriyolojik agar ortamında aktif kömür İçerme bileşik carry-over etkisini azaltmaya yardımcı olur ve CARA mikroplitelerin üzerinde tespit önce hücreleri önceden sulandırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. 37 ° C 'de 7-10 günlük kuluçka süresinden sonra, CARA mikro levha yüzeyi üzerinde büyüyen mikobakteriyel mikrokoloniler göre resazurin azaltılması yarı-kantitatif asse izinfluorometri ile bakteriyel numaralarının ssment. CARA yaklaşık bakteri sayısı 2-3 log 10 fark tespit eder ve ≥99% bakteriyel öldürücü (MBC ≥99) giden en az bir bakteri öldürücü konsantrasyon öngörür. CARA bir molekül kopyalayan basili olmayan kopyalayan, ya da her ikisi üzerinde etkin olup olmadığını belirlemenize yardımcı olur. CARA'nın kullanarak pilot deneyler Test maddesinin ve bileşiğin maruz kalma süresi konsantrasyonu koloni oluşturucu birim (CFU) tahlilleri ile ileri değerlendirme gerektiren belirlenmesini kolaylaştırır. kopyalayan aktif bakteri ya da bakteriyostatik ise ek olarak, CARA tahmin edebilirsiniz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis, tüberküloz etyolojik madde, antibiyotik yok edilmesi dirençli olan bir latent halde bir konakçıda yaşayabilir. Enfeksiyon sırasında M. tuberculosis fenotipik (genetik olmayan) direnci replike olmayan basil 1,2 popülasyonları, kısmen, bağlı olduğu düşünülmektedir. Fenotipik ilaç direnci gösteren Sınıf I persisters ilaç duyarlı hücrelerin 3,4 büyük nüfus arasında nadir stokastik mekanizmaları ile ortaya çıkmaktadır. Sınıf II persisters enfeksiyon sırasında karşılaşılan mikroçevrelerde dış gerilmeler de dahil olmak üzere ev sahibi bağışıklık faktörleri, non-kopyalayan işlenir. Son zamanlarda Sınıf II bir in vitro modeli geliştirdik replike olmayan aktive makrofajlar ve granülom M. tuberculosis ile karşı karşıya koşulları taklit etmek için kalıcılık. Sınıf II kalıcılık çok stres modeli bu koşulları içeren bir yağlı asit, karbon kaynağı ve tamamen Hal, yavaş büyüme,Bu, hafif asit (pH 5.0), hipoksi (% 1 O 2) ve nitrik oksit ve diğer reaktif nitrojen ara 5-9 T büyüme. Olmayan çoğaltma bu çok stres modeli kullanan büyük ölçekli tarama ve diğer Sınıf II olmayan kopyalayan modelleri, kimin faaliyeti olmayan kopyalayan devlete 5-7,9-18 yöneltilen çeşitli moleküller vermiştir. Aynı olmayan kopyalayan ekranlar da, kopyalayan ve her ikisi de olmayan kopyalayan basil karşı aktiviteye sahip moleküllerin bir kategori ortaya "ikili aktifleri" 7,10,12,19,20 olarak adlandırılan.

Isabet to-kurşun aşamasında Antibakteriyel ilaç keşif hit genişleme, ön farmakolojik karakterizasyonu, hedef tanımlama ve ön in vivo etkinlik çalışmaları için yol seçmek için aday moleküllerin geniş karakterizasyonu gerektirir. Erken aşama olarak, bir anti-enfektif W, eğer, bakterisidal olarak bunların bakteriostatik veya bakteri öldürücü bir mekanizma ile sınıflandırılır vester bakteriyel öldürmek zaman ve / veya konsantrasyona bağlıdır. koloni oluşturan birim (CFU) tahlil bu soruları yanıtlamak için klasik, altın standart yöntemdir. CFU deneyde, bakteri tümbölenler çıkarıldı seri olarak seyreltilmiş, bundan sonra, bir test maddesi, maruz kalan ve seyreltilmiş numune porsiyonları bir katı bakteriyolojik ortam üzerine yayıldı ve hayatta kalan hücrelerin büyüme için gerekli olan inkübe edilir. Son olarak, bakteri kolonileri numaralandırılır. CFU tahlili kalan koloniler numaralandırmak için hücreleri ve agar içeren Petri plakaları sulandırmak için mikrotiter plakaları çok sayıda gerektirir. yavaş büyüyen mikobakteriler için CFU tahlil koloniler plakalar üzerinde görünmesi için yaklaşık 3 hafta gerektirir onların yavaş nesil zaman (18-24 saat), tarafından engellenmektedir. Ayrıca, inkübatör alanı genellikle özel biyogüvenlik düzeyi-3 tesislerinde sınırlıdır.

hantal birlikte, CFU tahlilleri mycobacter olmayan replike ve çift olarak aktif moleküllerin etkisini karakterize etmek için, altın standartia. Sigara kopyalayan tahlilleri hücresel canlılığı, 6-8 değerlendirmek için deneyleri kopyalayan bağlanır gibi birçok yüksek yalancı pozitiflik oranlarına tabidir. Genel olarak, M. tuberculosis replike karşı güçlü bir aktiviteye sahip olan bir bileşik: (a "etkin kopyalayan") replike olmayan tahlil sırasında öldürmek için başarısız olabilir, ancak yine de replike edici olmayan fazdan carry-over sayesinde öldürebilir çoğaltma ( "koşulları replike") destekleyen şartlar altında yürütülen deney, iyileşme fazına deneyi. Bileşik ayrıca üzerinde taşır aktivite, sigara kopyalayan veya çift kopyalayan olup olmadığını zor ayırt etmek yapım çift aktif moleküllerin analizi zorlaştırmaktadır.

Yukarıda açıklanan sorunları gidermek için, bu tür M. tüberkülozun olarak mikobakteri türlerinin hızlı, yarı-kantitatif sayımı için bir ssay (CARA) esazurin c harcoal bir gar r geliştirdiataklar, M. bovis BCG, ve M. smegmatis 7 (Şekil 1 ve 2). In vitro tampon çözeltiler, aktif kömür hızlı tüberküloz 7 tedavisinde kullanılan standart ilaçlarla en tecrit. Aktive bir tahlil mikroplakadan üzerinde taşıyabilir bileşikleri bağlar mikropleytin CARA kömür ve CARA bu özelliği seri 7,21,22 numaralandırma önce deney kuyu içeriğini sulandırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. CARA mikroplakalar agar yüzeyi üzerinde mikobakteriyel mikrokoloniler sayısı resazurin ilavesiyle tahmin edilmektedir olan indirgenmiş bir şekilde, Resorufin bir mavi boya, flüoresan bir spektrofotometri 23 ile ölçülür pembe bir moleküldür. M. smegmatis 1-2 gün ve M. tuberculosis ve M. bovis BCG gibi yavaş gelişen mantar-bakterilere için 7-10 gün boyunca inkübe edilir mikro CARA. CARA ~ 2-3 günlük 10 sorumluluk yönün dar bir dinamik aralığı vardırCFU Rence. Bunun yerine, bir CFU tahlili içinde kullanıldığı zaman, tek bir CARA mikro yaklaşık kaplama için kullanılan seri seyreltileri, 120 üç tür agar plakaları için kullanılan beş, 96 gözlü levhalar yerine geçer. CARA verilerin yorumlanması daha zahmetli CFU bazlı deneylerde test etmek için hangi inkübasyon süreleri ve bileşik konsantrasyonları belirleyerek yapılan araştırmalar kılavuz yardımcı olur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CARA mikro hazırlanması 1.

  1. 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde% 0.2 gliserol ve% 0.4 aktif kömür ihtiva eden Middlebrook 7H11 ağarı Otoklav 900 mi, ya da seçenek olarak, bir 1 L'lik bir cam beher içinde, 450 mi. şişeye veya beher büyük bir otoklav karıştırma çubuğu ekleyin. alüminyum folyo ile şişesi veya beher açılmasını Kapak ve otoklav bant ile cama ekleyin.
  2. süspansiyonda kömür korumak için düşük bir hıza ayarlanmış bir manyetik karıştırma plakası üzerinde (yaklaşık 55-65 ° C) dokunun soğutun.
  3. Bir manyetik karıştırma plakası olan bir biyogüvenlik kaput içinde aseptik sonraki tüm adımları uygulayın.
  4. folyoyu çıkartın. 100 mi OADC ek ekleyin (OADC takviyesi,% 10 kullanıldığında,% 0.2 dekstroz,% 0.5 albümin,% 0.085 NaCl,% 0.0005, oleik asit, ve 0.4 mg / ml katalaz verimleri son ortam konsantrasyonlar) 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesine ya da 50 ml 1 L çanağa OADC ve karıştırmaya devam edin.
  5. Bir Erlenmeyer şişesine kullanılıyorsa, yaklaşık 25-4 dökünsteril reaktif rezervuara 7H11-OADC kömür 0 mi. kabı kullanarak, Reaktif kabını kullanmak gerekli değildir.
  6. 200 ul / oyuk reaktif rezervuar ya da kaptan 7H11-OADC kömür ile 96 gözlük bir mikroplakanın doldurun. Agar katılaşma ve kabarcıkların giriş önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. Bu mantar bulaşma kaynağı olabilir gibi, kuyu katı ortam dışında sıçramasını önlemek. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 96 oyuklu plakanın 8 sıra (AH) için 7H11-OADC kömür transferini 12 filtresi uçlarından birini dizisi kullanılır.
    NOT: orta hızla katılaşır. pipet uçları tıkanmasını önlemek için, bunları sık sık değiştirin.
  7. Alternatif olarak, çok sayıda tabak hazırlanmasında yardımcı olmak için filtre ipuçları ile P1000 elektronik çok kanallı pipet kullanarak mikro-plakalar CARA'nın dökün.
    NOT: nedeniyle mikroplaka kuyu düşük hacim, CARA mikroplitelerin agar dökme dakika içinde katılaşır.
  8. açılıp kapanabilir plastik ba içinde CARA mikrolevha- Yeri yığınlarıgs kurumasını önlemek için.
  9. Mağaza CARA mikro 4 ° C 'de.

90 Deneyleri 2. kopyalama Kurma ve MİK Sigara kopyalayan

  1. M. tuberculosis, M. bovis BCG aşılamak veya M bir OD 0.01-0.1 arasında 580 smegmatit ve Middlebrook 7H9-ADN orta log fazı (OD 580 ~ 0.5) genişletmek (Middlebrook 7H9% 0.2 gliserol içeren,% 0.2 dekstroz % 0.5 albümin ve% 0.085 NaCl) ya da 7H9-OADC (Middlebrook 7H9% 0.2 gliserol ve% 10 OADC ek ihtiva eden).
  2. Hücre kültürü şişelerinde kültürü duran, 20 ml ~ şekilde M. tuberculosis ve M. bovis BCG büyümek ve M. polipropilen yuvarlak taban (4 ml kültür) veya 50 ml konik santrifüj tüpleri (10-20 ml kültür) içinde sallama ile smegmatis. % 20 O2 ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de patojen mikobakteriler inkübe, ve M.% 20 O2 ile 37 ° C' de smegmatis.
  3. minimal-inhibitör kurmakkonsantrasyon (MİK 90) kopyalayan ve non-kopyalayan koşulları (Şekil 2) altında tarzı deney.
    Not: Deney maddeleri, genellikle, 96 oyuklu mikro-başına, sırasıyla test 4, veya 2 bileşikleri, izin vermek için yinelenen veya dörtlü olarak deneye tabi tutulur. Örneğin, bir 96-yuvalı plaka içinde, bir test maddesi satır EH satırlar AD ve başka analiz edilebilir. DMSO (araç) sütun 1, 2, ve 12 ve test maddesi seyreltme serisi sütuna 11 (en yüksek konsantrasyon) sütun 3 (en düşük konsantrasyon) kadar devam eder. MIC 90 tarzı tahliller tipik olarak 2 kat seyreltme serisi kullanır. Orada mikobakteriler 14-16,18,24,25 için çok sayıda olmayan kopyalayan modelleri ve amaçlıdır, non-çoğaltma 6,8,9 bir çok stres modeli kullanıyor.
    1. Kopyalayan deneyi için, açık bir dipli doku kültürü tedavi 96 oyuklu plakanın her kuyulara bir OD 0.01 580 7H9-ADN 200 ul hücre dağıtın.
    2. replike olmayan testi için,% 0.02 tiloksapol ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücreler iki kez yıkama ve replike olmayan ortam (% 0.05 KH 2 PO 4,% 0.05 MgSO 4,% 0.005 demir amonyum sitrat yeniden süspanse hücreleri ,% 0.0001 ZnCl2,% 0.1 NH4CI,% 0.5 BSA,% 0.085 NaCl,% 0.02 tiloksapol,% 0.05 bütirat pH) 2 N NaOH ile 5.0'a ayarlanmıştır.
      1. Replike olmayan bir ortam içinde bir OD 0.1 580 hücreleri seyreltilir ve 0.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar taze hazırlanmış 1 M'lık bir stok nano 2 ekleyin.
      2. Berrak tabanlı doku kültürü tedavi 96 oyuklu plakanın her kuyulara bir OD 0.1 580 200 ul hücre dağıtın.
        Not: DMSO içinde 100 kat stok çözeltiler halinde bileşik dilüsyonları hazırlayın. Bu durumda, nihai bir konsantrasyona 0,4-100 ug bir molekülün etkilerini test tipik bir MIC levha / ml DMSO'da 0,04-10 mg / ml stok solüsyonları gerektirecektir.
    3. di 2 ul ekleyinsatırlar AE içine Test maddesinin 1 mel çözümler ve satırları EH içine Test maddesinin 2 dilüsyonları 2 ul. İyice karıştırın.
    4. sütun 1, 2, 12 (satırlar AH), kontrol kuyulara 2 ul araç kontrolü (genellikle DMSO) ekleyin. İyice karıştırın.
    5. Her deney için, örneğin 0.004 ile 1 ug / ml (replike deneyi) ve / veya 0.08 ila 20 ug / ml (replike olmayan deneyi) ile ilgili rifampisin gibi en az bir pozitif kontrol.
      Not: 0.1 ila 25 ug / ml'de, 6-bromo-1 H-indazol-3-amin 9'a göre bir kullanım dışı çoğaltma çok stres modelinde seçici olan kontrol bileşiği Nano 2 bağımlı aktivitesi olarak önerilmektedir.
    6. Tahlilleri çoğaltılması için, 7 gün (M. tuberculosis ve M. bovis BCG) ya da 1-48 saat (M smegmatis) için% 20 O2 ve% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de mikro-inkübe edilir. Olmayan replikasyon çok stres modelinde, (<% 1 O 2 ve% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de 7 gün süreyle inkübe mikroem> M. tüberküloz ve M. bovis BCG).

CARA mikro 3. İnokülasyon

  1. CARA bir okuma olarak kullanılacak olan zaman noktalarında, dikkatli bir şekilde de 50-75 ul ayarlanmış bir P200 çok kanallı pipet kullanarak MIC 90 tarzı deney plakasının içeriğini yeniden süspanse edin. nazikçe Pipet yukarı ve aşağı, en az 5-10 kez ve pipet uçları kullanarak dairesel hareketlerle iyice içeriğini girdap.
  2. Aktarım CARA mikroplakaya tahlil kuyu içeriğinin 10 ul. tahlil plaka üzerinde kuyu içeriğinin sırası CARA mikrolevha'sının iyi içeriğinin sırasını aynı olduğundan emin olun. aktarımları sırasında sıçramasını önlemek ve 10 ul CARA mikroplak kuyuların ortasına benekli emin olun. CARA mikrolevhadaki içine emer 10 ul onaylayın.
    NOT: Önceki CARA mikroplitelerin üzerinde hücreleri tespit için gerekli hiçbir seyreltmeler vardır.
  3. plaka bant ile mikropleytin Cara Bind yığınları veDaha sonra açılıp kapanabilir bir plastik torbaya koyun. Mikro CARA'nın inkübe% 20 O2 ile 37 ° C (M smegmatis) ya da% 1 O2 ve% 5 CO2 (M. tuberculosis ve M. bovis BCG) de.
  4. M. tuberculosis ve M. bovis BCG, tahliller replike: 7 gün inkübe; M. tuberculosis ve M. bovis BCG için replike olmayan tahliller, 10 gün boyunca inkübe; M. smegmatis deneyleri, replike, 1-2 gün süre ile inkübe; M. smegmatis, non-replike deneyler, 2-3 gün inkübe edilir.
    NOT: Times tahminleri ve farklı kopyalayan olmayan kopyalayan ve stres koşullarında buna göre modifiye edilebilir.

4. CARA mikropleytin Geliştirme

  1. bakteriyel büyüme, ya da daha büyük, makroskopik kolonilerin film, negatif (araç) kontrol kuyuları görünür olduğunda mikropleytin CARA'nın geliştirin.
    Not: Uzun süreli inkübasyondan sonra, CARA mikro levha genelliklekuru görünür ve biz steril PBS ile ön ıslatma iyi içeriğini tavsiye ederiz. Bu düşük floresan veya iyi-kuyu varyasyon yol açabilir resazurin, emici gelen kömür önlemek için hizmet vermektedir.
  2. Çok kanallı pipet ile 12 P200 ipuçları tek bir set kullanarak, kuyuların kenarı boyunca steril PBS 40 ul dağıtmak ve PBS ağar / bakteriyel mikrokoloniler üstünde dağıtmak için izin verir.
  3. CARA 5 mg resazurin (son% 0.01) ve PBS içinde% 5 Tween80 50 ml karıştırılarak dönüştürme maddesi hazırlanır. Vortex ve steril filtre.
    Not: PBS içinde% 10 Tween80 1 (hacim / hacim) bir alternatif CARA dönüştürücü madde 1 sıvı solüsyon resazurin ticari olarak hazırlanmış karıştırılmasıyla hazırlanabilir.
  4. 12 kanallı bir pipet kullanarak CARA mikrolevhanın her çukuruna taze hazırlanmış CARA dönüştürücü madde 50 ul ekle. Kaya plakaları ileri geri birkaç kez her kuyuda Agar ve bakteriyel mat genelinde reaktifi dağıtmak yardımcı olur.
  5. tabak yerleştirin ina açılıp kapanabilir plastik torba ve M en az 30 dakika smegmatis, M. Tüberküloz ya da M. bovis BCG 45-60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Araç kontrol kuyuları ilk bir saat içinde pembe edecek başarısız olursa, plakalar yeniden doldurulur ve daha uzun süreler için inkübe edilebilir.
  6. floresansı okunarak önce çıkarılır bunların kapakları, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir biyo-güvenlik başlığı içinde mikro CARA'nın yerleştirin. Bir biyogüvenlik kabini dışında BSL3 spektrofotometreleri kullanırken, plaka üzerinde bir optik kalitesi PCR etiketini uygun ve yumuşak bir kağıt havlu ile etiket yüzeyine hafifçe bastırarak sıkıca kapatın.
  7. 590 nm'de 530 nm 'de bir eksitasyon ve emisyon ile oku kafa üzerinden floresan belirler. Bu boş levha için gerekli değildir.

5. Veri Analizi

  1. Doğrusal bir ölçek üzerinde Y ekseni üzerinde log 10 ölçek ve floresan X-ekseni üzerinde Konu inhibitör konsantrasyonu. Bir dağılım kullanınbir eğri istihdam arsa gibi "yanıtı değişken yamaç (4 parametre) karşı inhibitör log" olarak uygun. ± standart hata anlamına gelir arsa veri noktaları.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beklenen Cara sonuçları Şekil 2'de tarif edilen ve Tablo 1 'de özetlenmiştir. Hücreleri çoğaltmak için, CARA standart MIC 90 tahlillerinde paralel olarak çalıştırılır ve non-kopyalayan deneyleri için, CARA bir sonucudur faza bağlanır uyarlanmış bir MIC 90 testi ile paralel olarak çalıştırılır. Arka plan seviyelerinin üstünde yükselmeye Cara-floresans başarısızlıkla sonuçlanan deney maddesinin konsantrasyonu, Cara-MBC ≥99 (Şekil 3a). "≥99" indis CARA-MBC ≥2 log 10 bakteri öldürücü (≥99% öldürmek) yol açan test ajanının tahmini konsantrasyonu sağladığını gösterir.

Sıvı suyu MIC 90 tahlil bakterisit ve bakteriostatik aktivite arasında ayrım yapamaz ve bu ayrım CFU tahlili ile çözülmesi gerekir. Tarafındankongre, yavaş büyüyen mikobakteriler için bakteriyostatik faaliyetten bakterisidal ayıran eşik değeri yaklaşık 7 gün 7,26 üzerinde 2-3 günlük 10 öldürme olduğunu. CARA dinamik aralığı da 2-3 günlük 10 öldürmek olduğundan, CARA bakterisidal veya bakteriyostatik aktivitesinin bir tahmin sağlayabilir. CARA nedeniyle kolaylıkla arka plan seviyelerinde Cara floresan azaltmak için, bu bileşiklerin yetmezliği (Şekil 2) bakteriyostatik bazı kopyalayan aktif maddelerini tanımlar. Ancak, M. tuberculosis kopyalayan karşı bakteriyostatik aktivite ile bazı bileşikler bile bileşik taşıma-over yokluğunda iyileşme aşamasında bakteri büyütme inhibe etmeye devam yani güçlü bir post-antibiyotik etkisi vardır. Bu etki CARA tahlilinde fark etmek zor olabilir. Onlar bir "statik pencere" görüntüler varsa bileşikler doğru betwee bir> 4 kat vardiya olarak tanımlanan, bir post-antibiyotik etkisi uygulamakla şüpheleniliyorn MIC ve CARA eğrileri (Şekil 3b). Statik penceresi M. tuberculosis replike karşı aktif bir molekül yerine bakterisidal bakteriostatik olabileceğini gösterir. Bazı durumlarda, statik camlar sadece CARA floresan (Şekil 3c ve 3d) için genişletilmiş bir y-ekseni incelendikten sonra anlaşılacaktır.

CARA ve MIC 90 veriler genellikle birlikte (Şekil 4) çizilmiştir. MIC 90 Cara test replicating- ve replike olmayan aktif moleküller için Örnek veriler, Şekil 4'te gösterilmiştir. Moleküller için 4 büyük etkinlik sınıfı vardır: 1) bakterisidal çoğaltılıyor (Şekil 4a, izoniazid ile gösterdi); 2) kopyalayan bakteriyostatik (linezolid, Şekil 4b) ile gösterilmiştir; 3) olmayan kopyalayan bakteri (oksifenilbütazon, Şekil 4c) ile gösterilmiştir; ve, 4) temsilcisi(PA-824, Şekil 4d ile gösterilen) licating aktif (bakteriostatik veya bakteri öldürücü) ve non-replike bakteri. Önemli olarak, 4a Şekiller izoniazid ve linezolid MIC 90 yöntemi ile replike olmayan bakterilere karşı etkinliğe sahip olduğu görünürken, CARA da test replike olmayan koşullar altında aktif olmayan göstermektedir göstermek 4b. (Şekil 5a - d) rifampisin artan konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır, M. smegmatis replike bir molekülün zaman ve konsantrasyona bağımlı bir etki tahmin Cara yararlı test için ve 1-24 saat arasında, çeşitli zamanlarda, tümbölenler lekeli CARA plakalar üzerine. Bu veriler, rifampisin, erken 1 saat (Şekil 5A) gibi bir etki sarf 3 ve 24 saat (Şekil 5b-d) arasındaki artan bakterisidal aktivitesi gösterdiğini göstermiştir ve 2 ile ~ 10 ug / ml ≥2-3 log 10 öldürüldü4 saat (Şekil 5d). Benzer bir deney, bir vasıta kontrolü ile 9 ilaç konsantrasyonlarının dörtlü test ve 4 zaman noktalarında, standart bir CFU-bazlı deney ile neredeyse imkansız olur.

Böylece, CARA bir molekülün aktivite profili tanımlamak için bir orta verimlilik, hızlı bir mekanizma olarak ilaç keşfi bir role sahiptir. CARA tahminleri titizlikle standart CFU tahlili kullanılarak değerlendirilmelidir. CFU analizi için Petri plakaları% 0.4 aktif kömür ilave CARA veri ilişki iyileştirmeye yardımcı olabilir, ve düzeltme büyüklüğü genel olarak bileşiğin etki gücüne 21,22 orantılıdır daha doğru CFU sayımlarında neden olabilir.

figure-results-1
Şekil 1: CARA ilaç keşfi bir öngörü araçtır. Bu şema, bir olarak CARA yararını özetlemektedirilaç taraması (tek nokta tarama, kiraz toplama ve doz-yanıt deneyleri) ve zaman alıcı isabet to-kurşun deneyleri (CFU tahlilleri ve hedef tanımlama) arasındaki ara aşama. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: beklenen sonuçlarla suyu MIC 90 tahlil ve CARA şematik. Hem MİK 90 ve CARA sonuçları 8 olası faaliyetler için sunulmuştur. Renk kodlama MIC 90 mikroplaka kuyuları için (hiç büyüme) ve kahverengi (büyüme) beyaz ve CARA için mikropleytin (hiçbir floresan) ve pembe (Resorufm floresan) siyahtır. Veriler varsayımsal vardır. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: CARA terim ve tanımları İhtisas. CARA floresan arka plan seviyeleri ile sonuçlanan bir molekül minimum bakteri öldürücü konsantrasyon Cara-MBC ≥99 (a). Kopyalayan koşullar altında, MIC 90 sağında Cara-MBC ≥99 bir ≥4 kat kaydırma genellikle bakteriyostatik etkinlik gösterir ve bir "statik penceresi", (b) olarak adlandırılır. Güçlü bir post-antibiyotik etkisi ile moleküller için, statik pencere gözlemlemek (c) ve gerektiren zor olabilirY ekseni (CARA floresan) genişleme (d) görselleştirmek için. Veriler varsayımsal vardır. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: Örnek MIC 90 Cara seçilmiş bileşikleri için sonuçları. MIC 90 (kırmızı) ve CARA (mavi) için veri (a) izoniazid (INH), (b) linezolid, (c) oksifenilbütazon, ve (d) PA-824 için gösterilmiştir. Yabani tip M.tüberküloz H37Rv, standart replike koşulları ya da olmayan çoğaltma 7-9 çoklu gerilme modeli altında 7 gün boyunca bileşiklere maruz bırakıldı. Şekil 2'de gösterildiği gibi, MIC 90 deneyler Cara yapıldı. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: doza ve rifampisin zamana bağlı aktivitesi. Patojenik olmayan, hızlı büyüyen M. smegmatis replike koşulları ve alikotları altında rifampisin artan konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır Cara için örneklendi 1 (a), 3 (b) 6 (c) ve 24 (d) 'sa. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal ajanlar ve Kemoterapi 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-6
Tablo 1: Şekil 2'de beklenen sonuçlarının özeti. [Altın ve ark izniyle uyarlanmıştır., Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi 2015 7] Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CARA aslen olmayan kopyalayan veya çift aktif molekülleri 7 ilerleyen bir darboğaz hafifletmek için geliştirilmiştir. CARA primer tarama lan ve CFU tahlilleri (Şekil 1) konsantrasyon-yanıt teyidi arasındaki bir ara ürün olarak hizmet vermektedir. Tek bir CARA plaka kalan bakterileri numaralandırmak için kullanılan seri dilüsyonları hazırlamak için gerekli sayıda mikrotiter plakaları ve agar içeren Petri plakaları yerine beri, CARA hızla molekülün aktivitesini değerlendirmek ve bileşik konsantrasyonunda da dahil olmak üzere bir defada birden çok değişken, test etmek için basit bir araç sağlar ve bileşik maruz kalma süresi.

CFU tahlili içinde, çoğu zaman 10 6 kat ye kadar seri seyreltiler ek olarak, agar, tipik olarak ek ~ 800-kat (tri tarzı Petri plakası 8 ml üzerinde 10 ul) molekülleri seyreltir. Aktif bileşikler için iki aşamalı, çoklu baskı görüntüleme deneyi M. TU replike olmayantüberküloz tahlilinde replike edici olmayan aşamada bir bileşik mevcut beşte büyümesinin deneyinde 6-9 arasında (replike) aşaması orijinal konsantrasyonda bulunur, yani, 5-kat bir şekilde bir faktör vardır. CARA azaltan carry-over etkileri aktif kömür ile küçük moleküller tecrit yoluyla. Tüberküloz ilaç ve klinik adaylar çoğunluğu 7 streptomisin aminoglikosit dışında, hızlı bir şekilde ve tam olarak aktif kömür bağlar. CFU tahlilleri agar plakalarında aktif kömür dahil edilmesiyle bakteriyel gelişme inhibisyonu ve bakteriyel öldürmek engellenmiş taşınan üzerinde TMC207'ye ve PA-824 7,21,22. Bu nedenle, bakteriyolojik agar aktif kömür içeren sayesinde CARA hücreler ve test maddesinin seri seyreltmeleri bağımlı değildir.

CARA kopyalayan aktif ve olmayan kopyalayan aktiflerle bakterisidal etkisi bakteriostatik veya bakterisidal etkisini tahmin yardımcı olabilir. genel CARA standart MIC 90 tahlillerinde paralel olarak kullanılır. CARA tahmin gücü MIC 90 ve CARA sonuçları (Şekil 2 ve Tablo 1) karşılaştırarak gelir. Anti-mikobakteriyel maddeler çalışma kullanıldığında CARA doğru bakteriyostatik (Şekil 4b), replike olmayan bakterisidal (Şekil 4C), veya çift olarak aktif (Şekil 4D), çoğaltma, bakteri (Şekil 4a) replike olup aktivitesi tahmin edebilirsiniz. Cara aynı dozda ve sürede, her iki arasında bir bileşiğin etkinliğinin basit değerlendirilmesini sağlar. CFU tahlilleri yalnız doz ve zamanlarda geniş bir yelpazede üzerinde bir bileşiğin aktivitesini değerlendirmek için çaba ve bir sürü malzeme gerektiren, ancak CARA sonuçları olanlara koşulları aralığını daraltmak zaman görev (bileşik kanıtlanabilir aktif olduğu Şekil 5 yönetilebilir hale ).

CARA bir eylem okuyan yardımcı olsa damikobakteriler üzerinde nti-enfektif, tahlil sınırlamaları vardır. CARA dar bir dinamik aralık (2-3 log 10) sahiptir ve bir 2'den fazla 10 günlük 3 bakteriyel öldürmek olmayabilir öngörüyor hangi koşullar için uygun olmayabilir. CARA tahminleri bir CFU tahlili gibi bakteri sayıları, numaralandırmak için daha sıkı ve doğru bir yöntem kullanarak, daha fazla çalışma gerektirir. Böyle PAS gibi bazı anti-enfeksiyon, post-antibiyotik etkisi, M. tuberculosis 7 kopyalayan karşı bakterisit ve bakteriostatik aktiviteye sahip bileşiklerin ayırt etmek bir öngörü aracı olarak CARA'nın karıştırabilir.

Cara kalitesini artırmak için iki öneriler vardır. hacimsel doğruluk korumak ve mikro dışında sıçramasını kaçınarak Birincisi, bir, mikroplaklar hızla agar katılaşır önce CARA'nın dökmek gerekir. Ne olursa olsun gerekli plakaların sayısı, biz m korumaya yardımcı olmak için orta 0,5 ile 1 L toplu yapmanızı öneririzlevhalar dökmek için gereken zaman süresince sıvı formda edium. kısmen tıkalı ipuçlarını kullanarak kaçınır orta mikropleytin doldururken sık sık ipuçları değiştirilmesi. İkincisi, bir çoğaltır arasındaki floresan artefakt değişkenliği en aza indirmek gerekir. Mikobakteriyel mikrokoloniler, örneğin M. tuberculosis gibi patojenik mikobakteri özellikle de, genellikle düzensiz büyür. örneğin, agar yüzeyi üzerinde büyüyen mikrokoloniler boyut, şekil, yüksekliği değişebilir ya da mikro levha iç duvarlarına kadar uzanabilir. Bir meydan okuma madde ile eşit tüm basil karşılamaktır. Bir başka engel, 37 ° C de, uzun süreli kuluçkadan sonra CARA mikroplakalar katı bakteriyolojik ortamı dönüştürücü madde emici kuru ve yatkın hale olmasıdır. Aktif kömür resazurin bağlamak ve floresan 7 gidermek beri nedeniyle çözüm geliştirme resazurin emici kuru kuyu ve aktif Charcoa iyi-to-kuyu varyasyon olabilirl söndürme resazurin ışık vermiştir. Gelişmekte olan reaktif eşit tüm mikobakteriyel koloniler ulaşacak ve resazurin aktif kömür üzerinde güvenle kalır - Ön ıslatma hemen gelişmekte ayıracı eklemeden önce PBS ile tüm CARA mikroplak kuyuların yüzeyini bu sorunların her ikisi de azaltır. CARA belirlenmesi ve veya diğer bakteri türleri için orta verimli ilaç keşfi deneylerinde mikobakteriyel mutant fenotipleri karakterize uygulamalara sahip olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ifşa hiçbir çıkar çatışması vardır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz el yazması ve kimya yardımı J. David Warren (Weill Cornell Medical College) CARA'nın geliştirirken uzman inceleme için Kristin Burns-Huang müteşekkiriz. Bu eser Translational Medicine Bill ve Melinda Gates Vakfı, Abby ve Howard P. Milstein Programı TB İlaç Hızlandırıcı Programı ve NIH TB Araştırma Birimi (U19 AI111143) tarafından desteklenmiştir. Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü William Randolph Hearst Vakfı tarafından desteklenmektedir. SSK NIH hibe K08AI108799 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Middlebrook 7H9Beckton Dickinson271310
Middlebrook 7H11Beckton Dickinson298810
Middlebrook OADCBeckton Dickinson212351
BSA, ısı şokuRoche3118958001
aktif kömürSigmaC5510
PBS, Dulbecco'nun Ca2+ ve Mg2+ ücretsizYaşam Teknolojileri / Invitrogen14190-144
tween 80SigmaP8074
tyloxapolSigmaT8761
sodyum nitritSigma2252
rifampisinSigmaR3501
6-bromo-1H-indazol-3-aminAlfa AesarH34095
potasyum fosfat monobazik   SigmaP0662
magnezyum sülfat, heptahidrat SigmaM1880
ferrik amonyum sitrat SigmaF5879
çinko sülfat, heptahidratSigmaZ0251
amonyum klorür ve nbsp;SigmaA9434
bütirik asit, sıvıSigmaB103500
resazurin tozuSigmaR7017
sodyum klorür ve nbsp;J.T. Fırıncı4058-01 
hazırlanan resazurin çözeltisi InvitrojenDAL1100
PCR çıkartmalarıDenvilleB1212-5
spektrofotometreMoleküler CihazlarM5
96 kuyulu, doku kültürü ile tedavi edilmiş mikroplakalarCorning3595
reaktif rezervuarlarıVWR 89094-678
yeniden kapatılabilir plastik torbalarVWR 395-94602
14 ml Polipropilen yuvarlak tabanlı tüplerCorning 
50 ml konik santrifüj tüpüCorning352070
75 cm2 Hücre kültürü şişesiCorning431464U
şeffaf, düz tabanlı doku kültürü tedavi edilmiş 96 oyuklu mikroplakaOS
Prism 6
352059 X GraphPad http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ için Costar 3595

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
  2. Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
  3. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  4. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
  5. Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
  6. Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
  7. Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
  8. Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).
  9. Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
  10. Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. Chem, J. .M. ed. , (2014).
  11. Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942(2013).
  12. Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
  13. de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
  14. Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
  15. Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
  16. Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
  17. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  18. Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
  19. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
  20. Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293(2015).
  21. Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
  22. Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
  23. Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
  24. Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
  25. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
  26. Barry, A. L., et al. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikosbakteri Say mYar Kantitatif De erlendirmeOrta Kapasiteli TaramaAktif K m r AgarRezazurin ndirgenmesiFlorometrik OkumaMBC den B y k 99Replike Olan Replike OlmayanCFU Vekil Y ntemi

İlgili makaleler