Yöntem makalesi

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA'lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

9.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54693

⸱

30 Kasım 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Digestive Disorders Unit, National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health, DHHS, 2National Institutes of Health Research Scholar, Howard Hughes Medical Institute, 3Internal Medicine, Medical School, University of Michigan

Bu makalede

Özet

Amplifikasyona ihtiyaç duymadan biyolojik substratlardaki molekülleri barkodlayarak ve sayarak gen ekspresyonunu ölçen çoğullanmış yüksek verimli bir gen ekspresyon platformunun kullanımını açıklıyoruz. Platformu, irritabl bağırsak sendromu olan ve olmayan kişilerde tam kandaki mikroRNA (miRNA) ekspresyonunu ölçmek için kullandık.

Özet

gen ekspresyon platformu deney, tek bir reaksiyonda fazla 800 transkript (mRNA veya miRNA'ların) ekspresyonunun sağlam ve yüksek oranda çoğaltılabilir ölçümü sağlar. miRNA tahlil doğrudan görüntüleme ve dijital renk kodlu floresan barkodlu prob setleri (bir haberci prob ve bir yakalama probu) ile etiketli miRNA moleküllerini sayarak transkript sayar. Barkodlar 3 'ucuna özel bir oligonükleotid etiketi (miRtag) bağlanması ile uzatılmış olan miRNA'lar olgun doğrudan hibridize edilir. Ters kopyalama ve transkript amplifikasyonu gerekli değildir. Raporcu sondalar dört flüoresan renk bir kombinasyonu kullanılarak doldurulur altı renkli pozisyonların bir diziyi ihtiva etmektedir. altı pozisyonun üzerindeki dört renk gen spesifik bir renk barkod sekansı oluşturmak için kullanılır. Post-hibridizasyon işleme bir robot hazırlık istasyonunda otomatiktir. melezleme, aşırı sondalar, uzak yıkanır ve üçlü yapılar (yakalama yanlısı sonrabe-miRNA haberci prob) biyotin etiketli yakalama sondası ile bir streptavidin kaplı slayt sabitlenir. Görüntüleme ve barkod sayma dijital analizörü kullanılarak yapılır. hareketsiz barkodlu miRNA'lar görüntülendi ve bir mikroskop ve kamera kullanarak görüntülü ve benzersiz barkod deşifre ve sayılır vardır. Veri Kalite Kontrol (QC), normalleştirme ve analiz tahlil yazılımla birlikte özel tasarlanmış veri işleme ve analiz yazılımı tarafından kolaylaştırılır. Deney ifade geniş bir aralığı üzerinde, yüksek doğrusallığı, hem de yüksek hassasiyet gösterir. Örnek ve deney hazırlanması enzimatik reaksiyonlar, ters transkripsiyon ya da amplifikasyon içermez; birkaç adım vardır; ve büyük ölçüde Araştırmacı etkilerinin azaltılması ve yüksek tutarlılık ve teknik bir yeniden üretilebilirlik ile sonuçlanır otomatiktir. Burada, irritabl bağırsak sendromu dolaşan miRNA tedirginlikler tanımlamak için bu teknolojinin uygulanmasını açıklar.

Giriş

genel nüfusun% 15 ve sağlık hizmetleri üzerinde önemli bir yük temsil - İrritabl Bağırsak Sendromu (IBS) 10 afflicting, Gastroenteroloji en yaygın ayakta tanıdır. IBS için Şu anda, hiçbir genel kabul gören tanı biyomarkırlar (yani, tanı klinik semptomlara göre ve GI malignite, İltihabi Bağırsak Hastalıkları ve gastrointestinal (Gİ) enfeksiyonları gibi diğer organik bozukluklar, iktidar olduğu). Böyle IBS, yüksek hassasiyet ve doğruluk (tekrarlanabilirliği) olarak subklinik histopatoloji ile ortak koşullarda gen ekspresyon profillerini incelerken gen ekspresyon profilleri tedirginlikler genellikle 1-3 ince olarak ihtiyaç vardır. miRNA'lar IBS 4,5 hem tanı ve fonksiyonel hedefler olarak tespit edilmiştir ve biz IBS-ilişkili biyolojik tedirginlikler 3,4,6,7 ve biyomarkırları dolaşan olarak kullanımını değerlendirmede özellikle ilgilendi. dolafl klinik kullanımıting biyomarkerlar nedeniyle kolaylığı ve hastaların biyomarkerların 'kaynak (örneğin, periferik kan) toplanması minimal invaziv doğası güncel ilgi çekicidir.

Gen ifadesi platformu deneyleri, çünkü kendilerine özgü kimyası ve akıcı, çoğunlukla otomatik iş akışı, hedeflenen keşif için transcriptome geniş ve özelleştirilebilir kapsama (tek bir reaksiyonda 800 hedef) sağlayan bir mikroarray platform sağlar. Onlar da transkriptomik hedeflerinin nicelleştirmesinde ekspresyon düzeylerinin geniş bir yelpazede üzerinde yüksek hassasiyet ve doğrusallık verim. Deney RNA'nın ters transkripsiyonu, cDNA, veya başka herhangi bir enzimatik reaksiyonları elde edilen amplifikasyon gerektirmez. Bu nedenle, düşük yoğunlukta veya nadir ek yeri varyantları olan RNA türünün amplifikasyonun yüksek devir sayıları ile getirilen potansiyel hatalar dijital sayım işlemiyle azaltılır. Bu, saflaştırılmış toplamı olarak örnek türleri, bu geniş bir yelpazede gelir(Örneğin, mRNA + MiRNA) RNA, RNA, formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş (FFPE) örnekte, hem de ham bir doku ve hücre lizatları, tahlillerde kullanılabilir.

Çevrede RNA'lar her bir hedef RNA üzerinde karşılık gelen bir bölgesini tanıyan bir hedef-özgül sekansı içeren, prob (yakalama ve raportör probları) içindeki bir çifti kullanılarak tespit edilir. Kısa RNA (örn, miRNA'ların) saptanmasını sağlamak için, olgun MiRNA dizisi molekülün 3 'ucuna özel bir oligonükleotid etiketi (miRtag) tavlanmasıyla uzatılır. Olgun hedef miRNA ve miRNA spesifik miRtag her ikisinin bir kısmına tamamlayıcı bir köprü oligonükleotid, özgüllüğünün sekansı sağlamak için kullanılır. Yakalama ve raportör Probes sırasıyla olgun miRNA miRtag kompleksinin uçları 3 've 5' ligate. yakalama sondaları, bunları bir streptavidin kaplı cam slayt yüzeyine takmak için izin 3 'ucunda bir biyotin etiketi, bir, Fixislayt yakalama prob miRNA miRtag-haberci prob kompleksi ng. Elektrik akımı, daha sonra, 5 'ucunda raportör prob tarafından taşınan, floresan barkod bir mikroskop ve şarj akuplaj düzenli (CCD) kamera kullanılarak görüntülendi sağlayan, slayt, yüzey üzerindeki karmaşık yönlendirmek için kullanılır. Barkodlar belirli hedef miRNA'lar sayısını veren, sayılır ve çözülür. Floresan barkod fazla 4.000 renk barkod kombinasyonu, özel bir RNA için, her bir kodlama oluşturmak için kullanılabilecek dört flüoresan renk biri tarafından işgal edilebilir altı pozisyondan oluşur.

Örnek hazırlanması (örneğin, RNA saflaştırma veya hücre / doku lizatı hazırlama), hem de yakalama ve raportör probların hibridleşmesi, tezgah yapılır. On iki örneği tek bir slayt üzerinde multiplekslenebilmektedir. gece boyunca hibridizasyon sonra diğer tüm numune hazırlama bir robot preparatif istasyonu tarafından gerçekleştirilmektedir. Yüklenen slaytlar sonra reklama aktarılırgörüntüleme, sayma, kod çözme ve veri işleme için igital analizörü. Ortaya çıkan veriler, daha kullanıcı kontrolü yüksek derecede işlenmiş eşlik eden yazılım alınır. eşsiz kimyası, basit hazırlık, otomatik doğa, basit veri türü (sayar) ve testin genel aerodinamik iş akışı, yüksek hassasiyetli gen ifadesi miktarının kolaylaştırmak gibi fonksiyonel koşullarda dolaşan miRNA ifade profilleri ve imzalar okuyan o yararlı bir araç yapma IBS.

Protokol

Burada anlatılan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Kurumsal Değerlendirme Kurulu (Clinicaltrial.gov # NCT00824941) tarafından onaylandı.

Tam Kan Örneklerinin 1. Koleksiyonu

  1. (Uzun süreli depolama için izin verme) bir RNA stabilize solüsyon içeren kan toplama tüpler içinde damar delme yoluyla çalışma katılımcılardan tam kan örnekleri (2.5 ml) toplayın ve RNA saflaştırma kadar -80 ° C'de saklayın.

2. Toplam RNA Arıtma

  1. g çözülme ve 2 saat süreyle kan tüpleri inkübe ve sonra x 5,000 10 dakika süreyle bir salıncak-out rotor kullanarak santrifüj. dikkatlice dökerek veya pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, bir atık tüp içine kapalı pipetleme süpernatantı.
  2. Pelet gözle eriyene kadar, RNaz içermeyen su, 4 mL ilave edilerek pelet yıkayın kapağı güvenli bir şekilde yerine ve vorteks. Santrifüj 10 dakika ve yeniden 5.000 xg bir salıncak-kova rotor kullanılarakAdım 2.1 'de açıklandığı gibi, süpernatant taşıyın.
  3. pelet (sağlanan) KM1 tampon 350 ul ekleyin. Vortex o kadar pelet gözle görülür çözülür ve otomatik toplam RNA ekstraksiyonu için 2 ml işleme tüpüne aktarın edilir.
  4. Robotik RNA ekstraksiyon sistemine otomatikleştirilebilir bir RNA özütleme kiti kullanılarak tam kandan, miRNA dahil olmak üzere hücre içi RNA'sı, otomatikleştirilmiş saflaştırma gerçekleştirmek.
    Kullandığımız otomatik robotik sistem aynı anda oniki örnekleri işleyebilir ve RNA arıtma protokolü tamamlamak için 3 saat sürer: NOT.
    1. Robotik RNA ekstraksiyon sistemine RNA saflaştırma kiti temin önceden yüklenmiş pipet uçları, santrifüj tüpleri, tamponlar, ve reaktifleri yükleyin.
    2. protokol seçimi menüsünden "Kan miRNA Kısım A" protokolü seçin ve çalışma başlatmak.
      NOT: Otomatik prosedürlerin açıklaması için Ek Malzemeler bakınız.
    3. Robot co sonraOtomatik miRNA arıtma protokolü mpleted Bölüm A, atık kabını boşaltın ve robotik sistemden kullanılan plastik ve reaktif kaplarını çıkarın.
    4. akıtılan RNA içeren tüm mikro-santrifüj tüplerine kapaklarını kapatın ve çalkalama adaptörü koyun. 5 dakika boyunca 65 o C'de örnekleri inkübe protokol seçimi menüsünden "Kan miRNA Kısım B" seçeneğini seçin.
    5. Robot miRNA arıtma protokolü Bölüm B çalıştıran tamamlandıktan sonra, derhal örnekleri kaldırmak ve buz üzerinde onları soğuk.
  5. Quantitate ve bir spektrofotometre kullanılarak saflaştırılmış RNA kalitesini değerlendirmek.
    Not: MiRNA tahlilinde, 33 ng asgari konsantrasyon için protokol ve sürede / ml gereklidir, ve tüm numuneler bir araya veya yokluğunun sağlamak için 1.9 bir 280/260 oranı ve 1.8 en az 260/230 oranı aşmalıdır önemli organik kirlenme, tahlil performansını etkileyebilir (17 Referans bakınız).
  6. C o -80 örnekleri saklamak

3. MiRNA Numune Hazırlama

  1. 33 ng 12 RNA örnekleri normalleştirmek / nükleaz içermeyen su kullanılarak ul.
  2. nükleaz içermeyen su kullanılarak deney kiti içinde temin MiRNA kontrol: 500 oranında seyreltilmiş 1 hazırlayın. buz üzerinde tutun.
  3. tavlama master karışımı hazırlayın: 10- ve 20-ul pipet kullanarak (verilen) tavlama tampon 13 ul, miRtag reaktifi (sağlanan) 26 ul ve (adım 3.2 hazırlanmış) miRNA kontrollerin 6.5 ul birleştirir.
  4. 10 ul bir pipet kullanarak, tavlama ana karışımı 3.5 ul ve on iki 0.2 ml şerit tüplerin her RNA numunesi (yani, 100 ng) 3 ul ekle. Flick, mix termalcycler bir tezgah üstü, mini mıkro (2000 xg) ve yer kullanarak aşağı spin (2 dakika süreyle 1 dakika, 65 o C 94 o C, ve 10 dakika süreyle 45 o C; 48 o C'de tutun) .
  5. 3 mikron birleştirerek ligasyonu master karışımı hazırlayın20 ul bir pipet kullanılarak (bazı PEG) ligasyon tamponu (Resim) ve polietilen glikol 19.5 ul. 10 ul bir pipet kullanarak adım 3.4, şerit tüplerin her bağlama ana karışımı 2.5 ul ekle.
    1. , Yavaşça karıştırın bir tezgah üstü küçük mıkro (2000 xg) kullanarak aşağı doğru döndürün ve 5 dakika boyunca 48 o C'de PCR dönün. 5 dakika sonra, 10 ul bir pipet kullanarak, 3 dakika boyunca 3 dakika, 46 o C 3 dakika, 47 o C 48 o C'de bunları PCR doğrudan her tüpe ligazı 1 ul ve inkübe 45 ° 5 dakika ve 65 ° C'de 10 dakika boyunca ° C; 4 o C'de tutun
  6. , Onları hafifçe karıştırın, PCR tüpleri çıkarın bir tezgah üstü, mini mıkro (2000 xg) kullanarak aşağı doğru döndürün ve ligasyon temizlik enzim 1 ul ekleyin (verilen). PCR (1 saat ve 10 dakika 70 o C 37 o C tüpleri inkübe; 4 o da tutun ​​kadar. 10 ul pipet kullanın.
  7. tüpleri çıkarın ve bir 100-ul pipet kullanarak, nükleaz içermeyen su 40 ul ekleyin, karıştırın ve bir tezgah üstü küçük mıkro (2000 xg) kullanarak aşağı doğru döndürün.

4. miRNA Melezleme

  1. buz üzerinde muhabir ve (verilen) yakalama prob setleri çözülme ve bir tezgah üstü küçük mıkro (2000 xg) kullanarak bunları aşağı doğru döndürün.
  2. 200 ul pipet kullanarak, melezleme ana karışımı oluşturmak için muhabir kodu kümesi tüpü (130 ul) ile hibridizasyon tamponu 130 ul ekleyin. Mix ve bir tezgah üstü küçük mıkro (2000 xg) kullanarak aşağı doğru döndürün.
    NOT: Muhabir ve yakalar sondalar panelinde yer alan her miRNA için özel ve standart olarak bulunuyor. Özel paneller ve kullanıcı tasarlanmış yakalama ve prob setleri dizayn edilebilir.
  3. 12 yeni 0.2 ml şerit tüplerde, 20 ul pipet kullanarak melezleme ana karışımı 20 ul ekleyin.
  4. 85 o C fo de adım 3,7 miRNA örnekleri denatürer 5 dk ve buz üzerinde onları serin. 10 ul bir pipet kullanarak adım 4.3 tüplerin her birine 5 ul ekle.
  5. Program 65 o C PCR 30 ul hacim hesaplanır (çalışma sonunda 4 o C rampa aşağı için programlamak değil) ayarı sonsuza anda sıcaklık ve ısıtmalı kapağı.
  6. 10 ul pipet kullanarak, mix bir tezgah üstü, mini mıkro (2000 xg) ile aşağı doğru döndürün ve hemen 65 o C de PCR yerleştirmek, her tüpe set yakalama probu 5 ul ekleyin en az 12 saat ve en fazla 30 saat boyunca inkübe edilir.

5. Hazırlık İstasyonu ve Dijital Analiz

  1. hazırlık istasyonu yükleyin.
    1. İstasyon kapağını açın ve reaktif plakaları yük (sağlanan), kartuş (sağlanan), pipet uçları (sağlanan), oniki 0.2 ml şerit tüpleri ve oniki boş 0.2 ml şerit tüplerde hazırlanan numuneler (sağlanan). şerit tüp kapakları ve reaktif plakası kapağını çıkarın. Hazırlık-istasyonu kapatınKapı ve kontrol panelinden uygun tahlil çalıştırın.
      NOT: Post-hibridizasyon işleme bakılmaksızın tahlil olma çalıştırmak, aynıdır. Tüm reaktifler ve plastik ürünleri önceden hazırlanmış ve oda sıcaklığına getirilmesi ve 2 dakika 2,000 x g'de reaktifi ihtiva eden 96 oyuklu plakalar aşağı iplik dışında hiçbir hazırlık gerektirir. Tüm bileşenler hazırlık istasyonunda açıkça tanımlanmış konumlara yüklenir. Otomatik prosedürlerin açıklaması için Ek Malzemeleri bakın.
  2. Görselleştirmek ve hareketsiz ve odaklı üçlü kompleksler barkod saymak.
    1. , Hazırlık istasyonundan kartuşunu çıkarın sağlanan kapak fişleri ile mühür ve kamera optik yukarıdaki yuvaya dijital analizörü yerleştirin.
    2. Tahlil kit belirtilen uygun tahlil (miRNA paneli testi) ve tahlil sürümünü seçin ve programı çalıştırın.
      NOT: Dijital analizörü sonra her numune pozisyon a için görünüm görüntülerin alanını alırfloresan barkodları izin t dört uyarma dalga boyları, okuma ve çözülecek. Belirli miRNA karşılık gelen belirli bir barkod, sayılır.
    3. bir internet bağlantısı üzerinden sunucuya doğrudan bir USB veri dosyalarını ihraç veya.

6. Veri İşleme ve Analizi

  1. "Ham Veri" sekmesine tıklayın ve "Import BİK Files" seçeneğini seçin. USB'den BİK dosyaları (ham veri dosyaları) içeren klasörü seçin.
  2. "İleri" ye tıklayın Tüm QC kutularını seçin ve "Al" butonuna tıklayınız.
  3. "Yeni Çalışma" sekmesine tıklayın. Ad ve çalışma tanımlamak ve kaydedin.
  4. Yeni çalışmada, "Yeni Experiment" sekmesini ve adını seçin ve yeni bir deneme açıklar. "İleri" ye tıklayın ve yüklenen ilgili ham veri dosyalarını içeren sol bölmeden RLF klasörü seçin. o seçildikten sonra, "Seçili tutmak" üzerine tıklatın ve sonra "İleri" butonuna tıklayınız.
  5. Eklemekaçıklamalar istenirse ve "İleri" butonuna tıklayınız.
  6. arka plan çıkarma yöntemini seçin; Negatif kontrol, boş şerit çıkarma, ya da kullanıcı tanımlı çıkarma ya seçilebilir. Seçildikten sonra, "İleri" ye tıklayın.
    NOT: Teknik parametreler ve çalışmanın biyolojik bağlama göre en uygun zemin düzeltme yaklaşımı belirler.
    NOT: Sayımlar, düşük bolluk hedefler için daha az kesindir. Biz burada açıklamak çalışmanın amaçları doğrultusunda, veriler ilk QC parametrelerini incelemek ve teknik çoğaltır genelinde farklı bolluk miRNA için sayılarındaki değişimi incelemek amacıyla arka plan düzeltme olmadan işlendi. Veriler daha sonra bir 25-sayımı arka plan eşiğini kullanılarak işlenmesi edildi.
  7. "İleri" ye tıklayın ardından "En İyi 100" normalleşme seçin ve.
  8. oran veri elde etmek için, "İleri" ye tıklayın ardından oran parametrelerini seçin ve.
  9. Click "bitirdi".
  10. adlı ex tıklayınSol bölmede periment "Normalize", "Grouped", "Oran Verileri" ve "Analizi Veri", "Ham" içeren bir açılır menü ortaya çıkarmak için.
  11. "Ham Veriler" üzerine tıklayın ve sağ bölmede bir QC raporu gözlemlemek. Varsayılan QC parametrelerini geçemiyor örneklerin yanında bir bayrak gözlemleyin. bayraklı örneklerini ve "QC / normalleştirme bayrağı örnekleri hariç tut" seçeneğini seçerek veri analizi aşamasından bayraklı QC örnekleri hariç sadece açıklandığı gibi reprocess, ya da olmayan yeni bir "Çalışması" oluşturun.
    1. İhracat "Ham", "Normalize", ya da CVS "Grouped" veri dosyaları veya başka bir istatistik veya mikroarray yazılımında analiz için başka bir uyumlu dosya biçimi.
  12. Sol bölmede "Normalize Verileri" i seçin ve örnekleri sağ bölmede analize dahil edilecek seçin.
  13. "Analiz" üzerine tıklayın ve (örneğin, "Isı Harita & # istenen analiz türünü seçin34 ;, "Keman Plot", "Kutu Grafiği", "Dağılım Grafiği", ya da "Histogram Plot"). İstenilen dışlama ölçütleri kutularını işaretleyin (örneğin, aykırı numune veya genleri hariç QC bayraklarla örnekleri hariç, kontrol genleri dışlamak ve / veya veri analizinden normalleşme probları hariç).
  14. İstediğiniz gibi bireysel örnekler seçin analize dahil edilecek.
  15. tek tek genler dışında, arzu edilen şekilde analize dahil olmak seçin.
  16. Seçilen istatistiksel veya veri görselleştirme manipülasyonu için parametreleri seçin ve "Finish" düğmesine tıklayın.

Sonuçlar

Fonksiyonel bozukluklarda Transkriptomik pertürbasyon ince olabilir ve güvenilir bir şekilde ifade bu küçük değişiklikleri tespit etmek için, gen ekspresyonunun ölçülmesi hassas olması gerekir. gen ifade platformu tahlil sisteminin yüksek otomasyonlu doğa ile teknik gürültüyü azaltır ve kullandığı eşsiz kimyası yüksek hassasiyetli gen ifadesi verileri üretir. Bu yöntemi kullanarak mümkündür ifade miktar, teknik 1 hem endojen (mavi nokta) yüksek tekrarlanabilirlik ve viral miRNA (temizlik genleri sarı noktalarla temsil edilmektedir turuncu nokta) gösteren şekilde gösterilmiştir çoğaltır. Bu yöntem, virüs (Şekil 2a) ve endojen (Şekil 2b), sağlıklı bir çalışma katılımcılarının tanımlandığı gibi, beklenen ifade sapma gösteren miRNA'lar kullanarak, IBS daki hedefleri olarak tespit edilebilir. Belirsiz olduğuna dikkat edilmelidir, viral miRNA'lar olupBurada tespit edilen insan genomu içine veya viral yükten entegre viral genler kaynaklanmaktadır. Tahlil yalnızca tek nükleotid özgüllük ile olgun miRNA'lar sayar gibi, benzer endojen insan miRNA'lar ile çapraz melezleme olası değildir. Bununla birlikte, bu moleküllerin farklı kararlı durum düzeyleri biyomarkırların olarak ilgi çekmektedir. Düşük ifade hedefleri arasında tedirginlikler algılanabilmesi için bu transkript doğru algılama daha bol transkript tarafından gömülmek değil gibi yöntemin hassasiyeti, izin verir. Ince tedirginlikler de güvenilir. Gözlenen Rakamlar edilebilir 3 ve 4 IBS ve sağlıklı kontrollere göre IBS-alt tiplerinde miRNA'lar dolaşan bu tedirginlikler bazı ve Şekiller 5 ve 6 (her ikisi de 3 uyarlanmıştır) en önemli iki farklı şekilde yükselmiş miRNA'lar göstermek (Şekil 5: miRNA 342-3p, Şekil 6: miRNA 150). IBS katılımcıların Şekil 6 bağlantılı yazılım tarafından üretilen sonuçların grafiksel çıktı örneğidir.

figure-results-1
. Şekil 1: İki teknik çoğaltır gelen normalize sayar Teknik iki ayrı kartuşları üzerinde çalışan çoğaltır yüksek doğrusal korelasyon göstermektedir (r 2 = 0.90, y 1.03x = - 0.4) normalize aralığında miRNA (ilk 100 normalize miRNA'lar ifade edilmiştir) sayımları (log2 x- ilgili sayısı ve y-ekseni). scatter plot sarı (8 genler) mavi (654 miRNA'ların) endojen insan miRNA'lar için veri, turuncu (80 miRNA'lar) endojen viral miRNA'lar ve temizlik genler içerir. Endojen viral miRNA'ların tahlil önceki sürümlerinde (sürüm 1.4 Burada kullanılan) kullanılabilir, ama onlar özel eklemeler olarak mevcut olmasına rağmen artık standart tahlil dahil edilir./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2:. Sağlıklı Bireylerde karşı IBS-kabızlık (IBS- C) Viral ve Endojen İnsan miRNA'lar Normalize sayar pertürbasyonlarının (a) viral (turuncu) ve (b) endojen insan miRNA'lar (mavi) Bu örnekte, belirgindir IBS-C katılımcıları (y-ekseni) (log2 dönüştürülmüş) miRNA sayımları sağlıklı kontrollerle (x-ekseni) miRNA sayımları (log2 dönüştürülmüş) karşı geriledi. miRNA'ların çoğunluğu her iki toplumda da çok benzer ifade, ancak bazı özellikle korelasyon sapma. Bu sapmalar hem nadir ve bol miktarda dile hedefler arasında belirgindir. LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3:. MiRNA'lar önemli ölçüde ve Düzgün Farklı Olarak Sağlıklı Bireylerde karşılaştırıldığında IBS olarak ifade edilmiştir Farklı Olarak IBS miRNA'lar kategoriler içinde tutarlılık kontrolleri ile istatistiksel anlamlılık testleri birleştiren doğrusal diskriminant analiz etki boyutu yöntemi kullanılarak ortaya çıkar dile getirdi. Için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.

figure-results-4
Şekil 4:. MiRNA'lar önemli ölçüde ve Düzgün Farklı Olarak Sağlıklı Bireylerde karşılaştırıldığında IBS Alttipleriyle olarak ifade edilir miRNA'lar di edildi(: ishal, -C: -D kabızlık) fferentially IBS-alt tiplerine olarak ifade edilmiştir. kategoriler içinde tutarlılık kontrolleri ile istatistiksel anlamlılık testleri birleştiren doğrusal diskriminant analiz etki boyutu yöntemi kullanılarak sağlıklı kontrollere göre bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.

figure-results-5
Şekil 5:. MiRNA 342-3p Diferansiyel İfade etiyolojisi bilinmeyen kronik karın ağrısı İBS bir temel belirtisidir. kutu arsa miR-342-3p (y-ekseni üzerinde normalize sayar), etiyolojisi bilinmeyen kronik mesane ağrı ile ilişkili bir miRNA, sağlıklı kontrollere göre tüm IBS alt tipleri arasında yüksek sayılarında da dolaşımda mevcut olduğu tespit edilmiştir göstermektedir. çubuklar olmayan aykırı aralığı temsil kutuçeyrekler arası aralık ve mavi kare medyan sayısı es. 3 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-6
Şekil 6: miRNA-150 Diferansiyel İfade IBS katılımcıları sağlıklı kontrollere (y ekseni üzerinde log2 dönüştürülmüş sayıları) ile karşılaştırıldığında miR-150 sayar dolaşan anlamlı derecede yüksek olduğunu gösteren bir keman arsa.. Eğrileri kategorisinde sayımların sıklığını göstermektedir dikey çubuklar 1 st ve 3. çeyrekleri temsil eder ve kırmızı kare medyan sayısını gösterir. 3 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

Özellikle MiRNA deneyi için, reaktifler lizatları ile kullanım için optimize edilmemiş gibi, (bu mRNA ve protein deneylerinde kullanılabilir) saflaştırılmamış lizatları kullanımı kritik değildir, ve numune hazırlama reaksiyonları inhibe olması muhtemeldir. Buna ek olarak, kirletici maddeler ligasyon ve örnek saflaştırma reaksiyonları inhibe edilebilir (örneğin, guanidinyum bileşikleri, etanol ve fenoller) liziz ve RNA saflaştırma adımları taşınan. İyi kalitede RNA miRNA testinin duyarlılık ve doğruluk için kritik öneme sahiptir.

ısıtılmış kapak ile, bir PCR kullanılarak bütün reaksiyon adımları performansını optimize etmek için uygun bir sıcaklık kontrolü elde etmek için önemlidir. Aşama 3.5.1 sırasında, ligaz ilave edilmesi sırasında sıcaklık muhafaza edilmesi amacıyla ısıl gelen şeritler kaldırmak için önemlidir. şeritler Çıkarma ligaz eklemek içinreaksiyonu tehlikeye atar. melezleme adımları gerçekleştirirken, tüplerde reaktiflerin bu muhabir probları kesme olabilir, dinç sarsıntı, pipetleme veya iterek önlemek için kritik öneme sahiptir. En iyi performansı ve tutarlılığı sağlamak için, iyice yumuşak titreşmesinde tarafından tüplere reaktifler karıştırmak için önemlidir. Her zaman karıştırıldıktan sonra tepkileri aşağı spin ve yeni bir pipet bir reaktif doğru pipetlenmesini sağlamak ve yanlışlıkla çapraz bulaşmayı önlemek için dağıtılır her zaman ucu kullanın.

Değişiklikler ve Sorun Giderme

kod setleri ilgi sadece hedefleri içerecek şekilde özelleştirilebilir. Bu sayede, maliyetler ayrıca soruşturma veya biyo-imza doğrularken geniş örneklem kümelerinin test etmek için izin vermek için dengeli olabilir. Özel sondalar alakart menüsünde bulunan genler veya hedefler için değil dizayn edilebilir. az-bol hedefler veya düşük konsantrasyon RNA duyarlılık olabilirve / veya daha yüksek çözünürlükte bir dijital sayma kullanarak daha uzun bir melezleştirme süre izin manipüle.

Çalışmamızda tam kandan toplam RNA ile önceden tanımlanmış 800 hedef miRNA paneli kullanılır; Ancak, analizler bir daha hedefli bir yaklaşım gerekiyorsa az miRNA'lar içerecek şekilde özelleştirilebilir. İki kartuş rahatça robotik hazırlık istasyonunda sonrası hibridizasyon işleme geçirilir ve ertesi gün dijital analizör üzerinde görüntülü olabilir çünkü 24 numune toplam 12 iki takım içinde sendeledi, tek bir günde hazırlanabilir. 12 toplu olarak numunelerin Şaşırtmalı işlem melezleştirme süresi standart önemlidir. Görüntülü edilmiş kartuşları kaydedilir ve veri analizleri daha yüksek çözünürlüklü tarama nadir miRNA'ların tespiti geliştirmek olabileceğini düşündürmektedir eğer yeniden taranması gereken 4 o C'de saklanabilir. nadir moleküllerin tespiti de, daha uzun bir süre örnekleri hibritleme ile geliştirilebilir; Bununla birlikte, uzun süreli hibritleme Resul olabiliraşırı doygunluk t ve başlangıç ​​RNA konsantrasyonları (hücre dışı vezikül kaynaklı RNA gibi) düşük ise, yalnızca sonuçları artırabilir. Platformun duyarlılık ve hassasiyet nispeten düşük miktardaki miRNA'lar güvenilir sayılır izin verir.

Tekniğin Sınırlamalar

tarif edilen gen ifadesi tahlil platformu sadece dizi başına 800 hedeflere kapasitelidir. Bu nedenle tüm miRNA transcriptome / tüm transcriptome çalışmaları için uygun değildir. Sadece, bilinen açıklanan ve belirtilen hedefleri platformu kullanılarak tespit edilebilir, bu nedenle yeni bir molekül türü keşfi için uygun değildir. Bu RNASeq veya diğer geleneksel mikrodizi yöntemleri gibi başka yöntemler, tüm transcriptome keşif çalışmaları için daha uygundur.

Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi

IBS semptomlarının bir kombinasyonu ile karakterize edilir principally karın ağrısı dahil olmak üzere; viseral aşırı duyarlılık; ve sık sık diyare, kabızlık, ya da her ikisi 9,10 bir kombinasyonu gibi barsak bölgesi değişir. İBS belirtileri bilinen organik nedeni var, ve hastalar klinik olarak anlamlı iltihabı, mide-bağırsak dokuları ya da sistemik belirteçlerin 9-12 histopatolojik değişimleri ile sunmazlar. Araştırma IBS biyolojik düzensizliği ortak temalar inflamasyon ve bağışıklık fonksiyonu yaklaşık 10 gelişmekte olan, ince subklinik ve heterojen olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, biz deneyci tanıttı değişimini kontrol ve güvenilir gen ifadesinde ince tedirginlikler saptayabilen bir platformu kullanmak gerekiyordu. tahlil ve sistemin benzersiz nitelikleri örnek işleme standardize ve yüksek tekrarlanabilir veri üretmek için teknik varyans azaltarak, otomasyon yoluyla taşıma deneyci azaltır. Bu özellikler odaklı araştırmalar için izin ve son derece hassas ve r üretmekeplicable verileri. intensity- veya amplifikasyon temelli yöntemler kullanılarak bu daha bol hedeflerin sinyalleri tarafından gözden kaçan ya da gömülmek olabilir düşük sentezleme hedefleri arasında ince tedirginlikler ve tedirginlikler tespiti için izin verir. PCR tabanlı mikroarrayler ve RNAseq yöntemleri tarif platformu kullanarak uygulanabilir alternatifler ve daha yüksek verimlerin istenmiş ya da ne zaman alternatif olarak cazip olabilir Amaç tüm transcriptome karakterize etmek veya yeni moleküllerin aramak için zaman. Ancak, alternatif ve doğru hassas tespit ve nadir hedefler ve ince tedirginlikler miktarlarının yanı performans olmayabilir.

Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi

IBS katılımcılar dolaşan miRNA ifade anlamlı ve kategoriler içinde tutarlı hem de olduğu görüldü tedirginlikler bir dizi gösterdi. tespit miRNA'ların ilgili pathwa ile ilişkiliys ve fonksiyonel ağrı durumuna (miR-342-3p: Kronik ağrılı mesane) de dahil olmak üzere patolojik durumlar, 8 ve inflamasyon (miR-150) 13. örnek çalışma hedefleri ve ilgi sistemlerini tanımlamak için kullanılan bir keşif kohort dayanmaktadır. Bir daha hedefli, küçük miRNA dizi numune başına maliyeti düşürmek ve doğrulamak ve imzalar ve Biyobelirteçleri rafine için maliyet-etkin bir şekilde analiz edilmesi çok daha büyük gruplarda izin inşa edilmiştir. Gen ifade platformu tahlil sistemi mikroarray geleneksel keşif doğası ve rafine ve moleküler imzalar ve Biyobelirteçleri 14-16 test etmek daha hedefli, hipotez odaklı veri toplama arasında bir denge. Yöntem, tarif edilen bir hedef miRNA'ların ifade aşırı veya inhibe deneysel olduğu in vivo ve in vitro bir model molekül ve protein pertürbasyonları incelemek için kullanılır. Yeni deneyler mRNA ve p aynı anda ölçülmesi için izindoğrudan hücre ve doku lizatları roteinler. Ayrıca, periferik kan ve dışkı (örneğin, idrar) spesifik fraksiyonları arıtılmasını optimize ederek ve özelleştirme ve bazı tahlil parametrelerini, moleküler profilleri ve düşük molekül konsantrasyon fraksiyonları (örneğin, exosomal fraksiyonlar) imzalarını optimize ederek ele alınacaktır.

Açıklamalar

W.A.H., S.K.A., N.H.F. ve R.M.P. ABD patentine sahiptir (no. PCT/US14/38638) burada açıklanan araştırmadan kaynaklanan IBS'nin dolaşımdaki miRNA imzası için.

Teşekkürler

Yazarlar, ABD Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Hemşirelik Araştırmaları Enstitüsü ve Okul İçi Araştırma Bölümü'nden Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey ve Leeanne B. Sherwin'e Intramural Araştırma Eğitim Ödülleri; ve Burroughs Wellcome Fund'dan Howard Hughes-NIH Araştırma Görevlisi Ralph M. Peace'e özel destek.

Burada ifade edilen görüşler ve bu verilerin yorumlanması ve raporlanması yazar(lar)ın sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin resmi bir tavsiyesi, yorumu veya politikası olarak görülmemelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
nCounter Hazırlık İstasyonuNanostring N/ATemel
nCounter Dijital AnalizCihazı Nanostring/ATemel
SpektrofotometreNanoDropND-1000Uygun eşdeğer
SantrifüjHerhangi birN/AUygun eşdeğer
MiniMicroSantrifüjHerhangi birN/Akullanabilir uygun eşdeğer
Pipetler (1.000, 100, 20, 10 µ l)Herhangi birN / AUygun eşdeğer
Qiacube Qiagen9001292Uygun eşdeğer
PAXgene Kan miRNA Kitikullanabilir Qiagen763134Uygun eşdeğer
PAXgene Kan TüpleriVWR77776-026Uygun eşdeğer
nCounter İnsan miRNA Test Kitikullanabilir Nanostring150625Essential
nCounter Master KitNanostring100050Temel
nSolverNanostring N/ATemel
N kullanabilir kullanabilir kullanabilir kullanabilir

Kaynaklar

  1. Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
  2. Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
  3. Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
  4. Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
  5. Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
  6. Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
  7. Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
  8. Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
  9. Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
  10. Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
  11. Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
  12. Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
  13. Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
  14. Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
  15. Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133(2014).
  16. Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
  17. nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multipleks Gen EkspresyonuMikroRNA KantifikasyonuDijital Say mRNA EkstraksiyonuHibridizasyon AnaliziOtomatik Safla t rmaBiyobelirte Tespiti

İlgili makaleler