Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

10.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54735

⸱

27 Ekim 2016

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

Bu makalede

Özet

Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların değerli bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Lipid açısından zengin larva yemlerinin protokolleri, diyet floresan lipid analoglarının canlı görüntülenmesi ve gıda alımının miktarının belirlenmesi açıklanmıştır. Bu teknikler çeşitli tarama, görüntüleme ve hipoteze dayalı sorgulama tekniklerine uygulanabilir.

Özet

Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, larva zebra balığının, embriyo ortamında yumurta sarısının sonikasyonla oluşturulmasıyla oluşturulan tavuk yumurta sarısı lipozomlarının bir emülsiyonundan oluşan, lipit açısından zengin bir öğünün nasıl besleneceğini açıklar. Larvaları yumurta sarısı tüketimi için taramak için ayrıntılı talimatlar verilmiştir, böylece beslenemeyen larvalar deneysel sonuçları karıştırmaz. Tavuk yumurtası sarısı lipozomları, yağ asitleri ve kolesterol dahil olmak üzere floresan lipid analogları ile çivilenebilir ve bu da diyet lipid işlemesinin hem sistemik hem de hücre altı görselleştirilmesini sağlar. Yüksek ve düşük büyütmede hem dik hem de ters objektiflerle kısa ve uzun süreli canlı görüntülemeye elverişli olan larvaları monte etmek için çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Ek olarak, floresan lipid analogları ile beslenen larvaların lipitlerini ekstrakte ederek, lipitleri ince bir tabaka kromatografi plakası üzerinde tespit ederek ve floresanı ölçerek larva besin alımını ölçmek için bir test sunulmaktadır. Son olarak, prosedürlerin kritik yönleri, önemli kontroller, belirli deneysel soruları ele almak için protokolleri değiştirme seçenekleri ve potansiyel sınırlamalar tartışılmaktadır. Bu teknikler sadece odaklanmış, hipotez odaklı araştırmalara değil, aynı zamanda diyet lipid metabolizmasını ve gıda alımının kontrolünü incelemek için çeşitli ekranlara ve canlı görüntüleme tekniklerine de uygulanabilir.

Giriş

bağırsak diyet lipit işleme düzenleyen mekanizmalar, karaciğer karmaşık lipit sentezi ve lipoprotein metabolizmasını kontrol eder ve bu organların besin alımını kontrol etmek için merkezi sinir sistemi ile çalışmak nasıl tam olarak anlaşılamamıştır. Obezite, kalp-damar hastalıkları, diyabet ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının mevcut salgın hastalıklar ışığında bu biyoloji aydınlatmak için biyomedikal ilgi çekicidir. Hücre kültüründe Çalışmalar ve fareler diyet lipidler ve hastalık ve Zebra balığı (Danio rerio) arasındaki mekanik ilişkileri anlayışımız çoğunluğu sağladı bu çalışmayı tamamlamak için ideal bir model olarak ortaya çıkmaktadır.

Zebra balığı, yüksek omurgalılar 1,2 benzer gastrointestinal (Gİ) organları, lipid metabolizmasını ve lipoprotein ulaşım var hızla geliştirmek ve genetik uysal vardır. Larva zebrafish optik netlik in vivo çalışmalar kolaylaştırır, bir particulahücre dışı ortamın olarak GI sistemin çalışması için r avantajı (yani, safra, Mikrobiyota, endokrin sinyal) ex vivo. uyarınca, genetik, izlenebilir ve vesile birleştiren araştırma vücut ile Zebra balığı larvalarının görüntüleme yaşamak için modellemek için neredeyse imkansız bir diyet manipülasyonlar (yüksek yağ 3,4, kolesterol 5 ve -Karbonhidrat diyetler 6,7), ve kardiyovasküler hastalık 8 modelleri çeşitliliği, diyabet 9,10, karaciğer yağlanması 11-13 ve obezite 14-16, metabolik anlayışlar bir dizi sağlamak için ortaya çıkıyor.

Metabolik araştırma içine larva Zebra balığı geçiş önemli bir yönü zebrabalıkları ve Zebra balığı benzersiz güçlü istismar yeni testlerin gelişmesine diğer model hayvanlarda geliştirilen tekniklerin optimizasyonu olduğunu. Bu protokol teknikleri Lipi larva zebrafish beslemek için geliştirilmiş ve optimize edilmiş sunulurD-zengin yemek, hücre içi çözünürlük bütün vücut diyet lipit işleme görselleştirmek ve gıda alımını ölçün. o yağ ve kolesterol (lipidler ~ tavuk yumurtası,% 60 trigliserit kolesterol ~% 5 olduğu sarısı, ve% 35% 58 fosfolipit vardır oluşturan yüksek seviyede içerdiği tavuk yumurta sarısı lipit bakımından zengin bir yemek oluşturmak için seçildi ). Zebra balığı diyetler ve beslenme alayları laboratuarları 17 arasında standardize edilmemiştir olarak tavuk yumurta sarısı, tipik ticari zebrabalıkları Mikropellet gıdalar (~% 15 lipidler) ve belirli yağ asitleri türlerin bilinen yüzdeleri ile standartlaştırılmış bir yem olduğu avantajı daha fazla yağ sağlar. Ayrıca, yumurta sarısında Resim Floresan bir lipid analoglan ince katman kromatografisi yoluyla metabolizmasını araştırmak taşıma ve diyet lipidlerin 18 birikimini, hayati boya 3 ve karmaşık lipidlere kovalent eklenmesi ile, her iki hareket ederek lipid damlacıkları olarak resim hücresel bileşenleri görselleştirmek (TLC) 19 Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) (SAF yayınlanmamış veri) ve toplam besin alımı 20 için sayısal bir tahlil sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokoller Bilim Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Carnegie Institution (protokol no. 139) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlanması

  1. 14 saat 28 ° C'de yetişkin ve larvaları korumak: 10 saat aydınlık: karanlık döngüsü. Kabuk serbest Artemia (decapsulated olmayan taramalarla, 14 dpf'e başlayarak) ve ticari mikropelletler ile günde iki kez yetişkin besleyin.
  2. Bu protokoller AB kökenli doğal yumurtlama tarafından toplanan 6-7 dpf larvaları kullanımı için optimize edilmiştir. Protokoller diğer yaştan ve her kökenden larvalar için modifiye edilebilir. eksojen yiyecek önce 6 dpf vermeyin.
  3. Embriyo medya Tricaine (EM) ile larva, oda sıcaklığında (RT) (4 mg, 100 ml EM başına / ml Tricaine 4.2 mi) anestezisi.

Lipid zengin Yumurta Sarısı Feed 2. Hazırlık

  1. Hazırlayın ve tavuk yumurta sarılarını saklayın. 12 tavuk yumurtası sarısı ve beyaz ayırın. , Kısım 1 mi 1.5 içinde sarısı Havuz1 yıla kadar -80 ° C up ml tüpler ve mağaza (12 sarısı ~ 80 alikotları yapacaktır). beyazlar, mağaza havuz ve lipid-fakir, proteince zengin yem olarak kullanmak.
  2. İstenirse Hazırlama Floresan bir lipid analoğu (ler) Yumurta sarısı beslemesine eklenmesini sağlar.
    1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, opak cam tüplerde, kısım (aşağıdaki nota çözücüler tartışmaya bakınız) / ml 0.1 ug% 100 etanol veya% 100 kloroform içinde alınan, toz haline getirilmiş Floresan bir lipid analoğu Askıya parafilm ile kaplayın ve saklayın. Nedeniyle organik çözücü, hızlı buharlaştırma, uzun süreli depolama için ~ 400 ul daha az kısım birimleri kullanmayın.
      Not: bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edildiği takdirde, kloroform fazla N2 altında daha hızlı kurur, bir lipid analoğu olan büyük miktarlarda kullanılır. bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edilir ise, adım 2.2.4 lipozom besleme eklemeden önce kurutuldu ve yeniden süspansiyon haline olmak zorunda değildir, ancak toplam etanol konsantrasyonu 0 geçmemelidir.Lipozom besleme içinde% 1 etanol, potansiyel olarak karıştırıcı fizyolojik etkilerini önlemek için.
    2. Floresan yağlı asit analoglan için: EM 20 ml% 5 yumurta şansı emülsiyonun toplam hacmi hazırlayın. Bu kaynaktan canlı konfokal görüntüleme ve gıda alımı deneylerinde ya da 1 ug / ml 6.4 uM 4,4-difloro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indasen bir son konsantrasyon (BODIPY Cı 16) 5 ml lik kısımlar halinde hazırlanması stereomikroskop görüntüleme için BODIPY C12. 1.5 ml'lik plastik tüp içine Floresan bir lipid analoğu istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun.
    3. Hemen tüpün tarafı aşağı akışı pipetleme 5 ul% 100 etanol içinde tekrar süspansiyon, 95 ul EM ekleyin ve iyice karıştırın.
      Not: Karışım homojen görünmelidir; renkli lipit tüp tarafta kalır veya sıvı clumpy belirirse, lipit tamamen çözülmüş ve daha etanol gerektirir değil. fro tüp korumakbuz üzerinde m ışık ve mağaza.
    4. Floresan kolesterol analog: Canlı görüntüleme çalışmaları için 5 mi% 0.5-5, yumurta sarısı, emülsiyon 2.4 ug / ml kolesterol bir son konsantrasyon hazırlar. 1.5 ml'lik plastik tüp içine kolesterol istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun.
    5. Hemen sonra, tüp iki aşağı akış pipetleme saflaştınldı H2O RT% 1 yağ asidi içermeyen BSA 85 ul karışımı ile RT% 100 etanol içinde 15 ul içinde süspanse Işıktan tüp korumak ve buz üzerinde saklayın.
  3. Yumurta Sarısı Lipozom Besleme hazırlayın.
    1. 50 ml konik tüp içinde EM yumurta sarısı bir çözülmüş kısım ekleyin. 1-2 dakika boyunca seyreltilmiş yumurta sarısı karışımını Vortex; Karışım, homojen bir emülsiyon olarak görünür.
    2. Yeni, taze 50 ml konik tüp protein holdingler kaldırmak ve toplamak için ince mesh süzgeç vasıtasıyla karışımı dökün.
    3. Darbe SONICAlipozom oluşturmak için RT'de: a dörtte inç konik mikrotip (6 W çıkış yoğunluğu her set arasında 5-10 sn duraklatma 5 kez (5 x 1 sn, 1 sn kapalı)) yumurta karışımını te. Sonikatör güç ayarları bağımlı enstrüman ve bu nedenle her enstrüman ve mikro uç için optimizasyon gerektirir.
      Not: Sürekli kullanıma kadar homojenliği sağlamak için oda sıcaklığında lipozom karışımı sallayın.
  4. arzu edildiği takdirde, yumurta sarısı lipozomlara Floresan bir lipid analoğu ekleyin. Hemen Sonikasyon sonrasında, lipozomlar içine dahil 30 saniye boyunca yüksek hızda lipozom karışımı ve girdap içine hazırlanmış lipid pipetleyin. folyo tüp sararak ışıktan karışımı korumak ve oda sıcaklığında sallanan devam ediyor.

3. Besleme Paradigma

  1. Besleme için Larva hazırlayın.
    1. beslenme engelleyebilir belirgin morfolojik kusurlar için besleme, ekran larva başlamadan önce. 60 mm x 15 mm Petri kapları veya 6 veya 12-kuyu pla Transfer larvalarıTES EM asgariye düşürmek ve hazırlanan lipozom çözeltisi, 5 ml ile değiştirin.
    2. Gerekirse, EM 5 mi EM ve / veya 5 mi% 5 yumurta akı için beslenmemiş kontrol larvaları transferi ve paralel olarak tedavi.
  2. Yavaşça flüoresan lipid analogları varsa ışıktan korumak için devam ederken gıda alımını teşvik etmek için yem boyunca kuluçkaya rocker larvaları (30 rpm'de 29-31 ° C) sallayın. Larvalar ihtiyacı ışığa maruz kalması durumunda, bir renkli cam inkübatör kapaklı maruziyeti en aza indirmek.
  3. besleme süresinin sonunda, EM 3 kez özgürce yüzme larva durulayın.
    Not: Larva besleme sırasında herhangi bir noktada lipozomlar alıcı başlayabilir. bu larvalar aynı anda beslenme başlaması önemlidir ise, gıda alımı için ekran besleme 1 saat sonra (3.4) ve beslemeyi tamamlamak için yumurta sarısı emülsiyonu ile besleme başlamıştır tek larvaları dönün.
  4. az sayıda gıda alımı için bu noktada larvaları Ekran ea olmayabilirt (genellikle ~% 0-5). Onlar beslenen olmadığını belirlemek için buz üzerinde bir metal blok üzerinde anestezi ya da hafif soğutulmuş olan larva bağırsak inceleyin: lipozomlar tüketilen larva karanlık bir bağırsak (Şekil 1) sahip olacaktır.
  5. Hemen gıda alımı için görüntü veya işlem larvaları. Alternatif olarak, bir yerde taze EM larva ve 28 ° C'de inkübe metabolik işleme oluşmasına izin vermek.

Canlı Görüntüleme Larva Montaj 4.

  1. Montaj Medya hazırlayın.
    1. % 3 metil selüloz: -20 ° C 'de yıllık yakın kaynama EM, girdap, 4 ° C'de 2-3 gün tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında kaya ve mağaza 25 ml 0.75 g metil selüloz ekleyin. 4 ° C'de dondurma ve eritme işlemlerine ait döngülerin tekrar hava kabarcıkları kaldırır. larva montaj sırasında buz üzerinde% 3 metil selüloz saklayın.
    2. % 1.2 düşük montaj agaroz için: 0.3 g ilave 25 ml EM agaroz düşük eritmek ve 2 ml t içine kaynatın, kısım getirerek çözmekUBE ve sıcaklıkta bir blok üzerinde 26-28 ° C'de muhafaza. Kullanılmayan tam bölünen miktarları, oda sıcaklığında saklandı veya -20 ° C ve kullanım sırasında tekrar kaynatılır edilebilir. Agaroz larvalarının maruz ya da ısıtmalı aşırı olabilir önce işlemek için yeterli serin olduğundan emin olun.
  2. Düşük büyütme, orta hacimli canlı görüntüleme için, buz üzerinde metal bir blokta bir doku üzerinde bir cam slayt yerleştirin ve slayt soğumasını bekleyin. yapıştırılmış bir balıkçı satırı poker kullanarak,% 3 metil selüloz üzerine larva transferi, slayt üzerine (buz üzerinde 4 ° C'de muhafaza edilmiştir)% 3 metil selüloz bol miktarda uygulayın (0.41 mm çapında misina bir cam kılcal tüp sonu) bu metil selüloz seyreltilebilir olmayan (böylece aşırı EM drenaj) ve istenen şekilde larva konumlandırmak için troth oluşturun.
  3. kısa vadeli (<20 dk), bir dik yağ emersion amacı ile yüksek büyütmeli canlı görüntüleme, yöntem barınağa lamel ile larva monte edin.
    1. siyanoakrilat bazlı tutkal (Superglue) kullanınBir cam slayt bir ucuna aa 22 mm x 30 mm'lik bir örtücü cam ekleyin. lamel bitişik slaytta% 3 metil selüloz ince bir çizgi koymak ve geniş bir delik Pasteur pipetiyle slayt larva transfer etmek için bir poker kullanın. o metil selüloz sulandırmak olmayacak şekilde aşırı EM çıkarın.
    2. Bir poker kullanarak, yavaşça lamel yanında başlarını (sağ görüntü safra kesesi kadar yan, yukarı karaciğer daha fazla görüntüye sol taraf) onların yüzüne metil selüloz içinde larva yerleştirin.
    3. nazikçe ikinci lamel köşelerinde ve spot superglue larvaları köprü monte lamel lamel ve slayt diğer bir kenarını yerleştirin. Bu adım sırasında veya bu larvalar yaralanmamış kalırken görüntüleme böylece amacı ile aşırı baskı uygulamak etmemeye dikkat edin.
  4. Uzun vadede, dik daldırma amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz larva monte edin. agaroz sonra aktarmak% 1.2 düşük eriyik küçük bir kana bir larva ekleBir petri agaroz küçük bir hacme larva.
    1. Hızla Agaroz katılaşır önce poker ile larva yerleştirin. Agaroz 2-3 dakika kurumasını ve kurumasını önlemek için taze EM ile tam agaroz kapsayacak şekilde izin verin.
  5. Uzun vadede, ters amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz bir cam alt çanak larvalarını monte edin.
    1. Buz üzerinde bir metal blok soğutun. Aşırı soğutma ve larva donmayı önlemek için bir doku ile ayrılmış metal blok üzerinde çanak yerleştirin. çanak bir larva transferi ve bir doku ile fitilleme ile EM kaldırın.
    2. larva üstünde 28 ° C düşük erime agaroz (% 1.2) bir damla yerleştirin ve hemen bir poker (aşağı en iyi görüntüye sol tarafında karaciğer, safra kesesi aşağı görüntüye sağ tarafı) ile yerleştirin. Soğuk bloktan çanak çıkarın 2-3 dk kurumasını bekleyin ve agaroz kapsayacak şekilde taze EM yeterli hacim kazandırmak (~ 2-5 ml).

5. Gıda Alımıtahlil

  1. 6.4 uM BODIPY C16 ihtiva eden bir yumurta şansı lipozom Beslemenin sonunda, plastik bir 1,5 ya da 2 ml tüp içinde 10 yıkanmıştır larva az havuz EM çıkarın ve donma ek. örnekler birkaç ay boyunca ışıktan korunan -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
    Not: Eğer mümkünse, birden çoğaltır toplamak. (Kullanılan aynı kavrama ideal olarak larva) arka lipit floresan normalleştirmek için bu adımda beslenmemiş larvaları toplamak için önemlidir.
  2. Modifiye Bligh-Dyer lipit çıkarma 3,21 gerçekleştirin.
    1. Buz üzerinde örnek (2 O kullanılabilir Alternatif olarak arıtılmış, lH), 100 | il homojenizasyon tamponu (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) ekleyin. (: 1 sn kapalı 1 sn 5 sn toplam) bir mikrotip sonikatör ile buz üzerinde homojenize. Bu larvaların tamamen homojenize olup olmadığını kontrol edin; değilse, tekrarlayın. 13 ml'lik atılabilir bir camdan yapılmış bir kültür tüpüne transfer (diğer cam tüpler kullanılabilir).
      Not: kloroform tehlikelidir; Tüm takip eden lipit eski yerineBir kimyasal kaput oda sıcaklığında çekiş adımlar.
    2. (: Metanol kloroform) 2: Kullanılan homojenizasyon tamponu her 100 ul için 1 375 ul ekleyin. Vortex 30-60 sn, kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu başına kloroform ve vorteks 30 sn 125 ul ekleyin, 10 dakika inkübe edilir.
    3. 200 mM Tris pH 125 ul ekle 7,5 kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu (ışıktan korunan 2,000 x g, 5 dakika, RT) vorteks 30 saniye ve santrifüj başı. Dikkatle santrifüj örnekleri kaldırın. Bir üst faz sulu bir larva kalıntılardan bir arayüz, ve bir alt organik faz (lipidler içerir) olarak iki faza ayrılır.
    4. temiz bir cam pipet ile alt organik fazı toplamak ve temiz bir 13 ml'lik cam tüp içine aktarın.
      Not: arayüzde sulu fazı ve larva enkaz önlemek için özen gösterin; kirlenme meydana gelirse, santrifüj adımı ve hatırlamak tekrarlayın. Üst, sulu faz atın; o kaldırmak ve bu atmak yararlı olabilirOrganik fazı toplama önce aşaması. Örnek 1 aya kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
    5. ışıktan koruyarak, vakum altında organik faz (0.12 atm) kurutun. lipid çözünürlüğü azaltacaktır gibi sıvı buharlaştırılarak sonra numuneleri kuru devam etmeyin. 2'de lipitleri tekrar süspansiyon: buz üzerinde ve mağaza: 1 (metanol kloroform). kloroform uygun hacmi: metanol çözeltisi kullanılan algılama yöntemine bağlı olarak değişir; düşük başlangıç ​​ve gerektiği gibi sulandırmak devam ediyor. Genel kural 10 havuza larva için 10 ul kullanmaktır.
  3. Bir kanalize TLC plaka üzerine eşit aralıklı aralıklarla tüm numune hacimleri nokta ve rutin biyomoleküler görüntüleme (örneğin, bir floresan plaka okuyucu) için kullanılan bir lazer tarayıcı ile plaka tarayın. 510-665 nm 500-650 nm ve maksimum emisyon bir maksimum eksitasyon sahip maddeler listesine dahil Floresan bir lipid analoglan için, 520 nm'lik bir emisyon toplama 488 nm lazer ve kullanımı.
    1. görüntüleme yazılımı ile her noktada toplam floresan ölçmek.
      Not: Doğal eşleştirilmiş, beslenmemiş larva örneklerin floresan çıkarılarak arka plan lipit floresan meydana Doğru.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

29-31 ° C'de bir rocker verildiğinde, sağlıklı larvaların (≥95%) çoğunluğu 1 saat içinde yemek. yumurta sarısı emülsiyonu tüketen üzerine, larva bağırsak rengi koyulaşır. Çok koyu bağırsaklar 2 saat (Şekil 1) görülebilir. Larvalar beslenmemiş ya da beslemek için başarısız olursa, bağırsak açık kalır. Larva beslenen yumurta beyazı sergi renkli karartmak değil şişmiş bağırsak lümen.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan teknikler araştırmacılar, bir lipit bakımından zengin yem ile larva Zebra balığı tedavi canlı larva diyet lipit işleme görselleştirmek ve larva besin alımını ölçmek için izin verir. başarı sağlamak için, özel dikkat birkaç kritik adımlar verilmelidir. Ticari tavuk yumurtası değişir; Potansiyel değişkenliği en aza indirmek için biz omega-3 yağ asitleri için zenginleştirilmiş değil kafes ücretsiz tavuk organik yumurta tüm testleri gerçekleştirmek. Düşük besleme oranları daha genç 6 gıda alımını (yani,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, görüntüler için Meng-Chieh Shen'e, el yazması hakkında yararlı yorumlar sağladığı için Jennifer Anderson'a ve bu tekniklerin geliştirilmesine katkılarından dolayı Farber laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. Bu çalışma NIDDK-NIH ödül RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (Zebra Balığı Fonksiyonel Genomik Konsorsiyumu: PI Stephen Ekker ve Co-PI S.A.F) ve F32DK096786 (JPO) tarafından finanse edilmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. G. Harold ve Leila Y. Mathers Yardım Vakfı tarafından S.A.F laboratuvarına ve Carnegie Bilim Enstitüsü bağışına ek destek sağlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Trikain (etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu)Sigma-AldrichA5040-25GLarva zebra balığı için anestezi
Tavuk yumurtasıN/AN/A Organik, kafessiz yumurtalar, omege-3 yağ asitleri için zenginleştirilmemiş
Ultrasonik işlemci 3000 sonikatörMisonix, Inc.S-3000Yumurta sarısı lipozomları yapmak için
Sonabox akustik muhafazaMisonix, Inc.432BYumurta sarısı lipozomları yapmak için
1/8" konik mikro uçluMisonix, Inc.419Yumurta sarısı lipozomları yapmak için
Amber şişeler (4 ml, cam)National Scientific13-425Lipid depolama; şişeler, üstü açık kapaklar ve septa kapağı içerir
Incu-Shaker Mini Benchmark1222U12Yemler için kuluçka çalkalayıcı
BODIPY FL C16 Thermo Fisher ScientificD3821Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Hekzadekanoik Asit)
BODIPY FL C12 Thermo Fisher ScientificD3822Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Dodekanoik Asit)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher ScientificD3834Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Pentanoik Asit)
BODIPY FL C5Thermo Fisher ScientificD2183Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Propiyonik Asit)
TopFluor kolesterol Avanti Polar Lipidler A.Ş.810255Floresan lipid analogu; 23- (dipirroteneboron diflorür) -24-norkolesterol
TopFluor kolesterol çözünürlüğü içinyağ asidi içermeyen BSASigma-AldrichA0281-1G
Metil selülozSigma-AldrichM0387Canlı larva görüntüleme için montaj ortamı; 75 x 25 x 1 mm
Düşük erime agarozThermo Fisher ScientificBP165-25Canlı larva için montaj ortamı Görüntüleme; 22 x 30
VWR mikroskop slaytları VWR 16004-422Canlı görüntüleme için larvaların montajı
Lameller Kapak Camı12-544ACanlı görüntüleme için montaj larvaları
Süper yapıştırıcıLoctiteLOC01-30379Canlı görüntüleme için montaj larvaları
FluoroDish (cam tabanlı tabak)World Precision Instruments, Inc. FD35-100Canlı görüntüleme için larvaların montajı; 35 mm çanak, 23 mm cam, 0,17 mm cam kalınlığı   
Konfokal mikroskopLeica MicrosytemsSP-2, SP-5Yüksek büyütmeli canlı görüntüleme için
büyütmeli canlı görüntüleme içinStereoskopNikonSM21500
Cam kültür tüpleri Kimble73500-13100Lipid ekstraksiyonu; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus ThermoQuestSC210ALipid ekstraksiyonu
Kanallı TLC plakalarıWhatman ScientificWC4855-821Gıda alımı testi; LK5D Silika Jel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um kalınlığında;
Durdurulan Kanallı TLC plakalarıAnaltech, Inc.66911Gıda alımı testi; Whatman Scientific TLC plakaları için doğrudan değiştirme
Typhoon 9410 Değişken Modlu GörüntüleyiciGE Healthcare9410Gıda alımı tahlili için floresan plaka okuyucu
ImageQuant yazılımıGE Healthcare29000605Gıda alım tahlilinin analizi
5 3/4' Geniş çaplı, borosilikat tek kullanımlık pastör pipetleri     Kimble63A53WTLarvaların aktarılması
mikroskopDüşük Mikroskop

Kaynaklar

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485(2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21(2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474(2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipid MetabolizmasıFloresan Lipid AnaloglarıYumurta Sarısı Lipozomlarıİnce Tabaka KromatografisiFloresans KantifikasyonuDiyetsel Lipid İşleme
Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.