Yağ Düzeylerinin Belirlenmesi A Yüzdürme tabanlı Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Özet

Burada üçüncü instar (L3) Drosophila melanogaster larva evresi içinde organizma yağ seviyelerini ölçmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, değişmiş yağ mağazaları ile larva ayırt etmek için yağ dokusunun nispeten düşük yoğunluğa patlatır. Yüzdürme-tabanlı analiz, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik tarama için değerli bir araçtır.

Özet

Drosophila melanogaster, yağ regülasyonu çalışmasında önemli bir deneysel sistemdir. Şu anda Drosophila'da depolanmış yağ seviyelerini ölçmek için çok sayıda teknik mevcuttur, ancak çoğu pahalı ve / veya zahmetlidir ve açık sınırlamaları vardır. Burada, L3 Drosophila larvalarında organizma yağ seviyelerini hızlı ve ucuz bir şekilde belirlemek için bir yöntem sunuyoruz. Teknik, yağ ve yağsız dokular arasındaki yoğunluk farklılıklarına dayanır ve yağ ve yağsız fenotiplerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu yöntemin doğruluğunu, nötr lipid ekstraksiyonu ve kütle spektrometresi (GCMS) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ile belirlenen vücut yağ yüzdesi ile karşılaştırarak doğruladık. Ayrıca, larvaların toplanması ve senkronizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra ilgili deneysel tarifleri de özetliyoruz. Aşağıda sunulan teknik, en yaygın kullanılan lipid kantitasyon yöntemlerindeki büyük eksikliklerin üstesinden gelir ve larvaların bütünlüğünü korurken L3 larvalarını yağ düzenleme fenotipleri için hızlı ve hassas bir şekilde taramak için güçlü bir yol sağlar. Bu test, Drosophila kullanılarak metabolizma ve yağ regülasyonu çalışmaları için geniş uygulamalara sahiptir.

Giriş

Drosophila melanogaster genetik ve diğer temel biyolojik soruların çalışmada bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Drosophila birçok insan hastalıklarının çalışmada güçlü bir araç olduğunu son birkaç on yıl içinde, bu netlik kazanmıştır. İnsan hastalıklarıyla bağlantılı genlerin% 80 bir tanımlanmış uçucu ortologu ¹ etmek ^- - 70 de ^4, Drosophila kompleks hastalıkların çalışma için basitleştirilmiş yapılmamış çevrilebilir bir sistem sağlar. Özellikle Metabolizma böyle çalışmaya yararlanmıştır. Sadece iyi uçar ve insanlar arasında korunmuş metabolizmanın genetik olarak, ama ilgili organ ve hücre tipleri, aynı zamanda ^2,5 çok benzerdir. Örneğin, memeli karaciğer ve beyaz yağ dokusunda ⁶ yapılanlar hem triasilgliseridler (TAG) ve glikojen, fonksiyonlar benzer sinek mağazaların vücut yağ. Insan obezite için bir model olarak Drosophila kullanarak büyük ölçüde lipit anlayışımızı geliştirdimetabolizma ve obezite ⁷ genetiği. gelişme larva bu besleme adanmış ve enerji depolama pupariation sırasında kullanılmak üzere depolama veya kullanım besin ayrılmasını çalışmak için özellikle yararlıdır.

Şu anda, Drosophila yağ depolama düzeylerinin belirlenmesi birçok farklı sayısal yöntemler vardır. En yaygın olarak kullanılan yöntem birleştiğinde kolorimetrik (CCA) ^8,9 olduğunu. CCA İnsan serumundaki TAG düzeylerinin belirlenmesi için geliştirilmiş ve sonunda renkli bir ürün üreten bir redoks-bağlanmış reaksiyonda elde edilen çeşitli reaksiyonlara tabi olacak trigliseritlerin omurgasından serbest gliserol öncül faaliyet göstermektedir. ışığının belirli dalga boyu Absorbans, gliserol mevcut başlangıç ​​miktarını belirlemek için ölçülür. Bununla birlikte, gliserol da TAG ilave olarak mono- ve diasilgliseridler serbest bırakılabilir ve bu nedenle, S doğru bir göstergesi olabilirizlenmekte vücut yağ ^9. Ayrıca, ezilmiş yetişkin sineklerin göz pigmenti bazı absorbans okumaları müdahale ve sonuçları ^9,10 karmaşık hale getirebilir. Bu nedenle, CCA eşlik yoğunluk ^10,11 nicelendirilebilir en lipit ailelerinin ayrılmasını sağlar, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile doğrulanması gerekir. Ancak, steroller gibi bazı lipit sınıfları analiz edilemez ve farklı bir şekilde ¹² sayısal olmalıdır. Kütle spektrometrisi (MS) önemli hücresel lipidlerin ^12,13 bütün sınıfları ölçmek için doğru bir yöntemdir. Ancak, MS tarafından analiz için gerekli lipid çıkarma prosedürleri hem zaman alıcı (çoğu almayı neredeyse bir tam gün) ve yüksek maliyetlidir. Burada hızlı ve ucuza Drosophila melanogaster L3 larvaları organizma yağ düzeylerini belirlemek için alternatif bir yöntem mevcut.

Aşağıda sunulan yöntem yağ dokusu ve yağsız doku arasındaki yoğunluk farkı patlatır. memeli faT hücre 1.06 g / ^{ml, 15} yoğunluğunda olarak, yaklaşık 0.9 g / ml ¹⁴ ise, iskelet kası bir yoğunluğa sahiptir. Bu fark, yağ yüksek mağaza hayvanlar onları sabit yoğunluklu bir çözelti içinde daha iyi bir yüzer sağlayacak yağ alt mağazalar, hayvanların daha düşük bir yoğunluğa sahip olacağı anlamına gelir. Bu özellik, pahalı olmayan ve invazif olmayan hem de olan Hayvanların büyük sayıda son derece hızlı taranması için izin verir. Yüzdürme tabanlı analiz yanı sıra obezitenin ^16,17 yeni genetik ve nörolojik düzenleyiciler tanımlamak için yağ seviyelerinin bilinen düzenleyicileri değiştiren fenotipleri onaylamak için ikisi de kullanılır olmuştur.

Protokol

1. İlgi Genotiplerinde ile Sineklerin Gelen Yumurta Toplama

NOT: İdeal haçlar 150 bakire sinek ve en az 75 erkek oluşur. Stok koleksiyonları en az 200 sinekler oluşmalıdır.

1. üzüm tabak hazırlayın.
   1. 4 L'lik bir şişede 1.5 L damıtılmış su ile 37.5 g agar ekleyin.
   2. 121 ºC (250 ºF) 50 dakika süreyle otoklav su / agar karışımı.
   3. Su / agar karışımı otoklavlama iken, 500 mi üzüm suyu için 50 g sükroz ilave ve sükroz çözünene kadar ısıtılmış bir karıştırma plakası üzerinde bir karıştırma çubuğu ile karıştırıldı.
   4. Isı kapatın ve 70'in altında ºC üzüm suyu / sakaroz karışımı soğutmak için karıştırma devam edin. bir alkol termometre ile iç sıcaklığını kontrol edin.
   5. Üzüm suyu / sükroz karışımı ısınmaya bırakılmış ve çözünmesi için karıştırılmıştır (ör Tegosept) 3 g Drosophila anti-mantar maddesi ekleyin.
   6. su / Agar karışım otoklav dışında olduğunda, şişeyi bazen dönen irtibatta soğumaya bırakın.
   7. Su / agar karışımı ve üzüm suyu / sakaroz karışımı birleştirin ve iyice karışık kadar karıştırın.
   8. Küçük bir petri kabı (35 x 10 mm tarzı) kapak üzüm karışımı 10 ml - 8 eklemek için serolojik bir pipet kullanın. kapak duvarlarının yüksekliği dışbükey şekil oluşturmak için daha karışım yüksek taç izin verin.
   9. üzüm plakaları 4 ° C'de hava geçirmez bir kapta oda sıcaklığında 2 saat boyunca soğumaya ve daha sonra saklamanıza olanak sağlar.
2. maya hamurunu hazırlayın.
   1. 50 ml konik bir tüp içinde 4 g canlı aktif kuru maya 6 ml fosfat tampon çözeltisi (PBS) ilave edin ve pürüzsüz hale gelene kadar bir spatül ile karıştırın.
   2. Mağaza maya 4 ° C'de yapıştırın.
3. üzüm plakanın ortasına maya hamur küçük topak (yaklaşık 1/8 çay kaşığı) ekleyin. bir spatula ile herhangi bir pürüzlü kenarları pürüzsüz.
4. onlar ortam sıcaklığına ulaşana kadar bir kuluçka üzüm tabak yerleştirin.
5. bir yumurta toplama haznesi ve yer üzüm plaka w içine ilgi sinekler aktarınüstünde içe dönük i maya yapıştırın. Yumurta toplama haznesine bant üzüm plaka plaka dışarı düşmesine izin önlemek için. üzüm plaka altındaki önemli genotip ve tarih bilgilerini yazmak için emin olun.
6. sinekler üzüm plaka üzerinde yumurtalarını bırakmak için izin yumurta toplama haznesini upend.
7. Bir kutu yerleştirin veya yumurta toplama odaları üzerinde kapak ve 25 ºC bir kuluçka koyun.
8. 6 saat - sinekler 4 yumurtalarını bırakmak için izin verin.
9. Yumurta toplama odasının dışında üzüm plakasını alarak ve gıda onların şişenin içine geri sinekler aktararak toplama bitirin. üzüm plaka herhangi bir aşırı maya macunu temizlemek için bir spatula kullanın. 24 saat ~ 25 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde daha büyük bir petri tabağına deposu üzüm plakası.

Deneysel Gıda 2. Aktarım Larvalar

1. Deneysel yemek hazırlamak.
   NOT: Bu yemek tarifi Bloomington stok merkezi tarifi ¹⁸ dayanmaktadır. önemli değişikliklersahne dolaşıp zamanlaması ile değerlendirilen gıda besin değerini optimize etmek için maya miktarı artmış içerir (112 arası - 120 saat 25 ° C'de yumurta toplandıktan sonra). sağlık ve deneysel larva gelişimi için bu tarifi doğru bulduk birlikte, herhangi bir gıda tarifi adım 3.10 listelenen örnekleri pozitif ve negatif kontroller, kabul edilebilir belirli bir kalibre edilmesidir.
   1. 1.600 mL distile su ölçün.
   2. 134 g mısır unu, 10.6 gr Drosophila Agar tip II ve 1 L'lik bir beher içinde suyun bir kısmı (~ 500 mi) karıştırın. Motorlu bir el mikseri ile 2 dakika boyunca karıştırın.
   3. 70 g canlı aktif kuru maya, 18.4 g soya unu, 84.8 g malt özü, başka bir 1 L'lik bir kap içinde bir miktar su (~ 500 mi) karıştırın. Motorlu bir el mikseri ile 2 dakika boyunca karıştırın.
   4. her behere girdap ve 4 L'lik bir şişeye dökün. beher yıkayın ve balona eklemek için kalan su kullanın.
   5. döndürülerek karıştırılır, 140 ml hafif mısır şurubu ölçün ve balona ekleyin.
   6. Sıvı ortamda 121 ºC (250 ºF) 50 dakika süreyle otoklav.
   7. Otoklavlamadan sonra, 4 L'lik bir beher içine gıda dökün ve soğumaya bırakın. motorlu el mikseri ile harmanlayarak soğutma sürecine yardımcı.
   8. Şişe dokunun kadar soğuduktan sonra, 8.8 ml propiyonik asit ve 16.8 ml Drosophila mantar önleyici madde / etanol çözeltisi ilave edilir. İyice karıştırın. (Çözelti 70 ° C'yi etmez emin, 380 g Drosophila mantar önleyici madde L 1-200 derece etanol eklenerek ve çözünene kadar sıcak bir plaka üzerinde karıştırıldı Drosophila mantar önleyici madde çözeltisi olun).
   9. Gıda, yaklaşık 1 inç derin kadar şişe içine yiyecek dökün ve 2 için oda sıcaklığında soğumaya bırakın - 3 saat. 25 ºC 'de bir kuluçka şişeleri ve mağaza takın. Bir hafta içinde kullanın.
2. Bunu skor gıda flakon üst tabakası içine bir spatula birkaç kez dalma. Bu yuva ve beslemek için larva yardımcı olacaktır.
3. 22-24 saat Yumurta toplama sahip sonrauçlu, aynı yaklaşık boyutu 50 birinci evre (L1) larvaları toplamak için küçük bir fırça kullanın. Deneysel Gıda larva yerleştirin. ve başka bir genotip devam etmeden önce fırça üzerinde kalan larvalar olmadığından emin mendil bir laboratuvar üzerinde fırça temizleyin.
4. 25 ºC bir kuluçka larva flakon yerleştirin ve geliştirmeye olanak sağlar.

3. Larva Fat Düzeylerinin Belirlenmesi

1. çözümler hazırlayın.
   1. 1 L 10x PBS stok hazırlayın.
      1. Bir karıştırma çubuğu ihtiva eden bir 2 L'lik bir kap içinde 800 ml suya 80 g NaCl, 2 g KCI, 14.4 g ₂ Na HPO ₄ ve 2,4 g KH ₂ PO ₄ ekleyin. Tüm tuzlar dahil kadar hiçbir ısı ile karıştırın. 7.4 pH değerini. su ile 1 L ses seviyesini artırmak.
   2. 2 L 1x PBS hazırlayın. 1800 ml su 200 ml 10 x PBS stok solüsyonu ekleyin.
   3. % 20 / h sakaroz w yapmak için 1x PBS bu stok kullanın.
2. gelen larvaların şişesini kaldır(Genellikle yumurta koleksiyonları beş gün sonra) flakonun tarafı yukarı dolaşıp 40 larva - inkübatör kez 20 vardır. Tarih ve saat tahlilinde hem de larvaları dolaşıp sayısını kaydeder.
3. 50 ml konik bir tüp 11.5 ml PBS ve 9 ml% 20 sukroz eklenerek deney çözeltisi hazırlayın.
4. Şişenin üst 1 inç - 0.5 olana kadar şişeye% 20 sukroz ekleyin.
5. yavaşça hala gıda burrowing serbest larva gıda üst tabakası karıştırmaya bir spatula kullanın. Bütün larvalar sukroz çözeltisi yüzeyine yükselir.
6. yavaşça adım 3,3 başlangıçtaki sakaroz konsantrasyonu larvaları aktarmak için forseps kullanabilir.
7. nazikçe bu çözüm larvaları karıştırmak için bir spatula kullanın.
8. konik tüp Cap ve iyice çözüm karıştırmak için birkaç kez upend.
9. konik tüp kapağını açmak ve nazik bir vorteks oluşturmak için girdap.
10. ya solüsyon veya si üstüne kayan, larva yerleşmek için izinalt yanaşma. Larvalar yerleşmek için 5 dakika - 2 bekleyin.
    NOT: Her iki yüzen veya batan kesinlikle değil larva hala varsa, bir şamandıraya veya platin ya da larva etiketlemek için bir eşik noktası olarak kullanmak için bir hattı almak. tüm genotipleri, bu aynı kriter uygulayın. Biz ¹⁹ mutantları tahlilin kalibrasyonu için bir negatif kontrol olarak kullanılabilecek bir pozitif kontrol ve lsd2 olarak kullanılabilir eden sınır. ADP ya da SiR2 ¹⁷ mutan larva olarak konik tüp altındaki açı kullanılır.
11. yüzen larva sayısı ve test spesifik konsantrasyon kaydedin.
12. yoğunluğunu artırmak için deney solüsyonuna 1 mi,% 20 sükroz ekleyin.
13. Tekrarlayın 3,10 3.7 adımları tekrarlayın. yüzen larva sayısı ve bu yeni konsantrasyon kaydedin.
14. larvaların en az% 95 yüzen kadar adımları 3.12 ve 3.13 devam edin.
15. PBS ile dolu bir diseksiyon çanak içine tüm larvaların toplamak için forseps kullanabilir.
16. obsHerhangi bir küçük larva, pupa öncesi, pupa veya genotipler arasında başka bir fark olup olmadığını bir mikroskop ve not altında erve larvaları.
    NOT: İdeal olarak, tüm larva homojen ve aynı gelişim aşamasında görünmelidir. Sadece bu koşullar altında uygun yağ ölçümleri gözlenmiştir.
17. larvaların toplam numarasını kaydedin.
18. forseps kullanarak, kuru mendil, bir laboratuara 10 larva transferi. Bir ependorf tüp Etiket ve tüp içinde 10 larva yerleştirin.
19. Sıvı nitrojen içinde larvaları dondurma. -20 ° C'de tüp saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1 canlılık bazlı analiz genetik manipüle larva hem yüksek ve düşük yağ depolarını algılayabilir nasıl bir örnek temsil eder. Şekil 1A larva beyindeki nöronların belirli bir alt kümesi (E347) bu uyarma veya susturulması gösterir uyarır alt ve üst yağ sırasıyla saklar. Aynı genetik arka plan kontrolü her iki durumda da kullanılmıştır. 1B yoğunluk deneyi ile elde edilen bu fenotip GCMS ile nötral lipid çıkarma ve ölçümü pekiştirilmişt...

Tartışma

^{10 -} lipit düzeyleri ⁸ ölçmek için geliştirilmiş olan teknikler çok sayıda bulunmaktadır. Ancak, bu yöntemlerin her biri yukarıda özetlenen yüzdürme-bazlı deney ile ele bazı önemli dezavantajları ile birlikte geliyor. İlk olarak, bu deney, son derece hızlıdır. 60 dk - tam bir konsantrasyon gradyanı test fazla 30 sürer. Bu, şu anda kullanılmakta olan tekniklerin en çok büyük bir gelişmedir. bunları analiz etmek lipidler ve başka birkaç saat izole etmek için 9 saat - örneğin, MS ile lipit ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bacto Agar	VWR	214030
Welch'in Orijinal %100 Üzüm Suyu Sükroz
	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Etanol			200 kanıt
Ekmek mayası	Fleichmann's
Yellow Mısır Unu	Quaker		Zenginleştirilmiş degerminated
Drosophila Agar Tip II	Apex	66-104
Soya Unu	ADM Özel Malzemeler	062-100
Malt Özü	Breiss	5748
Hafif Mısır Şurubu	Karo
Propiyonik Asit	VWR	U330-09
Sodyum klorür	Fisher	50147491
Potasyum fosfat monobazik	Sigma	P5655-100G
Sodyum fosfat susuz	Fisher	S3933
Potasyum klorür	Fisher	P330-500
35 x 10 mm petri plakası	Fisher	08-757-100A
50 ml	Konik Fisher	50-869-569