Method Article

Bir Kullanarak Altın Nanopartiküller Verimli Radyoaktif bir Optimize Protokolü 125 I-etiketli Azid Protez Grubu

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

125-etiketli azid sentezi ve bir bakır içermeyen tıklama reaksiyonu kullanılarak dibenzocyclooctyne (DBCO) -grubu ile konjüge edilmiş 13-mil ölçekli altın nanopartiküllerinin radyo-etiketlenmesi için ayrıntılı bir işlem tarif edilmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, 125I etiketli bir azid protez grubunun radyosentezi için ayrıntılı bir protokol ve bunun bakır içermeyen bir tıklama reaksiyonu kullanılarak DBCO grubu işlevselleştirilmiş altın nanopartiküllerinin verimli radyo-etiketlenmesine uygulanması için ayrıntılı bir protokol gösteriyoruz. Stannisillenmiş öncünün (2) radyoiyodinasyonu, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oksidan olarak [125I]NaI ve kloramin T kullanılarak gerçekleştirildi. Ham ürünün HPLC saflaştırılmasından sonra, saflaştırılmış 125I-etiketli azit (1), yüksek radyokimyasal verim (% 75 ± 10, n = 8) ve mükemmel radyokimyasal saflık (% >99) ile elde edilmiştir. Radyoaktif işaretli 13 nm boyutlu altın nanopartiküllerin sentezi için, DBCO ile işlevselleştirilmiş altın nanopartiküller (3), tiyollenmiş bir polietilen glikol polimeri kullanılarak hazırlandı. 1 ile 3 arasında bakır içermeyen bir tıklama reaksiyonu, 125I etiketli altın nanopartiküllere (4), radyo-ince tabaka kromatografisi (radyo-TLC) ile belirlendiği gibi% 95'ten fazla radyokimyasal verim verdi. Bu sonuçlar, suş destekli bakır içermeyen bir tıklama reaksiyonu kullanan mevcut radyoetiketleme yönteminin, DBCO grubu içeren nanomalzemelerin verimli ve uygun radyo-etiketlemesi için yararlı olacağını açıkça göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azidler ve siklooktinler arasındaki gerinim destekli bakırsız tıklama reaksiyonu, çok çeşitli biyomoleküllerin, nanomalzemelerin ve canlı deneklerin1-7 verimli biyoortogonal etiketlemesine kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Bu konjugasyon reaksiyonunun mükemmel bölge özgüllüğü ve hızlı reaksiyon hızı nedeniyle, radyoaktif işaretli izleyicilerin sentezlenmesi için de kullanılmıştır. Peptitleri ve antikorları hedef alan çeşitli kanserlerin in vitro etiketlenmesinin yanı sıratümörlerin 8-13 in vivo önceden hedeflenmiş görüntülenmesi için birkaç 18F etiketli azid veya DBCO protez grubu hazırlanmıştır. Bu örneklere ek olarak, pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme çalışmaları14-16 için nanomalzemelerin metal-radyoizotop etiketlemesine de aynı konjugasyon reaksiyonu uygulandı.

Birkaç on yıl boyunca, radyoaktif iyotlar PET görüntüleme (124I), tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) görüntüleme (123I, 125I) ve tiroid kanseri tedavisi (131I) yoluyla biyomedikal araştırmalar ve klinik deneyler için kullanılmıştır17-21. Bu nedenle, radyoaktif iyot etiketleme için etkili bir yöntem, moleküler görüntüleme çalışmaları, biyomoleküllerin organ dağılımının analizi, biyobelirteç tanımlama ve ilaç geliştirme dahil olmak üzere çeşitli araştırmalar için temel olarak önemlidir. Radyoaktif iyot etiketlemede bakır içermeyen bir tıklama reaksiyonu stratejisi kullanılabilir. Bununla birlikte, bu uygulama 18F etiketli biyomolekül22-23 kadar kapsamlı bir şekilde araştırılmamıştır. Burada, DBCO grubundan türetilmiş moleküllerin radyo-etiketlemesi için 125I etiketli bir azidin sentezi için adım adım bir protokol sağlayacağız. Bu rapordaki prosedürler, stanillenmiş öncüsün radyoiyodinasyonunu, HPLC ile saflaştırma adımlarını ve katı faz ekstraksiyonunu içerecektir. Ayrıca, 125I etiketli azid kullanarak DBCO grubu ile modifiye edilmiş 13 nm boyutlu altın nanopartiküllerin verimli radyo-etiketlemesini de gösteriyoruz. Bu rapordaki ayrıntılı protokol, sentetik kimyagerlerin radyoaktif işaretli ürünlerin sentezi için yeni bir radyoetiketleme metodolojisini anlamalarına yardımcı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dikkat: Radyoaktif iyot oksitlenmiş biçimi oldukça uçucu ve yeterli kurşun kalkanlar ve kurşun şişeleri ile ele alınması gerekir. Tüm radyokimyasal adımlar iyi havalandırılan bir kömür filtreli davlumbaz yürütülen ve deneysel prosedürler radyoaktivite tespit cihazları ile izlenmesi gereken yapılmalıdır.

125I-işaretli azid Sentezi için Kimyasallar ve ters fazlı kartuş hazırlanması 1.

  1. Çözelti içinde reaktiflerin hazırlanması
    1. 150 ul içinde azid ön (2) mutlak etanol (Şekil 1), 1 mg eritin.
      Not: azid ön için ayrıntılı bir sentez işlemi (2) Daha önceki çalışmada 22 bildirilmiştir.
    2. 1x fosfat tamponlu salin (pH = 7.4) 20 ul 1 mg kloramin T çözülür.
    3. 20 ul H2O içinde 2 mg sodyum metabisülfit çözülür
  2. PreparaKartuşun tion
    1. 10 mi H2O ve ardından 10 mi mutlak etanol ile TC18 kartuşu yıkayın hava ile kartuşun matrisi kurutmayın.

125I-işaretli Azid prostetik grup 2. radiosynthesis

  1. Öncüsünün radyoiyodinasyon reaksiyonu
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne azid ön bileşik çözeltisi ve asetik asit (10 ul) (saf etanol, 150 ul 1 mg) ekleyin.
    2. Reaksiyon kanşımına 0.1 M NaOH (50 ul) [125I] Nal 150 MBq ekleyin.
    3. Bir kloramin T çözeltisi (1 x fosfat tamponlu salin ile 20 ul 1 mg) ekleyin ve bir mikrosantrfuj tübü ihtiva eden reaksiyon karışımının kapatın.
    4. radyoiyodinasyon Reaksiyon tamamlanana kadar 15 dakika için oda sıcaklığında reaksiyon karışımı inkübe edin.
    5. Reaksiyon karışımına sodyum metabisülfit çözeltisi (2 mg 20 ul H2O) ilaveradyoiyodinasyon, reaksiyonun sönmesi için.
    6. Ham ürün, 0.2 ul çekin ve daha sonra çözelti, 100 ul ile seyreltin (H2O / CH3CN, 1: 1) HPLC analizi için.
      Not: Tüm HPLC deneyleri için, H2O (solvent A) ihtiva eden% 0.1 formik asit ve saflaştırma maddesi olarak% 0.1 formik asit ihtiva eden asetonitril (solvent B) kullanın.
    7. Sütun ters faz (ters-faz analitik, radyo-HPLC ile seyreltildi ham ürün C18 analiz; akış hızı: 1 mL / dk; elüan gradyanı: 0-2 dakika% 20 çözücü B,% 20-80 solvent B için 2-22 dakika, 22-23 dakika boyunca% 80-100 çözücü B ve 23-28 dakika için% 100 çözücü B'ye, tutma süresi: 16.4 dakika) (Şekil 2).
  2. Preparatif HPLC ile ham ürünün saflaştırılması,
    NOT: Bu tür enjektör, kolon, dedektör, toplama şişeleri ve atık toplandığı konteyner olarak HPLC parçaları etrafında yeterli kurşun kalkan sağlayın.
    1. th çekinizHPLC şişenin içine bütün reaksiyon karışımı e. asetonitril (0.5 ml) ile reaksiyon tüpü durulayın ve aynı enjeksiyon şişenin içine durulama ekleyin. H2O (1 mi) ile toplandı çözeltisi ile seyreltilir.
    2. (Hazırlayıcı, radyo-HPLC üzerine enjekte edilir, ham ürün C18 kolonu ters faz; akış hızı: 10 ml / dk; elüan gradyanı: 2-22 dakika için 0-2 dakika,% 20-80 solvent B% 20 solvent B, 22-23 dakika boyunca% 80-100 çözücü B ve 23-28 dakika için% 100 çözücü B).
    3. 125I-işaretli azid (1) temsil eden radyoaktif tepe toplama, bir cam test tüpü (Şekil 2) (bu HPLC koşulları altında tR 17,8-18,8 dk).
    4. üreticinin protokolüne göre bir radyoaktivite doz kalibratörü kullanılarak fraksiyonunun radyokimyasal verim ölçün.
    5. Ürünün radyokimyasal saflığı belirlemek için, aynı HPLC koşulları kullanarak analitik bir radyo-HPLC üzerinde saflaştırılmış ürün enjekte edilir.
  3. Ürünün katı faz ekstraksiyonu
    1. 40 ml saf H2O ile istenen ürünü (1) ihtiva eden fraksiyon, seyreltik
    2. olarak önceden TC18 kartuşuna seyreltilmiş çözeltisi ekleyin.
    3. Ek bir 15 mi H2O kartuşu yıkayın
    4. Bir kurşun zırh tarafından korunan bir 10 ml bir cam şişe içinde, 2 ml aseton ile kartuş içinde sıkışıp ürünü (1) yıkayın. üreticinin protokolüne göre bir radyoaktivite doz kalibratörü ile elüt ürünün radyoaktivite ölçülür.
      Not: Dimetil sülfoksit (DMSO) ya da mutlak etanol, kartuşun elde edilen ürünün elüsyon için kullanılabilir. radyoaktivitenin yaklaşık% 5-10, normal olarak kartuş yapışır ve geriye kalan radyoaktif olarak ürün tamamen organik çözücünün fazla miktarda kullanılarak elüte edilemez.
    5. nitrojen ya da argon gazı akımı ile aseton buharlaştırın.
    6. yeniden çözülürBir sonraki radyo işaretli aşamada DMSO (100-200 ul) ile sidue.

DBCO-grup-konjuge Altın Nanopartiküller 3. Sentezi

  1. 13 mil ölçekli altın yüzey modifikasyonu DBCO-grubu-ihtiva eden polietilen glikol ile nanopartikülleri
    1. Hazırlama sodyum sitrat kararlı altın nanopartikülleri (3) (ortalama boyutu = 13 nm) bir önceki rapora 24 göre yöntem.
    2. (10 nM, 15 mi) sitrat stabilize altın nanopartiküllerinin Tween 20 (1 mM, 1.5 mi), sulu bir çözeltisi ilave edilir. bir orbital çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyunca solüsyon çalkalanır.
    3. DBCO-grubu-ihtiva eden polietilen glikol tiol (ortalama molekül ağırlığı = 5000, 100 uM, 1.5 mi), sulu bir çözeltisi ilave edilir. bir orbital çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca solüsyon çalkalanır.
  2. DBCO-grubu ile modifiye edilmiş altın nanopartiküllerinin saflaştırılması
    1. Arındırmak DBCO-grup-modifiye altın nanopartiküller (4) </ Ardışık santrifüj (11,400 xg, 15 dakika x 3) ile strong>.
    2. Süpernatantı Durusu ve altın nanoparçacık pelet tabanda saf su ekleyin.

4. Bakır ücretsiz tıklayın Reaksiyon aracılığıyla DBCO-grup-modifiye Altın Nanopartiküller Radyo-etiketlenmesi

  1. 125I-işaretli azid kullanılarak 125-etiketli altın nanopartiküllerinin sentezi (1)
    1. Santrifüj (11,400 xg, 15 dakika) ile DBCO grubu ile modifiye edilmiş altın nano partiküller bir konsantre çözelti hazırlayın, ve 2 uM altın nano-taneciklerinin konsantrasyonu ayarlanır.
    2. Altın nano partiküller içeren bir süspansiyona, DMSO (5 ul) 125-etiketli azid (1) 4.1 MBq ekleme (4) (2 uM, 50 ul).
    3. 60 dakika boyunca 40 ° C 'de elde edilen reaksiyon karışımı inkübe edin.
    4. Ham ürünün bir kısmı (0.2 ul) geri çekilmesi ve bir silis-CO üzerine uygulanırbir-, ince tabaka kromatografisi (TLC) plaka.
    5. Bir mobil faz olarak etil asetat kullanılarak TLC plakası geliştirmek.
    6. Bir radyo-TLC tarayıcı üzerinde TLC plakası yerleştirin ve üreticinin protokolüne göre Radyoaktif reaksiyonu (Şekil 3) izlemek için tarayıcıyı çalıştırın.
  2. Ham ürünün saflaştırılması
    1. Santrifüj ile 125I-işaretli altın nano parçacıklar (4) (11,400 xg, 15 dakika) ihtiva eden reaksiyon karışımı saflaştınlır.
    2. Süpernatantı Durusu ve altın nanoparçacık pelet tabanda saf su ekleyin.
    3. Saflaştırılmış ürünü bir kısım (0.2 ul) geri çekilmesi ve bir silis kaplı TLC plakası üzerine uygulanır.
    4. mobil faz olarak etil asetat kullanılarak TLC plakası geliştirmek.
    5. Bir radyo-TLC tarayıcı üzerinde TLC plakası yerleştirin ve 125-işaretli gol radyokimyasal verim ve radyokimyasal saflığı belirlemek için tarayıcıyı çalıştırmaküreticinin protokolüne uygun olarak D nanopartiküller (4) (Şekil 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stannylated ön (2) ve radyoiyodinasyon Reaksiyon radyo-etiketli ürünü temin etmek üzere 15 dakika için oda sıcaklığında [125I] Nal, asetik asit ve kloramin T 150 MBq kullanılarak gerçekleştirildi (1). Ham karışımın, hazırlamalı HPLC ile saflaştırma işleminden sonra, istenen ürün, radyokimyasal verim 75 ± 10% (n = 8) ile elde edilmiştir. Analitik HPLC 125I-işaretli ürünün radyokimyasal saflığı% 99'dan fazla (Şekil 2)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel olarak, saflaştınlmış 125I-işaretli azid (1) gözlenen radyokimyasal verim 75 ± 10% (n = 8). Radyoaktif radyoaktivite 50-150 MBq ile gerçekleştirildi ve radyokimyasal sonuçlar oldukça tutarlıdır. [125I] Nal (t 1/2 = 59.4 D) radyoiyodinasyon reaksiyonda kullanıldı fazla bir ay radyoaktif bozunma uygulandı, 1 radyokimyasal verim olduğu gözlenmiştir ise biraz (53-65%) azalmıştır. Nedenle, [125I] Nal da üretildiği anda hemen kullanıl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kore Cumhuriyeti hükümeti tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (Hibe no. 2012M2B2B1055245 ve 2012M2A2A6011335) ve Kore Atom Enerjisi Araştırma Enstitüsü RI-Biyomik Merkezi tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kloramin T trihidratSigma402869
[125< / sup>I] NaI, aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodyum metabisülfit SigmaS9000
Formik asitSigma251364
Sep-Pak tC18 plus kartuşSularWAT036800
Dimetil sülfoksit SigmaD2650
AsetonSigma650501
EtanolSigma459844
Altın (III) klorür trihidratSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silika jel 60 F254Merck
Analitik HPLCAgilent1290 InfinityModel numarası
Hazırlayıcı HPLCAgilent1260 InfinityModel numarası
Analitik C18 ters fazlı kolonAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Hazırlayıcı C18 ters fazlı kolonAgilentPrepHT XDB-C18
Radyo TLC tarayıcıBioscanAR-2000Model numarası
Radyoizotop doz kalibratörüCapintec, IncCRC -25R doz kalibratörüModel numarası

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Radiolabeling Gold NanoparticlesCopper Free Click ReactionIodine 125 Azide Prosthetic GroupRadioiodination ProtocolHPLC PurificationRadio TLC AnalysisDBCO Functionalized NanoparticlesStrain Promoted Azide Alkyne CycloadditionRadiochemical Yield MeasurementSolid Phase Extraction

Related Articles