Hazırlama ve İn Vitro Manyetik Rezonans Görüntüleme için Dendrimer tabanlı Kontrast Ajanlar Karakterizasyonu

Özet

Bu protokol paramanyetik gadolinyum iyonları koordine Cyclen tabanlı makrosiklik şelatları taşıyan bir dendrimeric manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kontrast madde hazırlanması ve karakterizasyonu açıklar. Ticari olarak temin edilebilen monomerik analog ile karşılaştırıldığında, in vitro olarak MR deneyler serisinde, bu madde bir güçlendirilmiş MR sinyal üretti.

Özet

asiklik veya makrosiklik şelatlar ile gadolinyum (III) paramanyetik kompleksleri manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için en sık kullanılan kontrast maddeler (CA) bulunmaktadır. Bunların amacı, böylece MR kontrast ve MR, ölçümlerin özgüllüğünün arttırılması, doku su protonlarının gevşeme oranının arttırılmasıdır. Mevcut Klinik olarak onaylanmış kontrast maddeleri hızlı bir şekilde vücuttan, düşük molekül ağırlıklı moleküllerdir. para-manyetik kenetleyiciler taşıyıcıları olarak dendrimerler kullanılması daha verimli MRT-kontrast maddeleri gelecekteki gelişimi önemli bir rol oynayabilir. Spesifik olarak, daha yüksek bir sinyal aksine paramanyetik türler sonuçları yerel konsantrasyonu artar. Ayrıca, bu, CA, yüksek molekül ağırlığı ve büyüklüğü nedeniyle daha uzun bir doku tutma süresi sağlar. Burada, poli (amido) göre makromoleküler MRI kontrast ajanları (tein) monomacro dendrimerlerinde hazırlanması için uygun bir prosedür göstermekhalkalı DOTA-tipi kıskaçlar (DOTA - 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetat). kenetleme birimi tiyoüre köprüleri oluşturmak için tein dendrimer amin yüzey gruplarına yönelik izotiyosiyanat (NCS) grubun reaktivitesini istismar ederek sonuna eklenmiştir. Dendrimeric ürünleri saflaştınldı ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi, kütle spektrometrisi ve elementel analiz vasıtasıyla analiz edildi. Son olarak, yüksek çözünürlüklü MR görüntüleri kaydedildi ve hazırlanan dendrimeric ve piyasada mevcut monomerik ajanlar elde edilen sinyal kontrastlar karşılaştırıldı.

Giriş

Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) nedeniyle invazif olmayan doğası ve mükemmel iç yumuşak doku kontrast yaygın biyomedikal araştırmalar ve klinik teşhis kullanılan güçlü ve iyonize olmayan bir görüntüleme tekniğidir. En sık kullanılan MRG yöntemleri su sinyallerinin yoğunluğu farklılıklara dayalı dokular içinde yüksek çözünürlüklü görüntüler ve ayrıntılı bilgi veren, su proton elde edilen sinyalin kullanmaktadır. sinyal yoğunluğu ve MR deneyler özgüllüğü, bundan başka kontrast maddeleri (CA) kullanılarak geliştirilebilir. Bunlar paramanyetik veya Süperparamanyetik uzunlamasına (T ₁₎ ve enine etkileyen türler (T ₂₎ gevşeme süreleri sırasıyla ^1,2 bulunmaktadır.

Poli polikarboksilik asit ligandları ile lantanide iyon gadolinyum kompleksleri en sık kullanılan T ₁ CA vardır. Gadolinyum (III) _T1 gevşeme kısaltırSu protonların zaman, böylece MR deneylerde ³ sinyal kontrastını artırarak. Bununla birlikte, iyonik gadolinyum zehirlidir; boyutu (ii) kalsiyum yaklaşır ve ciddi kalsiyum destekli hücrelerde sinyal etkiler. Bu nedenle, asiklik ve makrosiklik şelatları Bu toksisite nötralize etmek için kullanılır. Çeşitli multidentat ligandlar yüksek termodinamik stabilite ve kinetik inertlik ¹ gadolinyum (III) kompleksleri ile sonuçlanır kadar geliştirilmiştir. Özellikle onun tetrakarboksilik türevi DOTA (1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetat) 12 üyeli azamacrocycle Cyclen dayalı olanlar, bu CA sınıfının en araştırılmış ve uygulamalı kompleksleri bulunmaktadır.

Bununla birlikte, GdDOTA-tipi CA, düşük kontrast verimliliği ve hızlı renal atılım gibi bazı dezavantajları gösteren düşük moleküler ağırlıklı sistemlerdir. Makromoleküler ve çok değerlikli CA bu sorunlara ⁴ için iyi bir çözüm olabilir. CA biodistribu yanation esas olarak boyutuna göre belirlenir, makromoleküler CA dokular içinde çok daha uzun saklama süreleri gösterir. Eşit derecede önemli, büyük ölçüde elde edilen MR sinyal ve ölçüm kalitesinin iyileştirilmesi monomerik MR prob (örneğin, GdDOTA kompleks), bir artış lokal konsantrasyonunu bu maddeler sonuçlarının çok değerlilik.

Dendrimers MRG ^4,5 için çok değerlikli CA'ların hazırlanması için en çok tercih edilen iskeleler arasındadır. iyi tanımlanmış boyutları ile bu yüksek ölçüde dallı makromoleküller yüzeyleri çeşitli birleştirme reaksiyonları yatkındır. Bu çalışmada, bir nesil 4 (G4) poli (amidoamin) GdDOTA benzeri şelatları (DCA) birleştirilmiş (tein) dendrimer oluşan MRG için bir dendrimeric CA hazırlanmasını, saflaştırma ve karakterizasyonu rapor. Bu reaktif DOTA türevinin sentezi ve tein dendrimer olan kuplaj tarif eder. Gd (III), standart fiziksel karakterizasyonu ile kompleks halinde süreçleDCA yeniden yapıldı. Son olarak, MR deneyler düşük molekül ağırlıklı bir CA elde edilenlere nazaran daha güçlü bir kontrast MR görüntüleri üretmek için DCA yeteneğini göstermek için yapıldı.

Protokol

DCA hazırlanması 1.

1. Monomerik birimin 4 ⁶ sentezi.
   1. 4- (4-nitrofenil) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl-1-il 1,4,7,10-tetraazasiklododek) bütirik asit tert-bütil ester (2).
      1. ((4,7-bis-tert--butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-il) N -asetik asit tert-butil ester 1 (1.00 g, 1.94 mmol), N-dimetilformamid içinde çözülür DMF, 5 mi). 0.67 g, 4.86 mmol, 2.5 eşdeğer potasyum karbonat (ADD) ve 45 dakika için oda sıcaklığında karıştırın.
         Not: makrosikl 1 Cyclen hazırlandı ve tert daha önce yayınlanmış prosedür ^7'ye göre bromoasetat-butit.
      2. Tert ekleme-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoat (0.87 g, 2.53 mmol, 1.3 eşdeğer.) Ilave 1 saat boyunca. t altında karıştırıldıktan devamAşağıdaki 18 saat aynı reaksiyon koşulları.
         Not: Tert-bütil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoat daha önce yayınlanmış prosedür ^8'e göre 4- (4-nitrofenil) -bütirik asit, tionil klorür ve bromin hazırlandı.
      3. 40-60 ° C de ⁹ ampulden ampule vakumla damıtma yoluyla DMF çıkarın.
      4. Kahverengi şekilsiz bir katı (1.09 g,% 72), ¹⁰ olarak ürünü 2 elde etmek için kolon kromatografisiyle (silis jel,% 7 metanol / diklorometan) artığı arıtın.
   2. 4- (4-aminofenil) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl-1-il 1,4,7,10-tetraazasiklododek) bütirik asit tert-bütil ester (3).
      1. Nitrobenzen türevinin 2 etanol (1.00 g, 1.28 mmol) (10 mi) ve metanol (150 ul) içinde 7 N amonyak solüsyonu içinde çözülür. soluti bir katalizör (Pd / C, 150 mg, ağırlıkça% 15) halinde aktive edilmiş karbon üzerinde palladyumüzerinde.
      2. Parr hidrojenatörü tertibatında bir hidrojen atmosferi (2.5 bar) altında 16 saat heterojen bir karışım çalkalanır.
      3. etanol içinde süspansiyon haline getirildikten sonra sinterlenmiş cam huni üzerinden süspansiyon filtre edilerek bir silisli toprak bir pasta hazırlayın. süzme ile Pd / C katalizörü çıkarmak için hazırlanmış pasta üzerinde 1.1.2.2 gelen süspansiyon dökün.
      4. Kahverengi şekilsiz bir katı (0.91 g,% 95) halinde bileşik 3 elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı (su banyo sıcaklığı ~ 40 ° C) hafif damıtma ile ayrılması için kullanılabilir.
   3. 4- (4-izotiosiyanatofenil) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazasiklododek-1-il) bütirik asit tert-bütil ester (4).
      1. Bir 3 karışımına (0.91 g, 1.22 mmol) ve trietilamin diklorometan (0.685 ml, 4.87 mmol, 4 eşi.) (15 mi) (0.124 ml, 1.58 mmol, 1.3 eşdeğer.) tiofosgen ekleyin.
      2. Şiddetle reaksiyon mil karıştırın16 saat oda sıcaklığında, bir manyetik karıştırıcı ile karışımlarına.
      3. Bir döner buharlaştırıcı (su banyo sıcaklığı ~ 40 ° C) hafif damıtma ile çözücünün çıkarın ve daha sonra katı, amorf açık kahverengi olarak ürünü elde etmek üzere 4 kolon kromatografisiyle (silis jel,% 5 metanol / diklorometan) Ham ürünün arıtılması (0.51 g,% 53).
2. Dendrimer DCA sentezi.
   1. Dendrimer 5 sentezi.
      1. (40 ° C su banyosu sıcaklığında ~), bir döner buharlaştırıcı üzerinde damıtma ile yumuşak bir metanol buharlaştırılması, G4-tein dendrimer (667 mg, metanol içinde% 10 dendrimer çözeltisi, 4.67 umol), alın ve DMF içinde bir tortu çözülür (4 mi) .
      2. (. 0.105 ml, 0.75 mmol, 160 eşdeğer) Trietilamin 60 ° C'de 45 dakika süre ile karıştırıldı, ve ek izotiyosiyanat 4 (354 mg, 0.45 mmol, 1.5 eşdeğ. Dendrimer amino yüzey gruplarına göre), kısımlar halinde over, 1 saat.
      3. 48 saat boyunca 45 ° C'de bir manyetik karıştırıcı, reaksiyon karışımı karıştırılır.
      4. 40-60 ° C de, bulb-to-bulb vakumla damıtma yoluyla ayrılması için kullanılabilir.
      5. elüent olarak bir lipofilik jel filtrasyon ortamı ve metanol kullanılarak boyut dışlama kromatografisiyle artığı arıtın. Sütunu paketi basınç uygulanarak oda sıcaklığında (> tozu 1 gramı başına 4 ml metanol) en az 3 saat boyunca metanol içerisinde süzme ortamı şişirmek için. 1 ml'lik fraksiyonlar toplayarak yerçekimi ayrımı gerçekleştirin.
      6. ince tabaka kromatografisi (TLC) ile toplanan fraksiyonları analiz edin. (Sadece temel hattı üzerinde yer alan en polar Noktası dendrimeric ürün elde edilir),% 15 metanol / diklorometan içinde TLC plakası geliştirmek. Ürün 5 (270 mg,% 91) elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı (su banyosu sıcaklığı ~ 40 ° C) hafif damıtma yoluyla toplanan fraksiyonları buharlaştınn.
   2. Dendrimer sentezi
   3. Formik asit (5 mi) içinde korunan dendrimeric şelatör 5 (270 mg, 4.23 mmol) çözülür ve 24 saat boyunca 60 ° C'de karıştırın.
   4. Bir döner buharlaştırıcı (~ 15 mbar basıncı, su banyosu sıcaklığı ~ 40 ° C) damıtılarak formik asit buharlaştırılmakta ve 6 elde etmek üzere ürün dondurularak kurutmak (basınç ~ 0.2 mbar) ^9.
3. Dendrimeric kontrast maddesinin sentezi (DCA)
   1. Suda dendrimeric şelatör 6 (4.35 umol) çözülür ve 0.1 M sodyum hidroksit ile 7.0'a pH ayarlamak.
   2. Su (1 mi) içinde GdCl ₃ · 6H ₂ O (113 mg, 304 umol) içinde çözülür ve 4 saat arasında bir süre boyunca kenetleme 6 çözeltisine damla damla ekleyin; pH metre ile pH ölçümü ile sulu sodyum hidroksit çözeltisi (0.05 M) ile pH 7.0 muhafaza.
   3. Oda t manyetik bir karıştırıcı ile kanştınn24 saat emperature.
   4. Gd fazlasının ayrılması için 4 saat boyunca çözeltiye kısım kısım olacak etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 158 mg, 426 umol) ilave edin (III), sulu sodyum hidroksit çözeltisi (0.05 M) ile pH 7.0 tutulur. 24 saat oda sıcaklığında karıştırın.
   5. GdEDTA çoğunluğu ve EDTA fazlasının ayrılması için boyut dışlama kromatografisi gerçekleştirin. kolon paketi için suda şişmiş bir hidrofilik jel filtrasyon ortamı kullanın. Uygun bir hacme karışımı azaltmak ve sütun yükleyin. basınç uygulamadan deiyonize su ile sütun yıkayın.
   6. GdEDTA ve EDTA kalıntılarını uzaklaştırmak için merkezkaç kuvveti 1800 x g'de 30 dakika süre ile 3 kDa'lık santrifüj filtre ünitesi kullanılarak örnek santrifüjleyin. Süzüntü EDTA ve GdEDTA yokluğunu gösterir kadar bu adımı (yaklaşık beş kez) tekrarlayın. Nihai DCA olarak grimsi beyaz bir ürün elde etmek için, bir şişe içine örnek aktarın buharlaştırılmak ve daha sonra çözücü, dondurularak kurumaya (186 mg,% 71).
      NOT: ESI-MS aracılığı ile EDTA ve GdEDTA olmadığını kontrol edin.
   7. xylenol turuncu testi kullanılarak serbest iyon olarak Gd (III) yokluğunu onaylayın. bir asetat tampon çözeltisi (pH 5.8) 'de süzüntü (0.5 mi) içinde çözülür. Bir ksilenol turuncu çözelti bir kaç damla ilave edin ve renk değişikliği parça ¹¹ (sarı veya mor renkli yokluğunun ya da serbest Gd (III) 'ün, sırasıyla iyonlar, varlığını gösterir).

Dendrimeric Ürünlerin 2. in vitro karakterizasyonu

1. (DOTA benzeri makrosikllerin ile dendrimer yükleme) tein dendrimer bağlanmış makrosiklik DOTA-birim sayısı tahmini
   1. ^1H NMR (- nükleer manyetik rezonans spektroskopisi NMR) ile Tahmini.
      NOT: Bu prosedür dendrimerler 5. ve 6. mümkündür, ancak DCA üzerinde.
      1. ^1H NMR Spektrum ¹² kaydeder.
      2. Sırasıyla dendrimerler 5 ve 6 ya da sadece bir alifatik bölge aromatik bölge ve iki ayrı alifatik bölgeleri (t-Bu grupların 2. sinyalleri alifatik dendrimere ve makrosiklik protonlar 1. sinyaller) entegre edin.
         Not: hidroliz beri alifatik bölge dendrimer 6 t-Bu gruplardan kaynaklanan hiçbir ayrı bir sinyal yok.
      3. Denk kullanın. 1 ya da Denk. 2R integrallerinin oranı = makrosiklik birimlerinin sayısı (n) tahmin etmek için (Denklem. 1 ya da alifatik-dendrimer aromatik alifatik / / alifatik- Denklem t-Bu. 2), H _dend = proton sayısı dendrimer olarak, H _Ar aromatik proton sayısı, H _{t Bu} t-Bu gruplarda protonların sayısı = = ve H _mac tek Makrosiklde proton sayısını =.
         Not: Ya Denk. 1 ya da Denk. 2 fo kullanılabilirr dendrimer 5, sadece denklem iken. 1 dendrimer 6 için de kullanılabilir. Değiştirilebilir protonlar (aminler, amidler, tiyo-üre veya karboksilatlar üzerinde), genellikle döteryum değiştirilmektedir olduğundan, hesaplamalarda kabul edilmemiştir. Burada, lH _dend (5 için) = 1.128 ya da 1.000 (6), H _Ar = 4 ve H _Mac = 27 kullanılmıştır.
         (1)
         (2)
   2. sülfür, nitrojen oranı kullanılarak elementel analiz tahmini.
      1. Katı dendrimeric örnek (bu çalışmada DCA) üzerine element analizi yapın.
      2. Denk kullanın. 3 R belirlenen% N ve% S, N veya S _{dend dend} oranını = makrosiklik birimlerinin sayısını (n) = sayısını tahmin etmekAzot ya da dendrimer kükürt atomu ve N _yağmurluk ya da _MAC bir makrosiklik biriminde nitrojen veya sülfür atomu sayısı =.
         Not: faktörü 2.29 sülfür ve nitrojen atom kitlelerinde oranı elde edilir. Bu çalışmada, K _dend = 250, S _dend = 2, K _Mac = 5, ve _MAC = 1 kullanılmıştır.
         (3)
   3. uçuş matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon süresi (MALDI-TOF) ile tahmin edilmesi.
      1. -TOF MS analizi ¹³ gerçekleştirin.
      2. Eşitliğine göre makrosiklik birimlerinin sayısı (n) hesaplanması. M _z = gözlenen KÜTLE (m / z), Z = türlerin yük, E _dend = dendrimeric bölümünün kütlesi ve M, _Mac bir makrosiklik birim kütle = 4.
         YOK HAYIRTE: M _dend = 14.306 ve M _mac = 719 Bu çalışmada kullanılmıştır.
         (4)
2. DCA konsantrasyonu ([DCA]) belirlenmesi: Dökme manyetik duyarlılık ölçümü (BMS)
   1. plastik bir şişe borusu ([DCA] ~ 5-10 mM) 'de, su (360 ul) DCA (5-10 mg) çözündürülür.
      Not: [DCA] δ = 4.7 ppm su rezonans ile> 15 mm numune konsantrasyonlarda t BuOH rezonansları olası çakışmasını önlemek için 5-10 mm aralığı içinde olması gerekmektedir.
   2. DCA sulu çözeltisine (1 h / h 2) ve bir girdap şeklinde karıştırıcı kullanılarak elde edilen solüsyon (420 ul) karışımı t-BuOH karışımı: D ₂ O 60 ul ekle.
   3. Deney tüpüne _H2O karışımı (10:90 h / h) bir dış NMR tüpü içine transferi örnek 400 ul ve koaksiyal NMR ek tüp yerleştirmek, t-BuOH birlikte.
   4. Kayıt^1H NMR spektrumu, ve iç ve dış NMR borular (referans) ¹² BuOH t kaynaklanan rezonans sinyalleri arasındaki frekans kayması ölçümü.
   5. Denk kullanın. 5 T mutlak sıcaklık = [DCA] belirlemek için, Δχ, kaydedilen vardiya = Gd (III) ¹⁴ ve s = sabit bağımlı bir lantanid iyon için _eff = etkin manyetik moment (μ _eff = 7.94 mikron numunenin şekli ve manyetik alan (sırası ile, 0, 1/3 ve manyetik alana dik bir küre, silindir paralel ve silindir halinde 1/6) içindeki konumuna bağlı.
      Not: BuOH solüsyonu (60 ul) t [DCA] elde hesaplanan değer nedeniyle D ₂ O ilave orijinal konsantrasyona düzeltilmelidir.
      (5)
3. dinamik ışıksaçılımı (DLS) ölçümleri.
   1. Bir filtre DCA çözeltisi hazırlayın (0.2 um politetrafloretilen / PTFE filtresi, Gd başına 0.75 mm (III)), 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponu (25 mM, pH 7.4) ve içine aktarmak DLS ölçümleri için küvette.
   2. DLS aparatı içine küvet yerleştirin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: kayıt 30 saniye önce taramalar arasında ve sıcaklık dengeleme ile gecikme olmadan 15 taramaları (1 tarama = 12 sn, kırılma indeksi = 1.345, soğurma =% 1) 5 tekrarlar .
   3. elde edilen verileri verme ve boyut (hidrodinamik çap) 'in bir fonksiyonu olarak nüfus (%) konulması sureti ile boyut dağılımı histogram elde edin.
4. Uzunlamasına ve enine relaksivitelerine ölçümü.
   NOT: benzer bir prosedür zaten gevşeme zamanı analizörü ¹⁵ kullanılarak tarif edilmiştir; Bu prosedür, Topspinli bir 300 MHz NMR spektrometre kullanılarak gerçekleştirildiyazılım.
   1. H DCA çözeltiler ₂ O kümesi hazırlanması: D ₂ O (500 ul,% 10 D _{2 O, H2O} içinde, [DCA] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, ve 5.0 mM [HEPES ] DCA stok örneğinden = 25 mM) () bölüm 2.2'ye bakınız.
   2. bir NMR tüpe çözeltinin 450 ul aktarın ve enstrüman içine yerleştirin.
   3. Satın alma parametrelerini optimize ve daha sonra T gerçekleştirmek inversiyon kurtarma (IR) ve Araç-Purcell-Meiboom-Gill kullanarak ₁ ve T ₂ deneyler (CPMG (90 ° uyarım darbe süresi (p1), ve ışınlama frekansı (O ₁₎ ofset) ) darbe dizileri, sırasıyla.
   4. _T1 ve _T2 gevşeme sürelerine belirlenmesi.
      1. Kaydedilen ölçüm, işlemini F2 boyutta 2D spektrumu seçin ve interaktif faz düzeltme gerçekleştirin.
      2. Analiz / T uygun dilim (maksimum yoğunlukta zirve) seçin ₂ gevşeme pencere, entegre ve gevşeme modülü bölgeyi ihracat.
      3. T ₁ ve T ₂ gevşeme süreleri elde etmek için uygun montaj işlevini (IR ve CPMG deneyler için invrec veya uxnmrt2, sırasıyla) seçin.
   5. tüm [DCA] Kalan çözümler için adımları yineleyin 2.4.4.2-2.4.4.4.
   6. Elde edilen T ₁ değerlerinden gevşeme oranları _(R1 ve _R2) hesaplayın (R _1,2 = 1 / T _1,2).
   7. Konu _R1 ve _R2 ^(sn-1) mm olarak Gd (III) konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak.
   8. Denk tanımlandığı gibidir, uydurulmuş çizginin eğiminden, boyuna ve enine relaksivitelerine, _R1 ve _R2 eşittir ^{(mm-1 sn-1)} belirler. 6, burada R _{i, gözlenen} = boyuna (i = 1) veya enine (i = 2) diyamanyetik gevşeme oranıDeneyde kullanılan para-manyetik türlerin ve yokluğunda [Gd] = Gd (III) konsantrasyonu su.
      (6)

In Vitro MR 3.; DCA ve GdDOTA Karşılaştırılması

1. Tüp hayaletler hazırlanması
   1. kontrast ajanlarının konsantrasyonu hesaplanır iki deney seti için DCA (4 x 350 ul) ve GdDOTA (4 x 350 ul) ve su örneklerinin (4 x 350 ul) sulu çözeltileri hazırlanması: (3.1.1.1) ortalama Gd (III) ya da molekül başına (3.1.1.2).
      1. İki DCA örnekleri ve iki GdDOTA hazırlanması sırasıyla, Gd 0.5 ve 1.0 mM (III) 'in konsantrasyonu ile örnekler. Ayrıca, (kontrol tüpleri gibi) iki su numuneleri hazırlamak.
      2. İki DCA örnekleri (2.5 ve Gd (III) ya da 0.05 başına 5.0 mM ve dendrimeric molekül başına 0.1 mM), iki GdDOTA örnekleri (0.25, 0.5 mM) ve iki adet su numunesi hazırlanması (control borular).
         NOT: Uygun DCA ve GdDOTA konsantrasyonları BMS yöntemi ile belirlenen konsantrasyonlarda ilgili stok örnekleri seyreltilmesi ile hazırlanmalıdır HEPES tamponu (pH 7.4) ile (bölüm 2.2). Hesaplamaları kolaylaştırmak için n = 50 dendrimer molekül başına makrosiklik birimlerinin ortalama sayısı için varsayılmıştır. Bu nedenle, DCA oranı: bir molekül bazında hesaplandığında 5: GdDOTA 1 idi.
   2. çözelti içinde hava kabarcıklarının varlığı kaçınarak 300 ul plastik şişe tüplerde numuneler.
      NOT: Plastik şişe tüplerin boyutu kullanılan radyofrekans bobin tipine ve büyüklüğüne bağlıdır (burada, hacim bobini ile bir örnek verilmiştir).
   3. , Bir şırınga (60 ml hacim) içindeki örnekleri yerleştirin 1 mM GdDOTA ile doldurun çözüm ve tarayıcıya yerleştirin.
      Not: Örnekler manyetik alan s duyarlılık etkisi (varyasyonları önlemek için GdDOTA sulu bir çözeltiye yerleştirilmişFarklı manyetik duyarlılık maddeler arasındaki yakın arayüzler) meydana trength.
2. Parametre optimizasyonu ve görüntüleme.
   1. mıknatısın İzomerkez örnekler ile şırınga konumlandırmak için anatomik tarama (Localizer / Tripilot) kullanın.
   2. Bütün hacim, merkezi frekans (O _1), alıcı kazancı (RG), ve iletim kazancı (TX0 ve TX1) ve (manyetik alan homojenliği ayarı) shimming için ayarlamalar yapmak için trafik ışığı (ayar taraması) tuşuna basın.
   3. T ₁ -ağırlıklı (T _1w) görüntüleme için, hızlı, düşük açılı çekim (FLASH) yöntemini seçin.
   4. Localizer tarama kullanarak tarayıcı (yatay şırınga) dikey olarak yerleştirilmiş numuneler için koronal dilim seçin.
   5. Denk kullanın. Kontrast-gürültü (CNR) Satın alma optimizasyonu için 7 α = çevirme açısı, TE eko zamanı = ^16, parametreler, TR =tekrar süresi, ve T, _{1, A, T, 1 B} T ₁ örnek A kez (t, _{1 A)} ve Numune B = _{(t, 1 b)} için CNR maksimize edilmelidir (aynı için geçerlidir T ₂ kez: T _{2, A} ve T _{2, B).}
      NOT: TE, TC, ve α CNR optimizasyon hesaplama elde edilmelidir ise T ₁ ve T ₂ gevşeme süreleri, boyuna ve enine relaksivitelerine (bölüm 2.4) ölçümlerinden elde edilen değerlere ayarlanması gerekir.
      (7)
   6. Önceki adımda (3.2.5) 'de elde edilen parametreler kullanılarak görüntü elde edin.
   7. Sinyal-gürültü oranı (SNR) hesaplayın.
      1. Görüntü ekranı ve işleme içine kazanılmış T _1w görüntü (tarama) yükleyinPencere ve faiz (ROI) bölgesini tanımlar tıklayın.
      2. dairesel ROI seçin ve örnek konumu ve arka planda çizin. Daha sonra, ortalama sinyal genliği (S _sinyali) ve arka plan (S _{gürültüsü)} standart sapmasını elde etmek için ekranda tıklayın.
      3. DCA, GdDOTA ve su numuneleri için yineleyin 3.2.7.2.
      4. Formülü kullanarak SNR hesaplayın: SNR = S _sinyal / S _gürültü.
   8. Biraz değiştirilmiş bir prosedür izlenerek, gevşeme geliştirme (NADİR) yöntemi ile hızlı edinimi ile T ₂ -ağırlıklı (T _2w) görüntüleme gerçekleştirmek. CNR edinme parametrelerinin optimizasyonu için, Denk kullanın. 8.
      (8)

Sonuçlar

DCA hazırlanması iki aşamadan oluşmaktadır: 1) monomerik DOTA tipi tuzunun sentezi (Şekil 1) ve G4 tein dendrimer ve karmaşık dendrimeric Gd (III) daha sonra hazırlanması kenetleyici 2) bağlantı elemanı (Şekil 2) . İlk aşamada, dört karboksilik asitler ihtiva eden bir Cyclen tabanlı DOTA tipi şelatlayıcı olabilir ve başka bir sentetik modifikasyon için uygun olan bir dik grup elde edilmiştir. Tert-butil 2-bromo-4- (4-nitrofenil)...

Tartışma

Dendrimeric MRT-kontrast maddesinin hazırlanması monomerik birimin uygun seçimi gerektirir (örneğin, GD şelatör (III)). Bu paramanyetik iyonun toksisitesini azaltmak ve bugüne kadar, asiklik çeşitli ve makrosiklik kenetleme maddeleri bu amaca ^1-3 karşılık vermektedir. Bunlar arasında, makrosiklik DOTA tip kıskaçlar yüksek termodinamik kararlılık ve kinetik hareketsizlik sahip ve bu nedenle, eylemsiz bir MRT-kontrast maddesinin ^1,18 hazırlanması için en çok tercih edilen bir seçimdir. Hala ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cyclen	CheMatech	C002
tert-Bütil bromoasetat ve nbsp;	Alfa Aesar	A14917
N, N< / em>-Dimetilformamid	Fluka	40248
Potasyum karbonat	Sigma-Aldrich	209619
4- (4-Nitrofenil) butrilik asit	Aldrich	335339
Thionyl chloride & nbsp;	Acros Organics	382662500	Not: Aşındırıcı madde; solunduğunda toksiktir
Brom	Acros Organics	402841000	Not: ciddi cilt yanıklarına neden olur, solunması halinde ölümcüldür
Dietil eter	herhangi bir kaynak
Sodyum sülfat	Acros Organics	196640010
Kloroform	VWR Kimyasalları	22711.29
tert< / em>-Bütil 2,2,2-trikloroasetimidat	Aldrich	364789	Not: yanıcı madde; cildi ve gözleri tahriş eder
Bor triflorür eterat	Acros Organics	174560250	%48 BF3. Not: Yanıcı madde; cilt yanıklarına neden olur, solunması halinde ölümcüldür
Sodyum bikarbonat	Acros Organics	424270010
Etil-asetat	herhangi bir kaynak		Kolon kromatografisi için
n-Hekzan	herhangi bir kaynak		Kolon kromatografisi için
Ampulden ampule (Kugelrohr) damıtma aparatı	Bü		Model tipi: Cam fırın B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Metanol	herhangi bir kaynak		Kolon kromatografisi için
Diklorometan	herhangi bir kaynak		Kolon kromatografisi için
Etanol	VWR Kimyasalları	20821.296
Amonyak	Acros Organics	428381000	Metanol
Paladyumda	Aldrich	643181	%15 ıslak
Hidrojenasyon aparatı PARR	PARR Enstrüman Şirketi
Celite 503	Aldrich	22151
Sinterlenmiş cam hunisi	herhangi bir kaynak
Thiophosgen	Aldrich	115150	Not: cildi tahriş eder; solunduğunda toksiktir
Trietilamin	Alfa Aesar	A12646
Diklorometan ve nbsp;	Acros Organics	348460010	Ekstra kuru
Manyetik karıştırıcı	herhangi bir kaynak
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297
İnce tabaka kromatografi plakaları	Merck Millipore	1.05554.0001
Formik asit	VWR Kimyasalları	20318.297
Lophylizer	herhangi bir kaynak
Gadollinium(III) klorür hekzahidrat	Aldrich	G7532
Sodyum hidroksit	Acros Organics	134070010
pH metre	herhangi bir kaynak
Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat	Aldrich	E5134
Kütle spektrometresi (ESI)	Agilent		İyon tuzak SL 1100
Asetat tamponu	, herhangi bir kaynak		pH 5.8
Ksilenol, turuncu	Aldrich	52097	20 & mu; Asetat tamponunda M
Hidrofilik Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membran (MWCO 3000)
Herhangi	bir kaynağı
santrifüjleyin NMR spektrometresi	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Sürüm 2.1
Yanma analiz cihazı	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Element Analizörü
MALDI-ToF MS cihazı	Uygulamalı Biyosistemler		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Bütil alkol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vorteks karıştırıcı	herhangi bir kaynak
Norell NMR tüpleri	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR koaksiyel tüp	Deutero GmbH	koaksiyelb-5-7
DLS cihazı	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μ m PTFE filtre	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastik tüp şişeleri,	herhangi bir kaynak
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI tarayıcı	Bruker		BioSpec 70/30, USR mıknatıs (7 T). Not: yüksek manyetik alanlarla ilgili potansiyel tehlikeler
RF bobin	Bruker		Çift frekanslı hacim bobini (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (yazılım)	Bruker		Sürüm 5.1