Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı

9.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54795

⸱

10 Kasım 2016

 ,  ,  , 
1Biological Engineering Department, Utah State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Nanoparçacık tabanlı optik problar, Raman ve UV-Vis spektroskopisi kullanarak antijenleri tespit etmek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Burada, gelecekteki çoğullama yeteneklerini içerecek şekilde bir UV-Vis/Raman spektroskopisi immünolojik testi için bu tür probların hazırlanması için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Immünolojik ilişkili antikorların varlığını temel proteinleri tespit etmek için kullanılır. Çünkü araştırma ve klinik ortamlarda onların geniş kullanım, immunoassay aletleri ve malzemelerin büyük altyapı bulunabilir. Örneğin, 96- ve 384-kuyucuklu polistiren plâkalara ticari olarak temin edilebilir ve çeşitli üreticilerden morötesi görünür (UV-Vis) spektroskopisi makineleri için uygun standart bir tasarıma sahiptir. Buna ek olarak, bu tür enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ve özel bağışıklık tasarımları için immünoglobulinler, tespit etiketleri ve bloke edici maddeler, geniş bir çeşitlilik mevcuttur.

mevcut altyapı rağmen, standart ELISA kitleri pahalı ve zaman alıcı olabilir bireyselleştirilmiş immunoassay geliştirme gerektiren, tüm araştırma ihtiyaçlarını karşılamak değildir. genellikle floresan veya col bağlı olarak, örneğin, ELISA kitleri (bir defada birden fazla analitin tespiti) yetenekleri düşük çoklama vartespiti için orimetric yöntemler. Kolorimetrik ve floresan tabanlı analizler, geniş spektral zirveleri nedeniyle çoklama yetenekleri sınırlıdır. Buna karşılık, Raman Spektroskopisi tabanlı yöntemler nedeniyle dar emisyon zirveleri için çoklama için çok daha büyük bir yeteneği var. Raman spektroskopisi bir başka avantajı Raman habercilerin floresan etiketleri 1'den daha az photobleaching tecrübe olmasıdır. Raman habercilerin floresan ve kolorimetrik etiketleri üzerinde sahip olduğu avantajlara rağmen, protokoller Raman tabanlı immünoassaylar sınırlıdır imal. Bu çalışmanın amacı, UV-Vis analizi ve Raman spektroskopisi ile analitlerin doğrudan saptanması için polistiren plakaları ile birlikte kullanmak için fonksiyonalize probları hazırlanması için bir protokol sağlamaktır. Bu protokol, önceden belirlenmiş altyapı üzerinde sermaye ise araştırmacılar gelecekteki çoklu analit tespiti için bir do-it-yourself yaklaşım sağlayacaktır.

Giriş

Tipik sandviç immüno dolaylı iki antikor kullanarak bir antijen mevcudiyetini algılar. zaptedilen antikoru bir katı yüzeye bağlanmış ve uygun bir antijene yakın bir antikor-antijen kompleksi olduğunda oluşturur. Bir saptama antikor kişiye ve antijene bağlanır. Şekil 1A gösterildiği gibi yıkandıktan sonra, antikor / antijen / antikor kompleksinin kalıntıları ve etiketlenmiş algılama antikoru ile tespit edilir. Tipik algılama geniş bir spektrum zirveleri 2,3 nedeniyle 10 analitlerle çoklama sınırlayan, bir flüoresan veya renk ölçümsel detektörü ile yapılır. Buna karşılık, Raman-tabanlı sistemler kadar 100 analitlerin 2,3 eşzamanlı algılama iddia kaynaklarla gelişmiş çoğullama yetenekleri ile sonuçlanan daha dar emisyon zirveleri var.

Birçok literatür kaynakları IMMUNOASSAYS ilgili önemli yönlerini kapsayacak hangi mevcuttur 4-6 gibi adım-adım olarakAyrıntılar kişiselleştirilmiş ELISA kitleri oluşturun. Ne yazık ki, bu protokoller özelleştirilmiş immun çoklayıcı kapasitesini sınırlayan, flüoresan veya kolorimetrik tespiti içindir. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz Şekil 1B gösterildiği gibi doğrudan bir immunoassay için daha önce 7 yayınlanmış UV-Vis / Raman immunoassayin imal etmek detaylı bir prosedür mevcut.

Bu protokol, işlevselleştirilmiş altın nanopartikül bazlı prob imalat, Şekil 2'de gösterilen içerir. Altın nano partiküller yüzeyi (AuNPs) için Raman habercilerin bağlanarak başlar Raman / UV-Vis probları yapmak için prosedür. AuNPs daha sonra polietilen glikol (PEG) ile ilişkilendirilmiş antikorlar ile fonksiyonalize edilir. AuNPs üzerinde kalan bağlanma yerleri analizi sırasında daha sonra spesifik olmayan bağlanma bilmek AuNPs metoksi polietilen glikol tiyol (mPEG-SH) bağlanmak suretiyle engellenir. hazırlanan AuNP Probes antijenlere bağlanması ile test edilmiştirŞekil 1B 'de gösterildiği gibi bir polistiren plaka oyuklarına sabit. ilişkili Raman habercilerin Raman spektroskopisi ile tespit edilirken plakayı yıkayarak üzerine, AuNP sondaları UV-Vis spektroskopisi kullanılarak tespit edilir. UV-Vis ve Raman spektral verileri birleştiren Bu immünodenemenin yeteneklerini arttırmak, analiz iki yöntem sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tamponlar 1. Hazırlık

  1. Fosfat tamponlu tuz (PBS)
    1. 1x PBS konsantrasyonu yapmak için, 450 ml HPLC dereceli su ile 10 kat PBS 50 ml seyreltilir. Steril filtre 0.22 um filtre ile çözeltisi.
    2. oda sıcaklığında saklayın çözüm.
  2. Tris Tamponlu Tuzlu Su + Tween 20 (TBST) hazırlanması
    1. 1x konsantrasyonunu yapmak için, 450 ml HPLC dereceli su ile 10x Tris tamponlu tuz (TBS), 50 ml seyreltilir. Tween-20% 0.05 (h / h) Tween-20, 250 ul ekle. Steril filtre 0.22 um filtre ile çözeltisi.
    2. Oda sıcaklığında saklayınız.
  3. Insan serum albümini hazırlanması (HSA) Bloklama çözeltisi,
    1. HSA çözeltisi ağırlık / hacim% 3 olmak üzere steril filtre edildi 1x PBS 15 ml HSA 0.45 g tartılır. HSA kadar Vortex çözüm tamamen çözülür.
    2. 4 ° C'de saklayın HSA çözüm.
      Not: Sığır Serum Albümini(BSA), bir bloklama çözeltisi olarak kullanılabilir.
  4. PEG'lenmiş antikorun hazırlanması (PEG-Ab) çözeltisi
    Not: antikor çözeltisi bağlanma yerleri N-hidroksi-(NHS) için rekabet ederek konjugasyon reaksiyonlara müdahale böyle BSA gibi taşıyıcı veya stabilize proteinler, bağımsız olmalıdır. Antikor bir Tris veya glisin tampon çözeltisi içinde gelirse, NHS konjügasyon reaksiyonu engellemeyen aminlerin ya da amonyum tuzlan önlemek için bir tampon değişimi geçmesi gerekir. antikor, bir liyofilize formda ise, 1-10 mg / ml'lik bir konsantrasyonda, üreticinin tavsiyesine göre yeniden süspanse edilebilir.
    1. Tris veya glisin tampon içinde antikorlarla, bir tuz giderme kolonu kullanılarak, 100 mM sodyum bikarbonat tampon değişimi. Konjugasyon reaksiyonu hızlandırmak için yaklaşık 8.5'a pH değerini yükseltmek için, 100 mM tampon kullanın.
    2. 100 mm s olan hidrat orto-piridil disülfür, PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS)1 mg / ml veya daha büyük bir konsantrasyonda kullanıldıklarında, 1 ml 'lik bir hacme kadar, sodyum bikarbonat.
      Not: OPSS-PEG-NHS taze ve yaklaşık 20 dakika içinde kullanılmalıdır. OPSS-PEG-NHS NHS grubu pH 8.5'te, bir sulu çözelti içinde, yaklaşık 20 dakikalık bir yarı ömre sahiptir.
    3. 1 oranında (PEG: antikoru) 2 antikor çözeltisine OPSS-PEG-NHS ekleme konjügasyon oranı test numuneleri için kullanılır. kontrol için kullanılacak 1 konjügasyon oranı: Ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 2 antijen çözeltisine OPSS-PEG-NHS ilave edin.
      Not 2: 1 oranında bir% 50 birleşme etkinliğinin üstlenmektedir. Hedef Bir PEG zincirinin her antikorunu etiketlemek için. Bu adımda, aşırı etiketleme altında etiketleme daha iyidir. OPSS-PEG-NHS ve antikor çözeltisi, uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklem kullanarak:
      figure-protocol-1
      V hacmidir, Cı molekülleri ya da ifade edilen konsantrasyondurml başına antikorlarının verilmesinin. İndisler PEG ve Ab sırasıyla OPSS-PEG-NHS ve antikor bulunmaktadır. Nihai hacim, yaklaşık 250 ul olmalıdır.
    4. 8 saat veya gece boyunca 4 ° C 'de, PEG-Ab çözelti inkübe edin. donma ve erime döngülerinde sınırı ve düşük bağlama tüpler kullanımı emin olmak için, -20 ° C 'de yaklaşık 25 ul hacimde çalışan saklayın çözeltisi.

2. hazırlayın UV-Vis / Raman Sondalar

  1. Çıplak AuNP çözüm hazırlayın
    1. Ml başına yaklaşık olarak 1 x 10 11 parçacıkların bir konsantrasyon ile AuNPs bir 2 mi çözelti hazırlayın.
      1. AuNPs konsantre gerekiyorsa, 20 dakika veya süpernatant netleşene kadar 5.000 xg'de 2.000 Stokta AuNP ul ve santrifüj ile düşük bağlanma santrifüj tüpleri doldurmak. AuNP pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, pipetleme süpernatantı.
      2. bir tüp içine kalan AuNP çözümleri birleştirin ve konsantrasyonunun tahminUV-Vis ölçümü elde etmek ve bu doğrusal bir ilişki olarak bilinen konsantrasyonlarda değerleri karşılaştırarak yon.
  2. Uygun Raman muhabiri etiketleme oranını belirlemek
    1. metanol içinde çözülmüş Raman raportör bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Bu konsantrasyon kullanılan muhabiri bağlı olacaktır. Bu çalışmada, 200 uM'lik bir çalışma çözeltisi olarak 3,3-diethylthiatricarbocyanine iyodür (DTTC) hazırlanması.
    2. Her bir kuyu için 100 ul nihai bir hacim varsayarak, Raman raportör 0.2 uM ila 10 uM konsantrasyonu aralığında olacak şekilde 96 oyuklu bir plakanın birinci sırasındaki her çukuruna çalışma raportör çözeltisi kadar ekleyin. hacmi 80 uL olduğu her bir tür için yeterli HPLC dereceli su ilave edilir. Her bir hazne, 100 ul'lik bir son hacim de yapma AuNP 20 ul ekle. Bir örnek, Tablo 1 'de verilmektedir.
    3. UV-Vis spektrumları 400 ila ölçünBir plaka okuma UV-Vis spektrofotometre kullanılarak 700 nm. uygun bir konsantrasyon, UV-Vis spektrumu için tanımlanan tepe en yüksek konsantrasyondur. AuNPs Raman gazetecilere en yüksek konsantrasyon oranına kadar Artan konsantrasyonlarda adımı yineleyin 2.2.2 bulunmuştur.
      NOT: boya ve AuNP şekli, boyutu ve üretici uygun konsantrasyonunu etkiler. Bu nedenle, sıralanan adımlar kullanılan bileşenlere bağlı olarak değerlendirilir ve değiştirilmesi gerekir. Bu protokol, pozitif yüklü bir boya kullanımını kapsamıştır. Bu nedenle, AuNP ve raportör arasındaki bağlanma negatif yüklü AuNPs kullanılarak geliştirilmiştir. Bu sitrat şapkalı AuNPs kullanılarak yapıldı. Daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın.
  3. Raman muhabiri ve PEG-Ab Binding AuNP için
    1. Raman raportör oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AuNPs bağlanmasına izin önceden belirlenmiş konsantrasyonda AuNP ve Raman raportör iki 1.5 mi toplu hazırlayın.
    2. parçacıklara antikor: 1 oranını 200 oluşturmak için AuNP ve Raman raportör çözeltisinin bir toplu PEG'lenmiş antikoru (PEG-Ab) ekleyin. Bu çözelti, test numuneleri için olacaktır. kontrol olarak kullanılmak üzere taneciklerin antikorun: 1 oranında ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 200 AuNP ve Raman raportör çözümün diğer toplu PEG'lenmiş antijeni ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika için çözümler inkübe edin.
      NOT: parçacıklara antikorların oranı AuNPs özgü ve kullanılan boya ve her durum için optimize edilmelidir olacaktır. AuNP probları partiküllerin toplanmasını önler bağlanma burada amaç antikorların en yüksek orana sahip olmaktır. Birlikte eklemek için uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın:
      figure-protocol-2
      V hacmidir, Cı ml başına parçacıklar veya antikorlar olarak ifade konsantrasyondur. yüzgeçark hacmi yaklaşık 1.5 ml olmalıdır.
  4. Blok mPEG-SH ile AuNP yüzeyde siteleri kalan.
    1. su kullanarak bir 200 uM konsantrasyonuna katı metoksi polietilen glikol tiyol eriterek mPEG-SH hazırlayın. mPEG-SH tamamen eriyene kadar çözelti vorteksleyin.
    2. Adım 2.3 yapılan AuNP-PEG-Ab çözüm: 1 oranında bir 40.000 mPEG-SH ekleyin. Altın nanopartikül kalan kısımlar bloke edilmiştir sağlamak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti inkübe edin. Birlikte eklemek için uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın:
      figure-protocol-3
      V hacmidir, Cı ml başına parçacıklar veya antikorlar olarak ifade konsantrasyondur. Nihai hacmi, yaklaşık 1.5 ml olmalıdır.
  5. Fonksiyonalize Raman probları kurtarın.
    1. Düşük bağlama c 20 dakika boyunca 5.000 xg'de santrifüj parçacıklarentrifuge tüpler veya süpernatant netleşene kadar. AuNPs rahatsız etmemek için dikkatli olmak pipetleme süpernatantı.
    2. Daha önce yapılan 1x PBS çözeltisi 1 ml parçacıklar yeniden süspanse edin. çözeltisi (3 uL), küçük bir hacim içinde bir UV ölçümü alınarak AuNP konsantrasyonu hesabının ve bilinen AuNP konsantrasyonundan ölçümlere karşılaştırın. Nihai çözüm ml başına en az 1 x 10 11 parçacıklar olacak şekilde ses seviyesini ayarlayın.
    3. 4 ° C'de saklayın çözümleri immunoassay plaka işlevselleştirilmesi için kullanılan kadar. bir hafta içinde çözümleri kullanın.
Hacimler her bileşenin eklemek için (mi)
DTTC nihai konsantrasyon (mM) DTTC çalışma çözeltisi (200 mM) AuNP Su
0.2 0.1 20 79.9
0.6 0.3 20 79.7
1 0.5 20 79.5
2 1.0 20 79
5 2.5 20 77.5
7 3.5 20 76.5
10 5.0 20 75

Tablo 1. DTTC seyreltme, örneğin. DTTC çeşitli seyreltileri ve stok DTTC altın nano partıküler çözeltisi ve su ilişkili hacimleri.

3. İmmunoassay Plaka Hazırlama

  1. Bağışıklık plakasının istenen antijeni bağlayan.
    1. polistiren kuyu doldurmak için yeterli seyreltilmiş antijen (50 ug / ml) hazırlayın. , Çözüm vortekshemen plaka oyuklarına solüsyonu ekleyin. Antijen, oda sıcaklığında 1 saat boyunca plakaları bağlanmasına izin verir.
  2. Ilişkisiz antijenleri yıkayın.
    1. Bir bertaraf kabına çözüm damping ve bir kağıt havlu kaplı masa karşı plaka vurarak aşırı antijen çözüm çıkarın.
    2. daha önce belirtildiği gibi aynı şekilde yıkama daha sonra yüzey yıkama kaldırmak için oyuklara TBST ilave edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
  3. Blok spesifik olmayan önlemek için plaka bağlama bölgeleri.
    1. plakanın her oyuğuna HSA engelleme çözeltisi 70 ul ilave edin ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    2. Çıkarın ve adım 3.2 'de belirtildiği gibi aynı prosedürü kullanarak plaka yıkayın. Daha fazla kullanım için hazır olana kadar 4 ° C'de plaka ve saklamak kuru örtün.
  4. Immunoassay plaka işlevselleştirmek.
    1. T 70 ul ekleBir 96-yuvalı plakanın birinci sütuna Bölüm 2'de hazırlanan nano-tanecikleri prob ve 1 ile daha sonra sütun seyreltik: 2 dizi dilüsyon. Plaka, en az 1 saat boyunca inkübe izin verin. Immünolojik plaka hazırlanması için nasıl bir örneği Şekil 3'te verilmiştir.
    2. uygun AuNPs imha etme emin adımlar 3.2 detaylı olarak TBST ile beş kez plaka yıkayın. Son yıkamadan sonra her bir göze 1x PBS 70 ul ve bir plaka conta ile kapak.
      NOT: Kontrol numuneleri açık olmalıdır. Spesifik olmayan bağlanma, söz konusu ise, kontrol numuneleri test numuneleri benzer bir renk vardır.
  5. UV-Vis ve Raman spektroskopisi ile test tahlil duyarlılık.
    1. her bir için, UV-Vis spektrumu, bir plaka okuma UV-Vis spektrofotometre kullanılarak 400 ila 700 nm arasında değişen ölçer.
    2. ters bir Raman mikroskobu kullanılarak, AuNP probları vardır kuyunun yüzeyine hedefi odaklanır. obiyi bir Raman tain. 1800 cm -1 400 cm arasında değişen bir spektrum toplayın -1. Tüm kuyuları için bu adımı tekrarlayın.
    3. Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, UV-Vis spektrumları için Raman için 11. dereceden çok terimli temel düzeltme ve 3. sipariş Polinom gerçekleştirin.
    4. Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, Raman ve UV-Vis spektrumları normalleştirmek. 1 maksimum değeri belirler ve buna göre tüm diğer değerleri ölçek. Raman normalleştirmek için, benzersiz bir polistiren tepe seçmek ve eşit 1'e set ve buna göre tüm diğer değerleri ölçek.
    5. Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, her spektrum için zirve entegrasyonu gerçekleştirmek. Raman için, Raman raportör temsil pik polistiren zirveleri bir bölge Evde olmayan olmalıdır. zirve entegrasyonunu gerçekleştirmek için, istenilen zirve için ayrılmaz sınırlarını belirlemek ve kontroller dahil olmak üzere tüm örnekler için istenen pik alanı kaydedin.
    6. plilişkili standart sapma gösteren her bir nokta için hata çubukları ile beraber AuNP konsantrasyonunun log bir fonksiyonu olarak ilgi ortalama pik alanı ot. 4 parametreli bir lojistik eğri bu kalibrasyon noktası uygun.
    7. Boş numune için ilgi zirve alanının ortalamasının alınmasıyla boş ortalama değerini belirler. Bu alanların standart sapmasını belirlemek; Bu boşluğun standart sapma olduğunu.
    8. önceki adımda analiz Aynı zirve için, en düşük konsantrasyonu için bu zirve alanının standart sapması bulabilirsiniz.
    9. Temsilcisi sonuçları bölümünde belirtildiği gibi algılama boş ve alt limit sınırını hesaplayın. AuNP konsantrasyonu cinsinden LLOD belirlemek için 4 PL kalibrasyon eğrileri bu değerleri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, 60 nm altın parçacıkları, UV-Vis spektroskopisi kullanıldı. UV-Vis bir açık kaynak spektral analiz yazılımı 8 kullanılarak belirlenir edildi her AuNP konsantrasyonu için 400 700 toplanmıştır nm ve pik alanları absorpsiyon spektrumları. entegrasyon tepe önce toplandı, spektrumları bir üç nokta polinom uygun kullanılarak esas çizgi düzeltmesi yapıldı. Tepe Alanı, Şekil 4'te gösterildiği gibi, bir logaritmik kalibrasyon eğrisi meydana getirmek için kullanıldı. Şekiller ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ayrıntılı protokolde, adres birçok kritik noktalar vardır. Tek sorun Raman muhabir ve altın nanopartikülünün seçimdir. Protokol bağımsız kullanım için adapte edilmesi yazılmış de, Raman raportör DTTC örnek olarak kullanılmıştır. DTTC pozitif yüklü bir muhabir ve olumsuz gibi sitrat şapkalı AuNPs olarak yüzeyleri ücret bağlanır. Bu protokol, yüzey yükü ile altın nano parçacıklar kullanarak negatif yüklü muhabir için adapte edilebilir. Örneğin, polietilenimin (PEI) başlıklı AuNPs pozitif yüzey yüküne sağlamak ve daha iyi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Utah Eyalet Üniversitesi'nden bir Araştırma Katalizörü Ödülü ile desteklenmiştir. Yazarlar katkılarından dolayı Annelise Dykes, Cameron Zabriskie ve Donald Wooley'e teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
60 nm AltınNanoparçacık Ted Pella, Inc.15708-6Bunlar sitrat başlıklı altın nanopartiküllerdir. Raman muhabiri ile AuNP yüzey yükü arasındaki ilişki ve bunun AuNP ve/veya Raman muhabirinin doğru seçimine etkisi için lütfen Tartışmaya bakın.
Sodyum BikarbonatFisher ScientificS233-500
MetanolPharmco-Aaper339000000
Tris Tamponlu Salin (10x) pH 7.5Scy TekTBD999
Şişe Üstü Filtrasyon ÜnitesiVWR97066-202
Tween 20 (polisorbat 20)Scy TekTWN500Yıkama aşamaları için emülsifiye edici bir ajan olarak kullanılır.
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su 10x Konsantresi, pH 7.4Scy TekPBD999
Protein LoBind Tüpü 2.0  mlEppendorf Tüpleri22431102LoBind tüpleri, proteinlerin ve AuNP'lerin tüplerin yüzeylerine bağlanmasını önler.
Protein LoBind Tüpü 0.5  mlEppendorf Tüpleri22431064LoBind tüpleri, proteinlerin ve AuNP'lerin tüplerin yüzeylerine bağlanmasını önler.
Mikroplaka Cihazları UniSealGE Healthcare7704-0001İşlevselleştirilmiş plakaların sızdırmazlığı ve saklanması için kullanılır.
Düşük Buharlaşma Kapaklı Test Plakası, 96 Kuyu Düz TabanlıCostar3370
HPLC sınıfı suSigma Aldrich270733-4L
3,3′-Dietiltiyatrikarbosiyanin iyodür (DTTC)Sigma Aldrich381306-250MGRaman muhabiri
mPEG-Thiol, MW 5.000 - 1 gramLaysan Bio, Inc.MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1  gramLaysan Biyo A.Ş.OPSS-PEG-SVA-5000-1gOPSS-PEG-SVA'nın bir NHS ucu vardır.
Fare IgG, Tüm Molekül KontrolüThermo Fisher Scientific31903Antijen
Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil AntikorThermo Fisher Scientific31164Antikor
İnsan Serumu Albümin Bloke Etme ÇözeltisiSigma AldrichA1887-1GSığır serum albümini kullanılabilir.
Mini SantrifüjFisher Schientific12-006-900
UV-Vis SpektrofotometreThermo ScientificNanodrop 2000c
UV-Vis SpektrofotometreBioTekSynergy 2
Tuz Giderme KolonuThermor Scientific87766
Şirket içi inşa 785  nm ters Raman mikroskop ünitesiN/AN/ATers çevrilmiş bir Raman mikroskobu, kuyu plakasının yüzeyine düzgün bir şekilde odaklanmak için en iyisidir. Aksi takdirde, 96 oyuklu plakanın yüksekliği nedeniyle çok düşük bir büyütme kullanılacaktır. Bir satıcıdan satın almaktan daha ucuz olduğu için şirket içi inşa edilmiş bir sistem kullanıldı. Bununla birlikte, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir ters Raman mikroskop sistemi kullanılabilir.

Kaynaklar

  1. Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582(2015).
  2. Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
  3. Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
  4. The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
  5. Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
  6. ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
  7. Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
  8. Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
  9. Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
  10. Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
  11. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
  12. EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
  13. Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084(2013).
  14. Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582(2015).
  15. Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).
  16. Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).
  17. McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

UV Vis SpektroskopisiAlt n Nanopar ac k mm nanaliziAntikor Fonksiyonelle tirmesiPolistiren Plaka AnaliziSeri Dil syon Y ntemiTBST Y kama ProtokolHSA Bloklama zeltisiRaman Raporlay c ProblarTespit Limiti
Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.