Yöntem makalesi

HIV-1 enfekte olmuş hücrelerden eksozom SILAC Bazlı proteomik Karakterizasyon

10.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54799

⸱

3 Mart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

Bu makalede

Özet

Burada, ana exosomal proteomlarda HIV-1 enfeksiyonunun etkilerini analiz etmek için hücre kültürü (SILAC) amino asitler ile izotop etiketleme tekniği kullanılarak kantitatif proteomik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, kolayca farklı gerilme veya enfeksiyon koşullarda hücrelere uyarlanabilir.

Özet

Proteomik, proteinlerin büyük ölçekli analizidir. Sıvı kromatografisi tandem kütle spektroskopisi (LC-MS/MS) gibi proteomik teknikler, aynı anda binlerce proteini karakterize edebilir. Bu güçlü teknikler, özellikle hücreler enfeksiyonlar, stresler ve spesifik test koşulları gibi çeşitli uyaranlara maruz kaldıklarında, hücresel değişiklikler hakkında sistemik bir anlayışa sahip olmamızı sağlar. Son gelişmelerle bile, ekzozomal proteomu analiz etmek zaman alıcıdır ve genellikle karmaşık metodolojiler içerir. Ek olarak, ortaya çıkan büyük veri seti, araştırmacıların daha fazla aşağı akış çalışması yapabilmesi için genellikle sağlam ve kolaylaştırılmış analize ihtiyaç duyar. Burada, hücreler HIV-1 ile enfekte olduğunda ekzozomal proteomu karakterize etmek için SILAC tabanlı bir protokolü açıklıyoruz. Yöntem, basit izotop etiketlemesine, diferansiyel olarak etiketlenmiş hücrelerden eksozomların izolasyonuna ve kütle spektrometresi analizine dayanmaktadır. Bunu, proteomik isabetlerin ayrıntılı veri madenciliği ve biyoinformatik analizi takip eder. Elde edilen veri kümelerinin ve adayların anlaşılması kolaydır ve genellikle aşağı akış analizi için yararlı olan çok sayıda bilgi sunar. Bu protokol, diğer hücre altı bölmelere ve çok çeşitli test koşullarına uygulanabilir.

Giriş

viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere bir çok insan hastalıkları, sık sık etkilenen hücrelerin etrafında yer alan farklı hücresel süreçleri ile ilişkilidir. Proteinler, genellikle bu süreçleri arabuluculuk, nihai hücresel efektör olarak hareket. Proteinlerin analizi sıklıkla etkilenen hücrelerin yerel çevreye kadar çok değerli bilgiler sağlar ve hastalık patogenezinde altta yatan mekanizma anlamak için bize yardımcı olabilir. Çeşitli protein analiz teknikleri arasında, proteomik özellikle büyük umut vaat ediyor. güçlü, geniş çaplı bir aracı olarak, proteomik, özellikle fonksiyon ve protein etkileşim alanında, hücresel süreçlerin bir tarihsel sağlayabilir. Belirli proteinlerin analiz İnceleme bölgesinde, araştırmacılar, hücresel bileşenler, özellikle de proteinlerinin ekspresyonunu izlemek için izin etiketleme teknikleri geliştirilmesi yoluyla basit yapılır. Birçok proteomik analizler hücresel gerçekleştirilen olmasına rağmenproteom ölçeği, hücre içi bölmeleri üzerinde proteomik karakterizasyonu 1 özellikle bilgilendirici olduğu kanıtlanmıştır. Bu HIV-1 enfeksiyonu ile ilgili çalışmalarda iyi örneklenmiştir.

Eksozomlar, hücre tipleri 2, 3, geniş bir yelpazede tarafından salgılanan 30-100 nm zar vezikülleri arası iletişim ve moleküler taşıma önemli bileşenleridir. Daha önce HIV-1 tomurcuklanma 4, 5 önemli roller oynamaya keşfedildi. Fonksiyonel diseksiyon ile proteomik analizi birleştirerek, HIV-1 ile enfekte hücrelerden salınan eksozomlar hücresel apoptoz ve çoğalması 6 olmak üzere alıcı hücreler, komşu hücresel özelliklerini etkileyecek eşsiz ve nicelik farklı protein imza ve liman düzenleyici moleküller oluşur bulundu. yöntemler bu protokolde tarif edilmiştir,yani SILAC HIV-1 enfekte hücreleri eksozom 7 göre proteomik karakterizasyonu (hücre kültürü içinde amino asitler ile izotop işaretleme). Benzer yaklaşımlar, daha özel bir bölme veya ilgi fraksiyonuna deneysel gerilme ayarlama ve tarif edilen prosedürlere, gerekli değişiklikler yaparak patojenez sırasında, diğer alt-hücresel bölümleri anlamak için uygulanabilir.

kantitatif proteomik yöntemlerin son gelişmeleri göz önüne alındığında, belirli bir deney için en etkili yöntem seçerken seçim için pek çok vardır. Bunlar arasında kimyasal bazlı iTRAQ (göreli ve mutlak ölçümü için izobarik etiketleri) 8 ve etiket içermeyen MRM (çoklu reaksiyon izleme) 9 teknikleridir. Her iki yöntem güçlü araçlardır ve özel ayarlar için iyi seçimlerdir. Tipik bir laboratuvar ağırlıklı hücre hatları ile çalışmak için, ancak, bu iki yöntem şansı göreceli vary yüksek maliyetler ve vardır daha zaman alıcı SILAC tabanlı yönteme göre. SILAC hücresel protein olarak kültür ortamından amino asit radyoaktif olmayan izotop formlarını içeren bir metabolik göre etiketleme tekniği. Tipik haliyle, SILAC deneyler, örneğin iki hücre popülasyonlarının, enfekte olan ve olmayan ile başlar. Tam etiketleme elde edilene kadar her diferansiyel kendine özgü izotopik ortamda etiketlenir. Bu hücrelerin etiketli eksozomlar sonra protein ekstre etmeye tabi tutulmaktadır. Bir kez etiketli exosomal proteinleri sıvı kromatografisi tandem kütle spektroskopisi 10 kullanılarak analiz edilmektedir, ayıklanır. Son olarak, kütle spektrometresi sonuçları ve önemli ölçüde etiketli proteinler istatistiksel tabi tutulur ve biyoinformatik titiz biyokimyasal doğrulama yanı sıra analiz eder. Bizim daha önceki soruşturma raporları hücre hatları bir genellikle olduğu gibi SILAC / eksozom prosedürleri, birincil hücrelerden daha hücre hatları için daha uygun olacağı kanısındayızverimli izotop etiketleme için aktif prolifere devlet,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Kültürü ve HIV-1 enfeksiyonu

NOT: deneyler başlamadan önce, bir MTT testi 12 ile Tripan Mavisi boyaması 11 ile hücrelerin canlılığı ve çoğalmasını kontrol edilmesi tavsiye edilir. Aynı zamanda yeni hazırlanan SILAC ortamını kullanmak için kritik öneme sahiptir. Çeşitli hücre çizgileri de aktif olarak çoğalma aşamasında olan ve HIV-1 enfeksiyonu, veya tercih test koşulu duyarlı olduğu sürece, kullanılabilir. Bu protokol, örnek olarak H9 hücre hattı kullanın.

  1. Her bir hücre kültür şişesi içine Tohum 2 x 10 6 H9 hücreleri. % 10 diyalize edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 100 mg / L '13C 6 L-lizin ve 100 mg / L 13 C 6 15 N4, L-arginin ihtiva eden RPMI 1640 ortamında etiketli 10 ml bir grup büyütün. FBS% 10 diyalizlenmiş, 100 mg / L L-Lizin ile 100 mg / L L-arginin ile, 10 ml işaretlenmemiş RPMI 1640 ortamı diğer grup büyütün.
  2. Ağır amino asitler ile etiketlenmiş ortam içinde hücrelerin proteinler, hemen hemen tamamen etiketlenir ve bu noktada altı katlanmaya (>% 99) hücreleri büyütün. taze medya ekleyin veya düzenli ortamı değiştirmek (her 1-3 gün hücre tipine bağlı olarak. H9 hücre için, orta her 3 günde değiştirme). Etiketleme sonunda, daha fazla hücre büyümeyi kültür hacmi (örneğin ~ 30 mi) artar.
    Not: Tripan Blue lekelemesi ve hücre sayımı ile deneyin başlangıcında ikiye katlanma süresinde tam hücre belirler.
  3. HIV-1 NL4-3 48 saat boyunca standart bir HIV-1 enfeksiyonu protokolü 13 ile etiketlenmiş hücreleri enfekte etmektedir. 0.3 civarında bir enfeksiyon çokluğu (MOI) virüs uygun miktarlarda hücreleri inkübe edin. Bir HIV-1 p24 antijen ELISA kiti kullanılarak kültür süpernatanlarının p24 miktarının HIV-1 enfeksiyonu kontrol edin. Hücrelerin başarılı enfeksiyonu teyit etmek için bir immünofloresan tahlil 14 gerçekleştirin. Keep, HIV-1 enfeksiyonu olmayan etiketlenmemiş ortam içinde etiketlenmemiş hücrelerin büyüyen.
  4. enfeksiyon sonunda (adım 2.1) de her iki grubun süpernatantlar hasat.

2. Exosome İzolasyon

Not: ultrasantrifügasyon bir dizi aşama ile, kültür süpernatanlarından exosomal kısımlar 15 zenginleştirilmiştir. En az 100,000 x g hızda ulaşabilir Ultrasantrifüj rotoru ile 4 ° C 'de, aşağıdaki adımları gerçekleştirir.

  1. Hücreleri kaçınarak, 50 ml konik tüplerde kültürlerin süpernatantlar toplayın. kalan hücrelerin çıkarılması için, 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
  2. Yeni 50 ml konik tüplerde süpernatantlar toplamak ve ölü hücreleri çıkarmak için 2,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj. Ultrasantrifügasyon dayanabildiğinden ticari rotor uyumlu tüplere süpernatantlar elde edilen transfer.
  3. ultrasantrifüjdeki tüpleri dengelemek için emin olun. çıkarmak için 10,000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj tüplerihücre enkazı.
  4. 100,000 x g'de 70 dakika süreyle ultrasantrifüj tüplerde süpernatantlar ve santrifüj toplayın. süpernatantlar atın.
  5. Taze PBS 5 ml eksozom zengin pelet yeniden süspanse edin. 100,000 x g'de 70 dakika boyunca tekrar taze ultrasantrifüj tüpleri ve santrifüj çözüm aktarın.
  6. Sil süpernatantlar. eksozomlar uzun vadeli saklamak için, -80 ° C de PBS ve mağaza 50 ul pelet tekrar süspansiyon. Aşağıda gösterildiği gibi, alternatif olarak, bir protein ekstre doğrudan devam edin.

3. Protein Ekstraksiyon ve Hazırlık

  1. katma proteaz inhibitörü kokteyl ile 100-200 ul RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponu izole exosomal pelet çözülür. Tampon pH 7.6, 25 mM Tris-hidroklorür, 150 mM sodyum klorid,% 1 NP-40,% 1 sodyum deoksikolat ve% 0.1 SDS (sodyum dodesil sülfat) oluşmaktadır. proteaz inhibitörü kokteyl Aprotinin, bestatin, l gibi proteaz inhibitörleri, çeşitli içermelidireupeptin, A ve EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) pepstatin, bu proteazların bir dizi inhibe edebilir.
  2. 13.000 xg (4 ° C) 'de 10 dakika boyunca eritildi çözüm santrifüj ve yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine temizlenir süpernatantlar aktarın.
  3. Bisinkoninik asit (BCA) ya da Bradford tahlili 16 kullanılarak eksozom Her numunenin protein konsantrasyonu ölçmek.
  4. etiketlenmiş ve etiketlenmemiş örneklerden protein eşit miktarda (2 ug) karıştırın ve 120 mA'da% 4-20 SDS-PAGE jel üzerinde eşit bir karışımı çalıştırmak / 200 V, 30 dakika.
  5. Coomassie Mavisi ile Leke jel 17 lekenin izledi.
  6. Bir jilet kullanarak, jel örnek şeritten kesti. Sonra 10-15 eşit parçaya jel şeritten kesti. 10-15 tüpler toplam taze bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine her parçası koyun.
  7. % 50 asetonitril, girdap, 25 mM NH4 HCO3 küpleri daldırın ve süpernatantlar atın. İki kez tekrarlayın. KuruBir vakum konsantratör 18 19 küp.
  8. 10 mM ditiyotreitol (DTT), girdap ve santrifüj kısaca ile küpleri rehidrate. 1 saat boyunca 56 ° C'de inkübe edin. Süpernatantı atın.
  9. 55 mM iyodoasetamit, girdap ve spin jel küpleri daldırın. 45 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin. Süpernatantı atın.
  10. 25 mM NH 4 HCO 3, girdap, spin küpler daldırın ve supernatant atın.
  11. % 50 asetonitril, girdap ve spin 25 mM NH 4 HCO 3 küpler daldırın. 3.9 ve 3.10 tekrarlayın.
  12. bir vakum deriştirme aygıtı içinde, küpler kurutun. 25 mM NH4 HCO3 25 ul sıralaması derecesi modifiye tripsin ekleyin, 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe ve fazla solüsyonu atın. Tripsin olmayan 25 mM NH4 HCO3 küpleri bırakın ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir.
  13. Kısaca aşağı küpler spin ve ekstra ortaya çıkan peptid transferiyeni bir tüpe CT. 30 dakika ve dönüş için, küp% 50 asetonitril içinde bir girdap% 5 formik asit içinde 30 ul ekle. ekstraktı ile süpernatant birleştirin. en az 5 ul bir vakum konsantratör peptid kurutun.
  14. LC-MS / MS analizi için kütle spektrometresi çekirdek imkan numuneleri gönder. açık kaynak yazılım elde edilebilir MS analizi verileri, tipik bir katılım tanımlanan her protein için sayı, etiketli / etiketsiz oranları ve belirlenen eşsiz peptidler numarasını içerir.

4. Western Blot Doğrulama

Not: Western lekeleme kütle spektrometresi sonuçları doğrulamak için tavsiye edilir.

  1. Standart batı lekeleme protokolleri takip ve yüklenen her gruptan protein, eşit miktarda sağlamak. MS tarafından belirlenen faiz proteinlerine karşı antikorlar (örneğin anneksin A5, laktat dehidrogenaz B zinciri) kullanın. dansitometrisi analysi ile Western lekeleme algılamas, MS protein tanımlama ve miktar doğru olduğunu teyit edebilir.

5. Proteomik Veri Analizi

NOT: Her MS çoğaltmak için önemli bir protein adayların veri kalitesinin değerlendirilmesi, veri hazırlama, hesaplama ve kararlılık ayrı ayrı yapılır. Yukarıdaki analizler tamamlandığında, çoğaltır analiz verileri karşılaştırılmış ve 21 20, 6 birleştirdi.

  1. MS verilerin kalitesini değerlendirin.
    1. İlk olarak, SILAC-MS bir elektronik tablo programı / sayısal proteinlerin etiketsiz oranları etiketli dönüşümü log2.
    2. bilimsel grafik ve istatistiksel yazılım, grup içinde 40-100 oran bidonları içine oranları ve bir histogram oluşturmak için göz başına oranları sayısını arsa. Histogram bir normal dağılım MS verilerinin 6 kaliteli olduğunu gösterir. Tüm MS çoğaltır için bu adımı yapmak.
  2. MS peptid oranları güven ve doğruluğunu artırmak için, en az iki sayısallaştırılmış peptidler olan proteinlerin kaldırmayı düşünün.
  3. Önemli ölçüde yukarı ve aşağı düzenlenmiş protein adayları belirlemek için, önemi 22 eşikleri hesaplamak için aşağıdaki adımları kullanın.
    1. bilimsel grafik ve istatistik yazılımı olarak, frekans dağılım verilerine olmayan bir lineer regresyon veya eğri-fit oluşturmak. Bu adım, kesme değerlerini hesaplamak için kullanılabilir değerleri elde edilir. % 99 güven sınırları için 1.96,% 95 güven sınırları için σ veya 2.56 σ ± medyan olarak kesme değerlerini hesaplayın.
      NOT: kesilecek hesaplanması spesifik ayrıntılar Emmott ark bulunabilir. 22.
    2. ya medyan altında (belirgin aşırı ifade edilir) ortanca üzerinde fazla 1.96 (veya 2.56) standart sapmalar veya daha düşük 1.96 (veya 2.56) standart sapmalar (kimin oranları protein adayları seçmekönemli ölçüde altında ifade edilir).
  4. tutarlılığı sağlamak için yukarıda tanımlanan önemli adayların çoğaltır karşılaştırın. Onlar bu son seçim adımı geçmesi için aşağıdaki kriterlere uygun olduğundan emin olun: Adayların sürekli tüm çoğaltır tespit edilmelidir; ve bir adayın çoğaltır düzenleme onların yönünde tutarlı olmalıdır (up-regüle veya aşağı-regüle tercihen bir adayın 3 çoğaltır üzerinden en az 2 ya da olmalıdır).
  5. onların çoğaltır 'verilerini birleştirerek yukarıda belirtilen ölçütleri karşılayan adaylar için veri tamamlayın.

6. Biyoinformatik Doğrulama ve Karakterizasyonu

NOT: Mevcut genomik ve biyoinformatik bilgiler hemen hemen her protein için bilgi hazinesi sunuyor. Bu bilgilere Veri madenciliği ve biyoinformatik analizi önemli adayların mülkiyet ve işlevleri içgörü büyük bir kazanma konusunda yardımcı olabilir. bu Process uygun aşağı ıslak laboratuvar deneyleri tasarlamak için genellikle gereklidir.

  1. Onların GenBank Erişim numaraları veya UniProt kimlikleri, mevcut eksozom veritabanlarının karşı aday arama (Exocarta 23, Evpedia 24) kullanarak aday proteinleri daha önce exosome bulunmuştur doğrulamak için. Bu adım adayları Eksozomlann gerçekten de olan güven bir katman daha ekler.
    1. Erişim http://www.exocarta.org/, "sorgu" ve giriş ya gen veya protein adı / erişim numarası tıklayın. Bir özet sayfası görünecek ve exosome deliller herhangi varsa sağlanan gösterilir.
  2. HIV-1 ve insan Protein Etkileşimi Veri 25 aleyhinde bulundu. Alternatif olarak, aday proteinlerin etkileşim ve deney durumu hakkında bilgi verebilir belirli veritabanlarında arama.
    1. www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV de veritabanına erişmekEtkileşimler. 'Protein etki alanı adı' Girişte adayların adlarını veya katılım numaralarını girin ve arama tıklayın. Arama sonuçları HIV-1 ve protein adaylar arasındaki etkileşimlerin içgörü sağlamak ve gerçekten HIV-1 ile ilişkili olabilir adayların hangi önerebilirsiniz.
  3. İthalat GenBank numaraları ya da (örneğin FunRich, Fonksiyonel Zenginleştirme analiz aracı 26 gibi) GO analiz yazılımı içine adayların UniProt kimlikleri ve yazılımı çalıştırmak.
    1. http://www.funrich.org/ de yazılımını indirin. Yükleme tamamlandıktan sonra, zenginleştirme analizi altında, tıklayın "Veri Kümesi Ekle" Yazılımı açmak ve protein / genlerin listesini yükleyin. Sonraki GO analizi görselleştirmek için grafik türünü seçin.
      NOT: GO analiz sonuçları pasta grafikler şeklinde görüntülenmiştir edilecektir. Bu adım (Biyolojik Süreci (BP), Hücresel Bileşeni alanlarında adayları ile ilişkili küresel fikir edinmek için C yardımcı olurC) ve moleküler işlev (MF).
  4. Erişim DAVID http://david.ncifcrf.gov/ 27 de, kendi web sitesinde "Fonksiyonel Annotation Tool" tıklayın. Gibi "UniProt kimliği" olarak genin "Identifier" seçeneğini, aday listesine girin "Gen Listesi" ve arama seçin. zenginleştirilmiş GO şartları, p-değerleri ve diğer parametreler "Gene_Ontology" kategorisi altında "Annotation Özeti Sonuçları" sayfasını tıklayarak ulaşabilirsiniz.
  5. Diğer proteinler ile adayların potansiyel etkileşimleri araştırmak için, potansiyel protein-protein etkileşimleri ve olası biyokimyasal yollar aydınlatmak için açıkça erişilebilir STRING veritabanı 28 kullanın.
    NOT: Analiz ve Fonksiyonel Açıklaması (Bölüm 6,3-6,4) GO da son STRING yazılımı kullanılarak yapılabilir.
    1. http://string-db.org/ de veritabanına erişmek. belirlenen s girdi protein kimliği veya diziAraması kutu ve analiz için doğru tür seçin. "Ara" düğmesini tıklatın. Sonuçlar hem doğrudan (fiziksel) ve dolaylı (işlevsel) dernekler hakkında bilgi verecektir. exosomal aday için ilk on bilinen maçlar görüntülenir ve önemli aday seçiminde dikkate alınmalıdır.
      NOT: Adayların ile ilişkili bilgilerin bir hayli yukarıdaki adımları kullanarak analiz edilebilir. en önemli adaylar, daha aşağıda moleküler ve biyokimyasal analiz için seçilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1A SILAC etiketleme prosedürü 21 gösteren bir akış şemasıdır. eksozomlar arındırmak için, numuneler santrifüj yoluyla döndürülür gerekir. Şekil 1B seri Ultrasantrifügasyon 21 exosome saflaştırma adımları göstermektedir. saflaştınldı sonra prosedür de tarif edilen, eksozomlar deney proteomik analize tabi tutulur.

Şekil 2A, p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda tarif edilen prosedürlere olarak, ana exosomal proteomu HIV-1 enfeksiyonunun etkisini araştırmak için SILAC tekniğin uygulanmasını göstermektedir. Başlangıçta, enfekte edilmemiş ve HIV-1 ile enfekte edilmiş hücreleri, farklı olarak, izotopla işaretli bulunmaktadır. farklı şekilde etiketlenmiş eksozomlar sonra protein çıkarma yapmadan önce saflaştırılır. Daha sonra, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi exosomal Proteomun analiz için kullanılır. Son olarak, elde edilen kütle spektrometresi veri ve potan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemişlerdir.

Teşekkürler

Bu çalışma BR ömrü / Tufts / Kahverengi SYAO, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 ve K24HD080539 bir arra ek tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ömrü Pilot Araştırma Fonu (# 701- 5857), Rhode Island Vakfı Tıbbi Araştırma Grant (# 20133969), ve ML NIH COBRE URI / RİH Pilot Araştırma Grant (P20GM104317) tarafından desteklenmiştir. Biz el yazması ve şekil hazırlanması ile ilgili yardım için, James Myall ve Vy Dang teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
H9 hücre hattıATCCHTB-176
Tripan MaviThermo Fisher15250061
MTT tahlil kitiThermo FisherV13154
Diyaliz fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher26400044
SILAC Protein Kantitasyon Kiti – RPMI 1640Thermo Fisher89982DMEM versiyonu (89983)
L-Arginin-HCl, 13< / sup>C6< / sub>, 15< / sup>N<>sub4< / sub>88431
>C <>sub 6< / sub> SILACThermo Fisher88431
HIV-1 NL4-3NIH AIDS Reaktif Programı için2480
Alliance HIV-1 p24 Antijen ELISA kitiPerkinElmerNEK050001KT
Soğutmalı süper hızlı santrifüjEppendorf22628045
Soğutmalı ultra santrifüjBeckman Coulter363118100.000 x g
50 mL Konik Santrifüj TüplerineThermo Fisher14-432-22
Ultrasantrifüj TüpleriBeckman Coulter326823
SW 32 Ti RotorBeckman Coulter369694
RIPA tamponuThermo Fisher89900
Proteaz İnhibitörü KokteylleriThermo Fisher  78430
ThermoMixer Eppendorf5384000020
BCA Protein Test Kiti Thermo Fisher23250
SpektrofotometreBiorad1702525
SDS SAYFASI Jel aparatıThermo FisherEI0001
Novex %4-20 Tris-Glisin Mini JellerNovexXV04200PK20
Jel boyama reaktifiSigma AldrichG1041
Sıralama Sınıfı Modifiye TripsinPromegaV5111
SpeedVac KonsantratörThermo FisherSPD131DDA
İnsan ekine karşı antikor A5Abcamab14196
İnsan laktat dehidrojenaz B zincirine karşı antikorAbcamab53292
Grafik ve İstatistiksel YazılımSistemleri SigmaPlot Veya GraphPad Prism
Kantitatif proteomik yazılım paketiMax Planck Biyokimya EnstitüsüMaxquant 
Yazılım ve veritabanlarıÇeşitli satıcılarAyrıntılar için ana metne bakın
SILAC Thermo Fisher için ulaşabilmelidir

Kaynaklar

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SILAC Proteomi iEkzozom zolasyonuHIV 1 EnfeksiyonuLC MS MS AnaliziProtein EkstraksiyonuUltrasantrif gasyonSDS PAGE JeliBiyoenformatik AnalizGO Zenginle tirmesiSTRING Veritaban

İlgili makaleler