Yöntem makalesi

Squid pigmentlerin çıkarılması için bir yöntem Doryteuthis pealeii

DOI:

10.3791/54803

⸱

9 Kasım 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of New Hampshire, 2Materials Science Program, University of New Hampshire

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalamar Doryteuthis pealeii kromatoforlardaki nano yapılı granüllerden pigmentlerin çıkarılması için bir protokol verilmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kafadanbacaklılar, algılama, iletişim, savunma ve üreme amaçları için dermal renklenmede hızlı ve uyarlanabilir değişikliklere uğrayabilir. Bu yetenekler kısmen kromatoforlar olarak bilinen pigmentli organların alansal genişlemesi ve geri çekilmesi ile desteklenir. Kromatoforların bağlı bir pigmentli granül ağı içerdiği bilinmesine rağmen, yapı-işlev özellikleri tam olarak detaylandırılmamıştır. Kalamar Doryteuthis pealeii kromatoforlarındaki nanoyapılı granülleri izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz ve bunlarla ilişkili pigmentlerin asidik çözücülerde nasıl ekstrakte edilebileceğini gösteriyoruz. Bunu başarmak için, kromatofor içeren dermal tabaka önce yüzeysel bir diseksiyon kullanılarak manuel olarak izole edilir ve pigment granülleri sonikasyon, santrifüjleme ve yıkama döngüleri kullanılarak çıkarılır. Saflaştırılmış granüller içinde hapsedilen pigmentler daha sonra asidik metanol çözeltileri yoluyla ekstrakte edilir ve görünür renkten yoksun daha küçük çaplara sahip nanoyapılar bırakır. Bu ekstraksiyon prosedürü, granüllerden izole edilen% 58'lik bir çözünür pigment verimi üretir. Bu yöntem kullanılarak, kromatofor pigmentlerinin bileşimi belirlenebilir ve kafadanbacaklılarda adaptif renklenme mekanizması hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tür kalamar, mürekkepbalığı ve ahtapot gibi kafadan bacaklılar dinamik kamufle ve sinyalizasyon için kendi görünümünü değiştirmek için yeteneği var. 1-6 Bu özellik kromatoforların olarak bilinen pigmentli organların seçici alansal genişleme kısmen destekleniyor. 4,7-9 kromatoforların vardır onlar harekete geçirilir gibi kas lifleri tarafından radyal demirlemiş bir cytoelastic sacculus içinde sınırlı nano yapılı pigment granüllerinin bir ağ ihtiva yumuşak aktüatörler. 1,3, kromatoforlar organı boyunca granülleri dağıtmak sunulan yüzey alanı% 500 genişletin. 3,7 Bu işlem, kromatoforların bir dizi üzerinden birbiriyle uyumlu olduğunda, 10,11, hayvanın genel rengi değiştirilir. Bu pigment granülleri bu renk değişikliğine neden olduğu bilinmekle birlikte, bunların bileşimi bilinmemektedir. Bu izole edilmesi ve gelecekteki kompozisyon çalışmalar için uyarlanabilir chromatophore pigmentler saflaştırmak için bir prosedür açıklanmaktadır.

pigment granüllerinin izolasyon multistep çıkarma, homojenizasyon ve arıtma işlemini içerir. 3,12 chromatophore içeren doku kafadanbacaklı itibaren dikkatli çıkarıldıktan ile hasat edilir. Bir sindirim ve homojenizasyon işlem daha sonra chromatophore hücreleri çevreleyen doku ayırmak ve ayırmak için kullanılır. nano yapılı granüller tekrar sonifikasyon ve santrifüjlemeden kullanılarak geri kalan kromatoforların den daha sonra izole edilir ve saflaştırılır. Saflaştırma üzerine, pigmentler, asidik metanol solüsyonları kullanılarak kelebek kanatları görünür renk ekstre uyarlanmış olan bir işlemde granüller elde edilir. 13 tarama elektron mikroskobu (SEM) ve spektrofotometri chromatophore pigmentler kullanarak başarılı şekilde ekstre onaylamak için kullanılan bu süreç.

Bu yöntem, C moleküler katılım keşfetmek için kullanılan chromatophore granüller izolasyonunu anlatmaktadıroloration Kafadanbacaklılarda içinde. Bütün hayvanlardan 12 Küçük molekül ekstraksiyon genellikle uzun ve sıkıcı bir süreç olabilir. Buradaki amaç Kafadanbacaklılarda içinde nanoyapılı granüllerden pigmentlerin edinimi için etkili ve kolay protokolün gelecek araştırmacıları bilgilendirmektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amerika Birleşik Devletleri'nde düzenlenmiş değildir, burada yapılan omurgasız hayvan çalışmaları; Bu nedenle Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, protokollerin incelenmesi için yetkisi yoktur. Bu ABD'de düzenlemenin yetki alanına giren değil yerine, yazarlar burada bu çalışmalar samimi etik kullanımı konusunda çaba, özen ve bu hayvanların tedavi, birey sayısı minimize edilmiş ve bu çabaların ile yapılmıştır devlet olduğunu Basel Bildirgesi ve Laboratuar Hayvan Uluslararası Bilim Konseyi (ICLAS) etik kurallarına uyum içindedir.

1. Doryteuthis pealeii (D pealeii) Diseksiyon

  1. Satın alma decapitated kalamar D. Woods Hole, MA Marine Biological Laboratory at Deniz Kaynakları Bölümü veya herhangi bir taze balık pazarından pealeii. yuvarlanabilir veya daha önce bu prosedürü uygulamak için değiştirilmiş olan örnekleri kullanmayın. Özellikle, kromatophore tabakası hala örnek üzerinde bozulmamış olmalıdır.
    1. Hayvanlar hemen kullanılmazsa, kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın. örnekleri defrost için, diseksiyon önce 1 saat boyunca oda sıcaklığında su koyun.
  2. hayvanın arka tarafı boyunca kesilmiş paslanmaz çelik düz ince nokta diseksiyon makas, kullanma. ventral manto üssünde başlayın ve yüzgeç bölgede biter.
  3. forseps diseksiyon ve diseksiyon makas kullanarak bağ dokusu kesilmesi ile kaldırarak iç organların (mide, solungaç, mürekkep bezi, üreme organları, sistemik kalp ve brakiyal kalp) tüm çıkarın. Bir örnek torbaya organları atın.
  4. Standart 11-1 / 2'de (fin tarafı) manto pin T-işaretçilerine diseksiyon kullan "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "esnek bir diseksiyon pedi içeren alüminyum diseksiyon tava. doku Batmak bir tek kullanımlık polistiren vakum filtrasyon sistemi ile filtre edilmiş deniz suyu 250 ml0.2 um gözenek boyutlarına ihtiva etmektedir.
  5. Dikkatle bozulmamış chromatophore içeren cilt tabakası tutarak, diseksiyon forseps ile epidermal deri tabakası (opak renk) çıkartın. epidermal tabaka kaldırıldıktan sonra, bir numune torbasına atın.
  6. forseps ve diseksiyon makas ile chromatophore tabakasının küçük (1 cm x 1 cm) bölümleri parçalara ayır. 1.5 ml mikro santrifüj tüplerine numune toplamak (disseke doku ile her boş tüpün yarısını doldurun).
  7. tüpler içeren dokuya süzülmüş deniz suyu 500 ul ekle. Numuneler 4 ° C'de gece boyunca saklanır.

2. Ayırma chromatophore Pigment Granül

  1. Doku sindirimi
    1. Papain / kolajenaz hazırlanması
      1. Kağıt tartmak kollajenaz 30 mg ve 4 "x 4" düşük azot kullanarak papain 5 mg tartın. bir vida kapaklı 50 ml'lik bir polipropilen santrifüj tüpü içine bu aktarın.
      2. deioniz 10 ml ölçünBir dereceli pipet kullanarak ed su. papain / kollajenaz içeren flakon doğrudan ekleyin. çözelti kadar yüksek ayarda Vortex açıktır.
    2. Hücre dışı Doku Çıkarma
      1. x g 5 dakika 14,000 Aşama 1.7 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın.
      2. P1000 değişken hacimli tek kanallı mikropipet kullanarak doku papain / kollajenaz çözüm 500 ul ekleyin. En yüksek ayarda 1-2 dakika boyunca her bir örnek Vortex.
      3. çevreleyen doku hücreleri ayırmak için 40 kHz'lik bir frekansta 5 dakika boyunca numune sonikasyon.
      4. 14.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın.
      5. x g 5 dakika 14,000 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın. bir kez daha tekrarlayın.
      6. El ile kalan geniş doku sn kaldırmakBir sonraki adıma geçmeden önce forseps ile bu süreçte sindirimi yoktu leri.
  2. Pigment granüller Yalıtımlı
    1. Homojenizasyon tamponu hazırlanması
      1. 2.38 g tartılır (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit) (HEPES, 100 mM), magnezyum klorür (10 mM), potasyum-aspartat 0.856 g (50 mM) 0.095 gr, 0.015 g ditiyotireitol (1 mM). bir vida kapaklı 150 ml'lik bir polistiren kap içine aktarın. Ticari bir küçük tablet proteaz önleyici.
      2. Bir dereceli silindir kullanarak, iyonu giderilmiş su, 100 ml ölçün. homojenizasyon tuzlar içeren kabın doğrudan ekleyin. çözelti kadar Vortex açıktır.
    2. Pigment Granül homojenizasyon
      1. 5 dakika boyunca 14.000 xg'de adım 2.1 her bir örnek santrifüj. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın. Bu örnek dışı doku geçersiz olmalıdır.
      2. Ekle 500# 181; 1-2 dakika her biri için her bir tüp ve vorteks homojenizasyon tamponu iyice örnekleri karıştırın. 30 dakika (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon ve 14,000 x g 'de santrifüj 5 dakika ile takip edin.
      3. Bir plastik atık kovaya supernatant atmak ve chromatophore sakkuluslar ve protein hayvan iplerini tam sindirim sağlamak için önceki adımı 2-3 kez tekrarlayın. Geri kalan çözelti, açık sarı bir süpernatan ve izole pigment granülleri içeren kırmızı renkli bir pelet içermelidir.

3. Pigment Ekstraksiyon

  1. Asidik metanol preparasyonu (HCl-MeOH)
    1. Dikkatle 5 ml metanol (MeOH) konsantre (36,5-38% (w / w)), hidroklorik asit (HCI) 25 ul ekle. bir vida kapaklı bir cam numune şişesine HCl-MeOH çözeltisi saklayın. eşit çözüm karıştırmak için hafifçe döndürün.
      NOT: Daha fazla asidik çözelti, daha pigment fi sırasında çıkartılacaktırilk çıkarma.
  2. Pigment Ekstraksiyon
    1. 14.000 xg'de 5 dakika boyunca (2.2.2) pigment granül süspansiyonu Santrifüj ve bir plastik atık kovaya süpernatant atın.
    2. HCl-MeOH çözeltisi 500 ul ilave edin ve 3-4 dakika ~ için her bir örnek girdap. 10 dakika boyunca (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon, daha sonra 14,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
    3. Bir transfer pipeti kullanarak, bir 1 dramlık vidalı kapaklı cam şişede supernatant toplamak. süpernatant rengi koyu kırmızı olmalıdır.
    4. başka bir renk (~ 4-5 yıkar) ekstre kadar çıkarma adımı 3.2.2 tekrarlayın.
      NOT: Her çıkarma ~ pigment 1.5 ml verecektir. Geri kalan renksiz bir pelet pigmenti ekstre granüller olup. Not: renksiz granül ve ekstre pigmentler iki sonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta su içinde saklanabilir.

Ekstraksiyon Süreci boyunca 4. Karakterizasyonu

  1. Tarama ElECTRON Mikroskopi
    1. ekstraksiyon işlemi saflığını doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak (adım 2.2.1 ve pigment ekstre adım 3.2.3 dan girmemiş) Görüntü granülleri.
    2. 14.000 xg'de 5 dakika boyunca görüntüleme, ilk santrifüj hem reaksiyona girmemiş granül ve pigment çıkarılan granüller granül örnekleri hazırlamak ve bir plastik atık kovaya süpernatant atmak için. 1 ml etanol ve mevduat bir transfer pipet kullanarak alüminyum SEM taslakları üzerine granül süspansiyonu 2-3 damla bu yeniden askıya.
    3. gece boyunca örnekleri kurutulduktan sonra 15 mil bir kaplama elde etmek 3 dakika için altın, platin kaplamalı kat püskürtmeyle çökeltilmesi.
    4. Bir Schottky verici ve bir ikincil elektron dedektörü ile bir SEM ile görüntü. 5-7 kV ışını gerilim ve görüntüye 8 ve 9 mm, bu malzemeler arasında bir çalışma mesafesi kullanın.
  2. Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) Spektrofotometrik Ölçümler
    1. absorbans pro Monitör200-800 nm bir çift ışın spektrofotometre kullanılarak 3 koşulları için dosyaları (2.2.2 girmemiş granül, 3.2.3 çıkarılan pigment ve 3.2.4 pigment çıkarılan granül).
    2. reaksiyona girmemiş granüller ve pigment ekstre granüller için 1 ml'lik bir küvete deiyonize su kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. Her iki numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumları toplayın.
    3. ekstre pigment için 1 ml'lik bir küvete asidik metanol çözeltisi kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumu toplayın.
    4. Soğurma tepe noktasının maksimum görece yüksekliğe ulaşır dalgaboyunu tanımlayarak Her numunenin maksimum bir dalga boyuna belirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatoforlar D. disseke edilir pealeii dorsal manto (Şekil 1A, 1B). Bunlar kaldırıldıktan sonra, kromatoforlar lize edildi ve pigment granülleri (Şekil 2A, 2B) üzerinden izole etmek için santrifüj ve yıkama döngüleri kullanılarak saflaştırılır. Asidik metanol solüsyonları (HCl-MeOH) çözülebilir pigment özü ve çözünmeyen, renksiz bir pigment ekstre granüller hasıl granüller (Şekil 2C) i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kalamar chromatophore granüllerden pigmentlerin elde etmek için bir yöntem gösterilmiştir. Özellikle granülleri hedefleyerek, hedefimiz adaptif renklenmeye aracılık rollerini tespit etmektir. Bu yöntem toplu doku örnekleri 14 veya dondurularak kurutulmuş bir cilt 15 kullanılarak cephalopod pigmentler karakterize etmek için tasarlanan önceki raporlarda farklıdır.

Bu protokol, chromatophore pigmentler ekstre etkili olsa da, küçük reaksiyon ölçekler ile sınırlıdır. Bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Üniversite Enstrümantasyon Merkezi de dahil olmak üzere New Hampshire Üniversitesi'ndeki tesislerin kullanımını minnetle kabul ederler. Bu çalışma New Hampshire Üniversitesi Kimya Bölümü tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KollajenazAlfa Aesar9001-12-1Tehlike yok
DithiothreitolSigma-Aldrich3482-12-3Tahriş edici, akut toksisite
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9Hafif tahriş edici
Hidroklorik asitEMD Kimyasalları7647-01-0Aşındırıcı
k-AspartatSigma-Aldrich1115-63-5Reaksiyona Girer oksidanlarla şiddetli
Magnezyum KlorürSigma-Aldrich7786-30-3Hafif gözü tahriş edici
MetanolPharmco-AAPER67-56-1Son derece yanıcı
Mini tablet prtoease inhibitörüSigma-Aldrich469315-90-01Metal ve cilt için aşındırıcı
PapainSigma-Aldrich9001-73-4Tahriş edici 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
  2. Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
  3. Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
  4. Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
  5. Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
  6. Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
  7. Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
  8. Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
  9. Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
  10. Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
  11. Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
  12. Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
  13. Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
  14. Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
  15. Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pigment EkstraksiyonuKromatofor Gran lleriAsidik MetanolSonikasyon Santrif gasyonuGran l zolasyonuSpektrofotometrik AnalizTaramal Elektron MikroskobuDoku DiseksiyonuPigment Verimi

İlgili makaleler