Enfarktüs Bölgesi Orta Arter Tıkanıklığı Tekniği ve Görselleştirme kullanma Fare İskemik İnme ve İskemi-reperfüzyon indüksiyon

Kardiyovasküler hastalık çalışması, felç gibi, in vivo modellerin kullanılması ile ilgilidir. iskemi, toksisite ve / veya tedavinin olası ima anlamak için, tedavi grupları arasındaki karşılaştırmalı incelemeler sağlayan hastalık, bir uygun standart, güvenilir ve yeniden üretilebilir bir modelini kullanmak için bir ihtiyaç vardır. Bu yazıda, transgenik fareler ve standardize değerlendirme modellerinin çok sayıda varlığı göz önüne alındığında, fareler kullanıyor. Deneysel iskemik inme ve aşağıdaki kurtarma aşağıdaki motor ve davranış açıkları değerlendirmek için puanlar yan ^{yatan, 2 1} geliştirilmiştir.

Birkaç iskemik inme modelleri, tam global serebral iskemi, eksik global iskemi, multifokal serebral iskemi ve fokal serebral iskemi gibi, mevcuttur. ikinci grup da hastalarda en sık inme kategorisidir. arifesinde çoğunluğunts veya orta serebral arter (MCA) yakınındaki embolik veya trombotik tıkanma oluşumunda tarafından başlatılmaktadır. Bu parametreler göz önüne alındığında, yakından sunulan model insan inme hastalığı etyolojisi taklit ve son derece alakalı ³ elde edilen sonuçları yapar. Bununla birlikte, insanlarda hastalık tedavisine hayvan modellerinde elde edilen bulgular için zor olduğu kanıtlanmıştır. Şimdiye kadar, trombolitik doku plazminojen aktivatörü, sadece kullanımı akut iskemik felç ⁴ tedavisi için onaylanmıştır.

Fare fokal serebral iskemi, posterior serebral dolaşım inme modeli ve serebral venöz tromboz modeli modelleri arasında uygulanabilirliğini azalan ve yapılabilir analizlerin aralığını kısıtlayan, son derece invaziv. Bununla birlikte, bu embolik modeli Fototromboz modeli, endotelin-1 kaynaklı inme modelinde ve lümen içi ameliyat dikiş ipliği, orta serebral arter oklüzyonu (M gibi diğer teknikler,CAO) modeli, bu sınırlamalar olarak kullanılmak için kullanılabilir. MCAO modeli bu protokolü açıklanan bir tekniktir. Bu hali hazırda uygulandı ve yüksek verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir, fokal serebral iskemi uyarılması için güvenilir bir yöntem sunar. Bu modelde, yani Zea-Longa ve Koizumi yöntemlerine iki yaklaşım vardır. Onlar tıkanıklığı sütür damarsal takılı şekilde biraz farklıdır. Zea-Longa teknikte, dikiş eksternal karotid arter ⁵ üzerinden sokulur. Burada sunulan teknik, tıkayıcı ameliyat dikiş ipliği karotis arter ⁶ üzerinden sokulduğu Koizumi yöntemi değiştirilir.

MCAO modeli başarıyla iskemik inme sırasında meydana gelen farklı etkinlikler değerlendirmek için uygulanmıştır. reperfüzyonu takiben beyin ödemi, kan-beyin bariyerinin bozulması ile birlikte görülmektedir. Tepe nöronal ölüm genellikle 24 saatte görülmektedir; Bununla birlikte, bu yeniden7 gün ⁷ sonra bazal düzeylere döner. İnsanlarda, cinsiyet ve yaş inme sonucu belirlenirken, bu da fareler ve sıçanlar ^{8, 9, 10} görülmektedir önemli değişkenlerdir. Birkaç yayın, tedavi ^{etkinliği, 11, 12, 13, 14} göstermek için MCAO-modelindeki kullandık.

Tüm işlemler Sağlık (NIH) kurallar National Institutes uyarınca Miami Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Steril ekipman ve aseptik teknikler kullanılması gerekmektedir.

1. Oklüzyon Sütür Hazırlanması

1. 25 g ile 25 arasında fareler için 0.23 mm - - vücut ağırlığı 35 g, 20 ila fareler için 0.21 mm çapında bir dikiş kullanın. MCAO prosedürü için dikiş tipi seçimi, hayvan ağırlığına bağlıdır.
2. Bir gümüş kalem kullanarak, silikon kaplı ucundan başlayarak 9 mm dikiş işaretleyin. Bu ekleme uzunluğu için bir rehber olarak hizmet edecektir.

Cerrahi 2. Hazırlık

1. Bir laboratuvar anestezi sistemi kullanılarak, oksijen ile karışık izofluran ile fare anestezisi. Ticari makinede 2'de 5 ve oksijen akışını ayarlama izofluran kullanın (Malzeme Tablosu bakınız). surger hayvan aktarıny yüzeyi ve bir burun konisi kullanılarak anestezi sürdürmek (1.5 ayarı kullanım izofluran - 2 2.5 ve oksijen akışını).
   1. saniyede 2 solunum nefes nefese kalmadan - fare solunum hızı yaklaşık 1 olduğundan emin olun. Buna ek olarak, hayvan bıyıkları stimülasyon reaksiyonu ve pedal refleks (ayak tutam) gösteren değil emin olun. Ameliyat sırasında en az her 5 dk solunum hızı ve çaba izleyin.
2. İşlem sırasında kurumasını önlemek için steril bir bez kullanarak her göze göz kayganlaştırıcı bir damla koyun. Seçenek olarak ise, steril bir farmasötik borusundan göze oftalmik merhem uygulanır.
3. Sırtında hayvan çevirmek ve kesi alanı tıraş. Daha sonra, iyice% 70 Klorheksidin ardından etanol, ve% 70 etanol ile son bez kullanarak cerrahi alan dezenfekte. Bir stereomikroskop altında sıcak cerrahi bir yüzeye hayvan yerleştirin.

3. Ortak Karotis Arter diseksiyonu ve İç / External dallanma

1. (- 4 cm yaklaşık 3) cerrahi makas ve forseps kullanarak, çene altına kadar göğüs kemiği yukarıdan, boyun sığ bir ensizyon gerçekleştirin. Cerrahi örtü steril olmayan yüzeylerle temas etmesini önlemek için araçlar cerrahi alanı çevresinde yerleştirilmelidir. cerrahi drape filme yardımcı olmak için geçerli video ihmal edilmiştir.
2. forseps dikkatle ayrı yağlı ve bağ dokusu kullanılarak trakea ortaya çıkarmak. Doku kolayca ve doğal olarak her iki taraf için ayrı olmalıdır.
3. ayrıca ameliyat için bölgeyi açığa boyun uzatmak için farelerin ensesine bir yastık (yuvarlak nesneyi, çapı yaklaşık 0.5 cm) yerleştirin.
4. Bir doku retraktörü veya kanca kullanarak kesi açın.
5. trakea hayvanın sol tarafında dikkatle sol karotis arter (CCA) açığa çıkarmak için bağ dokusu ayrı tweeze. CCA ile birlikte sinirler ve büyük damarları zarar vermemek için dikkatli olun.
6. Altta yatan dokudan ayırmak için dikkatli olmak, CCA açığa devam edin ve iç serebral arter (ICA) ve dış serebral arter (ECA) dallanma top "Y" maruz kalmaktadır. CCA ayrılmakta yardımcı olmak için, bağ dokusu delmek için CCA altında kavisli bir forseps yerleştirin ve sonra yavaş yavaş onları açmak için izin verir.

MCAO Dikiş Ekleme için CCA 4. hazırlanması

1. CCA altında uzunluğu yaklaşık 4 cm, naylon sütür 3 segmenti yerleştirin. Bu büyük ölçüde sütür ekleme karmaşık hale getireceği olarak CCA bükülmüş olmadığından emin olun.
2. en alçak noktası mümkünse, kalıcı bir düğüm kullanarak alt dikiş kapatın.
3. sadece ICA altında üst dikiş kravat / ECA çıkarılabilir kayma düğüm kullanarak dallanma.
4. Çıkarılabilir kayma düğüm kullanarak orta dikiş kravat, ama geniş açık tutmak. dikiş ekleme engel değil gibi bol bırakmak için önemlidir.
5. mikrodiseksiyon bahar sci kullanarakssors, alt ve orta dikiş arasında CCA bir kesi yapmak. alt sütür yakın 0.2 mm kesi gerçekleştirin.

5. Orta Serebral Arter Tıkanıklığı

1. forseps kullanarak, üstüne o kadar yol gösterici, CCA kesi içine MCAO dikiş yerleştirin. CCA açılış pıhtılaşmayı ve kapanış önlemek için adım 4.5 sonra hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin. dikiş ekleme bloke edilmesi halinde, kesi yeniden açmak için forseps ipuçlarını kullanın.
2. Yavaşça etrafında kan akışını kısıtlamak için bir kayma düğüm kullanarak MCAO sütür silikon parçası üzerinde orta dikiş kravat aşağı, ama serbestçe hareket etmesine izin verecek kadar gevşek.
3. Dikkatle MCAO dikiş dışarı kayma yok emin olun, üst dikiş geri.
4. milimetrelik bir çift tarafından ICA MCAO sütür yerleştirin ve adım 5.2'de tarif edildiği gibi aynı şekilde, üst dikiş tekrar kapama.
5. tıkanma alana MCAO dikiş Kılavuzu. Başarılı ekleme göstergesidirGümüş 9 mm işareti CCA kesi kan geri akışının düşük miktarda ve belirgin CCA insizyon ve ICA / ECA çatallanma arasında yer almaktadır. Başarılı bir oklüzyon başka bir onay da, böyle bir lazer Doppler kan akışı izleme sistemi ^{15, 16} ve izleme yöntemleri kullanılarak elde edilebilir.
   NOT: tıkalı alan tarafında orta beyin bölgesinde kan akışının% 90 bir damla başarılı tıkanıklığı gösterir.
6. Başarılı oklüzyon sonra sıkıca orta ve üst dikiş aşağı kravat. sahte ekleme yapmadan Eğer dikişler tekrar kapama yerine hemen 7.3 adıma geçin yok.

6. Kesi Kapanış ve Post-operatif Bakım

1. kesi alanı içine dikişler sokmak.
2. toplayıcı veya doku kanca ve yastık çıkarın.
3. steril tuzlu su ve bir pamuklu çubuk kullanarak temizleyin dikiş alanı.
4. naylon sütür / iğne ve forseps kullanarak kesi kapatın.
<li> yönetme anti-inflamatuar (örneğin, karprofen, 10 mg / kg, sc) ve analjezik (örneğin, Buprenorfin, 0.1 mg / kg sc, günde iki kez) ilaçlar, ameliyat sonrası rahatsızlığı azaltmak için. hipotermi önlemek ve su ve yumuşatılmış gıda reklam labium erişim sağlamak için ısıtılmış bir pad üzerinde yerleştirilen bir kafes fareler yerleştirin.
5. (- 10 dk 5) ve inme belirtileri hayvanların kurtarma izleyin. Onlar hafif yanal felç değişir ve karşı kanadını ve haddeleme şiddetli kasılması çizerek yapabilirsiniz. Çeşitli değerlendirme noktaları tartışma listelenir. solunum sıkıntısı veya şiddetli nöbetler belirtisi sergileyen hayvanlar ötenazi edilmelidir.
6. iskemi reperfüzyon protokolüne bağlı olarak, 120 dakika veya daha fazla, 30 dakika arasında yer MCAO dikiş bırakın. tıkanma süresini azaltmak mortalite önler.
7. Kalıcı tıkanıklığı, ancak önemli mortalite oranı beklenebilir, 24 saat yerinde MCAO sütür bırakın. Bu süre geçtikten sonra, STE geçins 7.
   1. Kalıcı oklüzyon modeli kullanıyorsanız, son noktasına kadar kafeste fareler tutmak. O zaman, (7.8 7.1 adımlar) dikiş çıkarın. Bu prosedür, aynı zamanda kurban edildikten sonra gerçekleştirilebilir.

7. reperfüzyon

1. (2.1 yönergeleri izleyin) tekrar hayvan anestezisi ve yara kapama sütür kaldırın.
2. forseps ve doku ayırıcılar, kesi yeniden açın ve CCA maruz kullanma.
3. Dikkatli bir şekilde üst dikiş kaldırmak ve silikon kaplı bölümü orta düğüm bulunmaktadır kadar yavaşça MCAO sütür çekin.
4. (Bir kayma düğüm olmak zorunda değildir) sütür geçiş akan kan önlemek için sütür üst düğüm yineler.
5. Dikkatle orta düğüm geri almak ve üst düğüm geçmiş dikiş çekin, ama CCA içinde tutun.
6. Sıkıca arter kan akımını engellemek için üst düğüm kapatın.
7. tamamen MCAO dikiş çekin ve sıkıca orta düğüm kapatın.
8. MCAO dikiş olabilirdefalarca yeniden kullanılabilir. Her kullanımdan sonra, steril bir gazlı bez ile kirletici madde (örneğin, kan veya doku) çıkarmak için% 70 etanol içinde dikkatli bir şekilde dikiş temizleyin. Daha sonra, bir sterilizasyon kese içinde sütür koyun ve sterilize.
9. 6.4 ve hayvan ayilmanizi - Tekrar 6.1 adımları.

8. Doku Analizi

1. Atım volümü izlemek beynini incelemek için.
   1. iki adımlı bir işlem kullanılarak fare Euthanize. İlk olarak, durur nefes kadar izofluran aşırı dozda hayvan maruz bırakmaktadır. TTC boyama, hemen fare başını kesmek ve beyin çıkarımı geçin. Kesit beyin (immün analizleri, örneğin, için), baş kesme öncesinde kalp ponksiyonu ile perfüzyon gerçekleştirin.
   2. Kafatasının dibinde kafa kesti ve gözler arasında kadar kafatasının üst boyun açıklığından saç derisini kesti. kafatası maruz ile, kafa tabanı açıklığından başlayarak her iki yanı boyunca kemik kesmegöz çukurlarının kadar. Kafatasının geniş kısmı boyunca bu kesim olun. beyin zarar görmesini önlemek için makas ile çok derin ulaşmak için dikkatli olun.
   3. Daha sonra, iki göz çukurları arasındaki kemiği kesti.
2. forseps kullanarak, beyin ortaya çıkarmak için kafatasının üst yukarı kaldırın. Sadece küçük bir direnç olmalıdır. kolayca kaldırmak etmezse, kafatası kesiler eksik olabilir. nazikçe künt kavisli bir forseps kullanarak beyin dışarı kaldırın. Beyin hala birkaç sinirler tarafından takılı olabilir. Yol boyunca ekleri kaldırarak, yavaş yavaş devam edin.
3. , 1 mm beyin matris içinde taze beyin yerleştirin PBS birkaç damla ekleyin ve jilet veya kriyostat bıçak kullanarak matrisin boyunca dilim.
4. 100 mm çanak beyin transferi ve çanağın alt kapak boyama çözeltisi (% 2 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür [TTC] PBS içinde çözülmüş) ilave edilir. İki forseps kullanarak, ayrı tüm beyin dilimleri (ön aşağı bakan) ve çanak alt sırayla koyun.
   NOT: Boyama cansız doku beyaz kalan kırmızı canlı doku, dönecek. 37 ° C'ye kadar bir çözüm Isıtma boyama hızlandıracaktır. inme alanı (beyaz) belirtileri 90 dakika sonrası inme olduğunca çabuk görülür ve fazla 7 gün boyunca görünür kalmasını olabilir. Görüntüleme atım hacmi hesaplama izin veren bir cetvel ile birlikte yapılmalıdır.
5. Kesit için işlem kesilir beyinleri, immüno-boyama, protein izolasyon veya diğer işlemleri ^17, çeşitli ^{18, 19.}

Oklüzyon dikiş için yerleştirme yolu Şekil 1 'de gösterilmiştir. MCAO sütür ICA çatallanan, tıkanma alanına yönlendirilmesi gerekmektedir. MCA Başarılı tıkanma TTC boyama ile görünür doku yaralanması, yol açacaktır. Şekil 2, (90 dakika veya 24 saat sonra-oklüzyonu, Şekil 2B de boyama) plasebo tedavi gören bir hayvandan (Şekil 2A) ve 60 dakika MCAO iskemi reperfüzyon hayvandan gelen lekelenme görüntüler sunar. strok hacmini belirlemek için, öncelikle karşı taraf toplam alanından ipsilateral tarafta olmayan infarkt alanını çıkarılarak, cetvel görüntüleme prosedürüne dahil kullanarak, her bölüm için inme alanı hesaplamak. Bu hesaplama ticari yazılım veya açık kaynak yazılımı kullanılarak yapılabilir. Daha sonra, slaytlar 1 mm kalınlığında olduğu her dilim dikkate alınarak için strok hacmini hesaplamak ve fo inme hacimleri toplamıtüm dilimleri r. Bu prosedür daha sonra farklı hayvan grupları ve tedaviler arasında karşılaştırılabilir Her bir hayvan için toplam strok hacmi sağlar. Ortalama olarak, 60 dakika oklüzyon 15 haftalık vahşi tür işlenmemiş C57BL / 6J fareler, yaklaşık 21 ± 3 mm3 bir hareket hacminde reperfüzyon sonuçları 23 saat eklenmiştir.

Vuruş hacmi araştıran ilave olarak, immünofloresan astrogliyozun nöronal hasar (Şekil 3A) ya da glial fibriler asidik protein (GFAP) için bu tür mikrotübüle bağlı protein-2 (MAP2) halinde hedef, çok sayıda (Şekil 3B) için gerçekleştirilebilir. Bu tür analizler ayrıca inme ilerlemesi ve kurtarma analizinin yanı sıra inme doku hasarı ve onarımı dahil diğer işlemler etkinleştirin.

Şekil 1: Rong> Beyin Arter Fizyoloji şematik gösterimi. tıkanma alanına karotid arter (CCA) adlı MCAO ekleme gelirlerinin Rota mavi belirtti. (:;: Orta sütür; BS: Alt sütür MS Üst sütür TS) cerrahi alanı şekil (Oval şekil) ve sütür yerleştirme dibinde yer almaktadır siyah çizgiler ile gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Beyin Bölümlerinin TTC Boyama. Üst panel sahte ekleme aşağıdaki tipik boyama temsil etmektedir. Orta ve alt paneller 90 dakika ya da 24 saatlik bir reperfüzyon takip 60 dakikalık MCAO sonra elde edildi. Ölçek çubuğu 1 mm'dir.

3 "src =" / files / ftp_upload / 54805 / 54805fig3.jpg "/>
Şekil 3: Stroke sonrasında Fare Beyin İmmünofloresan Boyama. 60 dakikalık bir oklüzyonundan sonra, beyinleri, 23 saat boyunca reperfüzyon toplanmış ve cryosectioning işlenmiştir. MAP2'nin (üst) ve GFAP (alt) antikorlar kullanılarak, doku nöronal hasar ve astroglyosis plasebo (sol panel) ya da 90 dakika iskemi-reperfüzyon beyinleri (sağ panel) için analiz edildi. sunulan resimler 10X objektif kullanılarak konfokal mikroskobu ile çekilen çoklu görüntülerden birleştirilir. Ölçek çubuğu 1 mm'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

İskemi İnme sonrasında Fare Durumu ve nörolojik bozukluk Değerlendirilmesi Tablo 1. Ölçek. 2, 1 uyarlanmıştır.

Yazarların herhangi bir rekabeti veya çıkar çatışması yoktur.