Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize Drosophila

beklenen yaşam süresinin artmasıyla birlikte, Alzheimer veya Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklar genel nüfus için artan bir sağlık tehdidi haline gelmiştir. Ulusal Sağlık Enstitüleri göre, 115 milyon insan, dünya çapında, altta yatan önemli bir ilerleme birçoğu için, bu hastalıkların en azından bazı rol oynayan genleri ve risk faktörlerini tanımlamada yapılmış olmasına rağmen 2050 yılında bunama etkilenecek tahmin edilmektedir moleküler mekanizmalar hala bilinmeyen ya da iyi anlaşılmış bulunmaktadır.

Caenorhabditis elegans ve Drosophila melanogaster gibi basit omurgasız model organizma kısa bir yaşam döngüsü, döl çok sayıda ve köklü ve bazen de eşsiz genetik ve moleküler yöntemlerin ¹ kullanılabilirliği de dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları incelemek için deneysel avantajlar sunuyoruz ^-12. Ayrıca, bu organizmaların tarafsız mükellef bulunmaktadırnörodejeneratif fenotipleri üzerine ağırlaştırıcı veya iyileştirmede etkileri ile bu hastalıklara katkıda bulunan faktörleri belirleyebilir etkileşim ekranlar.

Böyle genetik etkileşimleri analiz ve yaşlanma etkilerini değerlendiren nörodejenerasyonu tespit etmek ve şiddetini ölçmek için nicel protokolleri gerektirir. Sayısal performans değeri ^13-21 sağlamak gibi koku öğrenme, olumsuz geotaxis, ya da hızlı phototaxis olarak Drosophila davranış yönlerini, ölçerken Bu değerlendirme nispeten kolayca yapılabilir. Nöronlarının sayılması ile nöronal hayatta kalma etkileri belirlemek de mümkündür. PD etkilendiğini ve o zaman bile, sonuçları ^22-24 tartışmalı olmuştur dopaminerjik nöronlar gibi, açıkça tanımlanabilir belirli bir nüfus odaklanarak Ancak, bu mümkündür.

Burada açıklanan protokol parafin seri bölümleri gerçekleştirmek için yaka yöntemini kullanan bir yöntemBu aslında Drosophila ²⁵ anatomik beyin mutantlar tecrit etmek için kullanılan Heisenberg ve Böhl, tarafından geliştirilmiştir. Yaka yönteminin kullanımı, daha sonra cryosections, vibratome bölümleri, ve plastik bölümlerin ^26-28 de dahil olmak üzere, adapte edilmiştir. Burada, bu yöntem, daha sonra nörodejeneratif fenotipleri ^16,21,29-32 olan sinekler gelişen hücre arası boşluklar ölçmek için kullanılabilir, tüm uçucu kafası seri bölümleri elde etmek için kullanılır. Bu ölçümler belirli beyin bölgelerinde yapılabilir ya da tüm beyin kapağı olabilir; İkinci yaklaşım yaşlanma sırasında gözlemlediği gibi biri bile zayıf dejeneratif fenotipleri tanımlamak için izin verir. yaka kullanıldığında, son olarak, 20 sinekler olan bir preparasyon olarak işlenebilir, sadece daha az zaman alan, ancak, aynı zamanda hafif değişikliklere eserler minimize, kumanda aynı hazırlanmasında deney sinekler analiz sağlar hazırlık.

1. tasmalar üzerinde Başkanı Tespit ve Parafin katıştırma

Not: tespite tüm adımları, bir çeker ocak içinde yapılmalıdır. sağlık riski olduğu halde değil ise metilbenzoat, bir çeker ocak içinde ele takdirde çok zor olabilir, son derece belirgin bir koku vardır.

1. sinekler anestezi önce, 15 ml kloroform ve% 99 etanol, 30 mL glasiyel asetik asit (5 mi kloroform ve asetik asit karışmaz) eklenerek Carnoy çözeltisi 50 mL oluşturur. yaka düz koymak ve tamamen çözelti ile kaplıdır emin olmak için, böyle bir kristalleştirme tabak gibi düz alt, bir cam kap içinde dökün.
2. CO ₂ veya eter ile sinek anestezisi.
3. forseps kullanarak yaka içine boyunlarına Konu sinekler (yukarı çoğu yaka 20). Şekil 1A görüldüğü gibi, aynı yönde başkanları tüm hizalayın ve herhangi bir hasar ya da kafasına gözlerine meydana sağlamak için nazik olmayı unutmayın.
4. Sinekler sırası kolayca bölümleri tespit edilebilir, böylece herhangi bir konumda olmazsa oculis sinekler (oklar, Şekil 1A) içerir. Deneysel sinekler hafif ya da beyaz göz rengi varsa ek olarak, bu tür vahşi türü olarak bazı kırmızı gözlü sinekler, iplik aralarında yeterli pigment slayt leke mevcut olduğundan emin olmak için. Birden fazla yaka kullanıyorsanız yaka numarası ile birlikte bir protokol kağıda sinekler sırasını kaydedin.
5. 4 saat - yaka tamamlandıktan sonra, 3.5 için hazırlanan Carnoy çözeltisi içine koyun.
6. Uygun bertaraf kabına Carnoy çözüm dökümü ve etanol yıkar başlar. kapta yaka yerleşimini rahatsız etmeyecek şekilde yavaşça dökün emin olun.
7. iki kez% 99 etanol içinde 30 dakika boyunca halkalar yıkayın.
8. 1 saat boyunca% 100 etanol içinde yaka yıkayın. overdehydration önlemek için zamanında yıkar değiştirmek emin olun.
9. metilbenzoat içinde yaka koyunO / oda sıcaklığında N. metilbenzoat buharlaşmasını önlemek için parafilm kabı mühür.
10. davlumbaz uygun tek kullanımlık kap içine methylbenozate dökün. (- 57 ° C 56) parafın balmumu ve metilbenzoat 1 düşük erime noktası: 1, daha önceden hazırlanmış karışımı ekleyin. Bu noktadan itibaren, yaka parafın sertleşmesine olmadığından emin olmak için, 65 ° C'de bir kuluçka tutulması gerekir.
11. Uygun tek kap içine methylbenozate parafin karışımı üzerinden dökün ve erimiş saf parafin dökün, bilezik üzerine, 65 ° C'de tutuldu.
12. 30 dakika sonra parafin değiştirin ve bu en az 5 kez tekrarlayın. en az 6-8 yıkama yapılmalıdır.
13. yıkar tamamlandıktan sonra, yaklaşık yuvalara yaka boyutu ile bir lastik buz küpü tepsiye yaka yerleştirin. tamamen kapalı kadar onlar üzerinde erimiş parafin dökün ve O sertleşmesini sağlayan / N (hava kabarcıklarını önlemek için deneyin).
14. parafin blokları contai kaldırning buz küpü tepsisinden yaka. yavaşça yaka kopması, bir jilet kullanarak yaka parafin blok ayırın. organları yaka kalacak ise kafaları parafin blok olacak. blok, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
15. yakaları temizlemek için, hafif fırçalama ile temiz parafin, kaldırmak ve tekrar kullanmadan önce etanol içinde yıkamak için 65 ° C'de deparafinization ajan onları ıslatın.

2. Kesit ve Montaj

1. 50 ° C'ye kadar bir ısıtma plakası ısıtın. plaka üzerinde nesne tutucular (ya da metal montaj blokları) ve jilet yerleştirin ve onları ısınmasına izin verin.
2. kesit için istenen yönde bağlı olarak, parafin (yatay bölümler için) tarafına doğru başkanları ile ya blok veya (kısaca temas tarafında blok erime) ısıtılmış montaj bloğuna (frontal kesitler için) yukarı bakacak ekleyin. ısıtma plakası blok çıkarın ve en az 10 mil soğumasını bekleyinn, parafın montaj bloğu üzerine bir sızdırmazlık için yeterli sertleştirilmiş olduğundan emin olmak için. engebeler bilmek mümkün olduğu kadar bloğun yüzeyi ile paralel yerleştirilmiş kafalarının satır tutun.
3. Bir jilet alın ve gömülü başları sadece küçük bir satır kalacak şekilde uzak sinek kafaları aşırı parafin Döşeme (jilet daha kolay düzeltme için ısındı olabilir). parafin (kesit sırasında yapılabilir fazla kırpma) kesit sırasında sonu yok ki çok fazla süs için değil emin olun.
4. mikrotom amacı tutucu içine yerleştirme bloğu yerleştirin ve kafaları sırasının hizalama kanadın kenarı mümkün olduğu kadar paralel olduğundan emin olun.
5. poli-L-Lizin (PLL) solüsyonu ince bir tabaka ile kaplayarak mikroskop slaytlar hazırlayın ve 5 dakika boyunca kurumaya bırakın. kısa bir süre önce kullandığınız su ile bunları kapatın.
6. 7 mikron bölümleri kesmek ve su üzerinde yüzen slayt bölümlerin şerit aktarın. <br /> Not: Yatay bölümler için tüm beyin elde etmek için, biz baş tamamen kesilene kadar (beyine burnumun kesme) göz içine kesmek için başlarken gelen kurdele toplamak. Birden fazla slayt tüm kafa için gerekli olabilir.
7. 37 ° C'de bir ısı plakasında slayt yerleştirin ve şerit 1 dakika için genişletilmesine izin verir.
8. (Kapalı dökme veya doku kullanılarak) aşırı su çıkarmak ve slaytlar O / N kurutun.
9. Bir deparafinization ajan (tamamen bölümlerini kapsayan) ile dolu uzun boylu, dik slayt boyama kavanoz slaytlar yerleştirerek slayt parafin çıkarın. 60 dakika - her 30 dakika 3 yıkar gerçekleştirin.
10. Nihai yıkama slayt çıkarın. slayt üzerine gömme medya 2 damla koyun ve büyük bir lamel ile örtün.

3. Bölümler Fotoğrafçılık ve Analizi

1. 2 d - Hazırlanan slaytlar 1 kurumasını bekleyin. Sonra, bir floresan Microsc bunları incelemekmavi ışık altında ope.
2. Sineklerin yönünü belirlemek ve belirli bir bölge üzerinde odaklanarak, eğer ilgi bölgeyi bulmak için daha düşük bir büyütme kullanın.
   NOT: sws sinekler (Şekil 2) için, biz büyük komissürü içeren bölümünü bulun ve (genellikle 40X büyütme) bir görüntü alır. (Şekil 3'te olduğu gibi), tüm beyin analiz ederken, bir kafa tüm bölümleri ilerlemek ve en ağır fenotip veya vakuoller göstermek tüm bölümleri ile bölüm fotoğraf ya.
3. Bir çift-kör analizi için, almak ve sayı görüntüleri genotipi bilmeden ve daha sonra onları tanımlamak için üst üste yaka numarasını ve başın pozisyonunu kaydedin.
4. görüntüler alınmıştır sonra bir görüntüleme yazılımı kullanarak bunları analiz eder.
5. Bölüm başına veya başına vakuol sayısını. , Vakuol boyutunu ölçmek bir yazılım programında görüntüleri açın ve çok bir seçim ile vakuoller seçmek içinl. Seçilen vakuoller piksellerin miktarını belirlemek.
6. Um ² dönüşüm için, fotoğraf elde etmek için kullanılan büyütme bir sahne mikrometre kalibrasyonu slayt fotoğraf çekmek. Dönüşüm faktörünü hesaplamak için 100 um ² piksel miktarını belirler.
7. Yukarıdaki adımda hesaplanan dönüşüm faktörü ile piksel sayısına bölünmesiyle mikron ² içine toplam piksel sayısını dönüştürün.

Tüm sinek kafasını kapsayacak göz pigmenti 33 ile boyanan seri bölümlerde açıklanan yöntem sonuçları kullanarak. Bunun bir kısmı tek bir kafa bölümleri üstten alta gösterilir Şekil 1B, 'de gösterilmiştir. Farklı sineklerden bölümleri bu örnekte soldan sağa görülür. Yönlendirme ve sineklerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, bir gözsüz sinek (sinüs oculis) konumuna 3 (ok, Şekil 1B) bir belirteç olarak eklenir.

nörodejenerasyonu ölçmek için, bu bölümler tespit edilebilir vaküol oluşumunu ölçer. Vakuoller yuvarlak olarak tanımlandığı gibidir, yeşil flüoresan nöropil olan (Şekil 2'de ok işaretleri ve 3) ya da korteks ve karanlık noktalar uçucu beynin en az 2 üst üste bölümlerde görebilir. tarafından nörodejenerasyon nicelölçme Vakuollerin ya belli bir beyin bölgesinde odaklanarak ya da tüm beyin analiz yapılabilir. Beynin belirli bir bölgeye analiz sınırlayan bir mutasyon sadece mutant 34 olk futsch 'koku loblar gibi, belirli bir bölgeyi etkileyen durumlarda yararlıdır, ancak tüm veya birçok şiddetli dejenerasyon olduğunda da kullanılabilir beyin bölgeleri. İkinci bir örnek tüm vakuoller ölçüm çok zaman alıcı olacaktır İsviçre peyniri (sws) mutant (Şekil 2) 'dir. Bu nedenle ölçümlerin her zaman aynı seviyede yapıldı sağlamak için, tek bir görüntü aldı ve biz sadece bir ya da iki bölüm halinde bulunan büyük bir komissür (gc, Şekil 2A), düzeyinde tüm görüntüleri aldı. Biz (veriler gösterilmemiştir) 1-günlük SWS '1 sinekler vakuol oluşumu tespit etmedi Oysa, bir kayıp fonksiyon-alel 35, bazı vakuoller saptanabilir i vardın 7 gün yaşlı SWS '1 sinekler (ok başları, Şekil 2A). 14 d (Şekil 2B) ve 21 d (Şekil 2C) sinekler Yaşlanma daha da ilerici niteliğini gösteren bu fenotip arttı. tarif edilen yöntem kullanılarak deutocerebral nöropil (DN) vakuoller sayısını sayma yaş vaküol sayısında belirgin bir artış olduğunu teyit etmiştir. Ayrıca, vakuollerde kapsadığı kombine alan önemli ölçüde (Şekil 2D) yaşlanma ile artmıştır.

Bununla birlikte, tüm mutantlar SWS gibi ciddi bir fenotip göstermektedir, ve bu durumda, dejenerasyon farklılıklar küçük bir alanda odaklanarak belirlemek zordur. Benzer şekilde, yaşlanma sırasında meydana dejenerasyon (Şekil 3A - C) oldukça hafiftir ve bu fenotip miktarının bu nedenle, biz tüm beyin analiz. ortaya beyinde tüm vakuollerinin toplamını belirlenmesiBu vakuol (Şekil 3D) kombine alan ölçerken önemli bir yaş artışı ve bu da böyleydi.

1. Parafin Seri Bölümler rakam. A) tasma yöntemi kullanılarak, deney ve kontrol sinekleri bir yaka üzerine onları geçirilerek tek bir örnek olarak işlenebilir. Gözsüz sinüs oculis sinekler oryantasyon (oklar) için eklenir. Yaka sinek kafaları yönünü gösteren B) şematik. C) Bu görüntüde, farklı sinek başlardan bölümleri slayt üzerinde soldan sağa yönlendirilmiş edilir. slayt üzerinde üstten alta bakıldığında, aynı uçucu baş kısmında seri kesitler görülebilir. Bu durumda, bir sinüs oculis uçucu pozisyonda üç (ok) yerleştirildi. bölümler üzerinde yıkar floresan göz pigmenti tarafından boyanan kesim sonrası bölümleri. A = 5 mm ve C = 0.5 mm 'deki ölçek çizgisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Swiss-peynir Mutant 2. Aşamalı nörodejenerasyonu Şekil. 7-gün-(A), 14-gün-(B) ve 21-gün-(C) eski SWS '1 sinekler gelen Parafin baş bölümü. ok uçları yaşlanma ile geliştirdiğimiz vakuollerde işaret. Yaşa bağlı dejenerasyon vakuol sayısının sayılması ve kombine alana (D) ölçülmesi ile ölçülür. SEM ve analiz sineklerin sayısı belirtilir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. *** P <0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. Nörodejenerasyon yaşla birlikte oluşur. 10-gün-(A), 30-gün-(B) ve 60-gün-(C), vahşi tür sinekler Parafin kafa bölümü. ok uçları yaşlı sinekler geliştirdik vakuollerde işaret. Yaşa bağlı dejenerasyon vakuol sayısının sayılması ve kombine alana (D) ölçülmesi ile ölçülür. SEM ve analiz sineklerin sayısı belirtilir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. *** P <0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ A>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.