Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Biyofilm Kaldırma azotla temizleme karbon dioksiti aerosollerle

6.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54827

⸱

6 Kasım 2016

 , 
1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)

Bu makalede

Özet

Yüzeylerdeki biyofilmler, nitrojen tahliyesi olmadan periyodik bir karbondioksit aerosol jeti kullanılarak etkili ve hızlı bir şekilde çıkarılabilir.

Özet

Biyofilmler birçok uygulamada ciddi endişelere neden olabilir. Sadece ekonomik kayıplara neden olmakla kalmaz, aynı zamanda halk sağlığı tehlikesi de oluşturabilirler. Bu nedenle, biyofilmlerin yüzeylerden uzaklaştırılması oldukça arzu edilir. CO2 aerosol temizliği ile ilgili birçok çalışma, temizlik sırasında oluşan nem yoğunlaşmasını azaltarak biyofilm giderme verimliliğini artırmak için nitrojen tahliyeleri kullanmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmada, cilalı paslanmaz çelik yüzeylerden Pseudomonas putida biyofilmlerini çıkarmak için nitrojen tahliyeleri olmayan periyodik CO 2 aerosol jetleri kullanılmıştır. CO2 aerosolleri, katı ve gaz halindeki CO2 karışımlarıdır ve yüksek basınçlı CO2 gazı bir nozuldan adyabatik olarak genişletildiğinde üretilir. Bu yüksek hızlı aerosoller, 24 saat boyunca büyütülmüş bir biyofilme uygulandı. Uzaklaştırma etkinliği %90.36 ile %98.29 arasında değişmekte olup, tedavi süresi 16 saniye ile 88 saniye arasında değiştiği için biyofilmin floresan yoğunluğu ölçülerek değerlendirilmiştir. Ayrıca, nitrojen tahliyeleri olan ve olmayan uzaklaştırma verimliliklerini karşılaştırmak için deneyler yaptık; Ölçülen biyofilm giderme etkinlikleri birbirinden anlamlı olarak farklı değildi (t-testi, p > 0.55). Bu nedenle, bu teknik, biyolojik olarak kontamine olmuş çeşitli yüzeyleri bir dakika içinde temizlemek için kullanılabilir.

Giriş

Biyofilmler, bakteri hücrelerinin hücre dışı polimerik maddelerin kendi ürettiği matrisler içine gömüldüğü, bir arada tutulduğu ve dış ortamdan korunduğu karmaşık bakteri topluluğu yapılarıdır. Biyofilmler, tıbbi implant malzemeleri ve cihazları, gıda işleme ekipmanları ve ısı eşanjörleri dahil olmak üzere çeşitli yüzeylerde oluşabildikleri için halk sağlığı riski oluşturabilir ve ekonomik kayıplara neden olabilir. Aslında, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine göre, biyofilmlerin insanlardaki tüm bakteriyel bulaşıcı hastalıkların% 65'i ile ilişkili olduğu bulunmuştur1.

Biyofilmlerin inaktivasyonu için genellikle otoklavlar ve klor gibi dezenfektanlar kullanılmıştır. Bununla birlikte, otoklav kullanımı, ne yüksek sıcaklıktaki buhara dayanabilen ne de otoklava yerleştirilemeyen yüzeyler için sınırlıdır. Dezenfektanlar, kimyasal işleme duyarlı veya toksik oksidasyon ürünleri toplamaya eğilimli yüzeyler için uygun değildir2. Ek olarak, biyofilm sadece inaktive edilmemeli, aynı zamanda yeni hücrelerin yüzeye yapışmasını önlemek için çıkarılmalı, böylece yeni bir biyofilm3 oluşturulmalıdır. Bununla birlikte, viskoz sıvı kesmeye dayalı yöntemler kullanılarak biyofilmlerin çıkarılması zordur, çünkü yüzeye yakın akış hızı neredeyse sıfırdır ve kesme kuvveti genellikle mikron ve mikron altı boyutlu maddelerin yapışma kuvvetlerinin üstesinden gelemez. Ayrıca, biyofilm matrisinin fiziksel ve kimyasal bir bariyer görevi gördüğü bilinmektedir1.

Yüzeylerden biyofilmleri çıkarmak için ultrasonik titreşim1, elektrik akımları4, lazer ışınlaması5 ve yüksek basınçlı su spreyleri6 dahil olmak üzere birçok fiziksel ve mekanik teknik geliştirilmiştir. Her tekniğin kendine özgü artıları ve eksileri vardır. Biyofilm oluşumunu kontrol etmek için ultrasonik titreşim ve elektrik akımı kullanılabilir; Bununla birlikte, sırasıyla belirli bir konfigürasyon ve iletken yüzeyler gerektirirler ve ek kesme gerilimigerektirirler 1, 4. Lazer ışınlaması sınırlı bir alana ve sert yüzeylere uygulanabilir; Bununla birlikte, bazı canlı ve ölü hücreler yüzeyde kalır5. Yüksek basınçlı su spreyleri biyofilmleri etkili bir şekilde giderir; Bununla birlikte, yüksek momentumları yumuşak yüzeylerezarar verebilir 6.

CO2 aerosolleri kullanılarak biyofilm çıkarılması daha önce önerilmiştir. 7-11 gibi kısa bir sürede yüksek kaldırma verimliliği ile umut verici sonuçlar göstermiştir. CO2 aerosolleri, yüksek basınçlı bir CO2 gazının bir nozuldan adyabatik genleşmesiyle üretilir ve bir biyofilm ile kontamine olmuş yüzeylere uygulanır. Bu temizleme tekniği, katı CO2 parçacıklarının momentum transferini ve erimiş CO2 sıvılarının çözücü etkisini ve ardından CO2 gazının12 aerodinamik kesme kuvvetini kullanır. Yüksek basınçlıN2 gaz jetleri ile karşılaştırıldığında, aynı durgunluk basıncındaki CO2 aerosol jetleri, E. coli biyofilmlerininçıkarılmasında çok daha etkilidir 7. Ayrıca, bakterilere iletilen katı CO2'nin momentumu oldukça yüksek olmasına rağmen, katı yüzeye uygulanan toplam aerosol jetinin momentumu, su jetlerininkinden önemli ölçüde daha düşüktür. Bu nedenle, bu CO2 aerosol tekniği kullanılarak hasarsız temizlik mümkündür.

Bu protokolde, Pseudomonas putida biyofilmlerini cilalı paslanmaz çelik bir yüzeyden çıkarmak için nitrojen tasfiyeleri olmadan periyodik CO2 aerosol jetleri kullanıldı. Aslında, nitrojen tahliyeleri, sıcak bir plaka veya kızılötesi lambalarla ısıtma ve kuru kutular kullanma da benimsenmiş olsa da, temizlik sırasında oluşan nem yoğunlaşmasını azaltarak giderme verimliliğini artırmak için birçok CO2 aerosol çalışmasında kullanılmıştır12. Yüzey biyofilm oluşumu ve optimize edilmiş temizleme prosedürleri aşağıda açıklanmıştır. Uzaklaştırma verimliliği, yüzeydeki biyofilmin floresan yoğunluğu ölçülerek değerlendirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Biyofilm Oluşumunun için Yüzeyin hazırlanması 1.

  1. Mekanik kesici ile çipleri içine 304 1 mm kalınlığında paslanmaz çelik levhalar (10 × 10 mm 2) kesin.
  2. 10 dakika her biri için aseton, metanol ve deiyonize (Dİ) su ardışık olarak cips ultrasonik temizleme gerçekleştirin. Organik kirlenmeyi kaldırmak için, cam gibi maddelerden yapılmış bir çözücü dayanıklı kap kullanın.
  3. 3-5 saniye DI akan su ile cips durulayın.
  4. 3-5 saniye N2 gaz akışını kullanarak cips kurutun.

Bakteriyel kültür 2. Hazırlık

  1. Bir P al -80 ° C derin dondurucuda saklanan stokunun (nazikçe Prof. Sung Kuk Lee, unist, Güney Kore tarafından sağlanan) putida KT2440.
  2. 1 dakika sonra oda sıcaklığında erimeye ve dondurulmuş stok çözeltisi üst tabaka çamur döner. stok solüsyonu erimiş tabaka haline bir döngü daldırın.
  3. Bir Luria üzerine çizgi bakteri bu döngü kullanmak% 1.5 agar içeren -Bertani (LB) plaka.
  4. Bakteri kolonileri büyümesi 30 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.
  5. taze döngüsünü kullanarak plaka tek bir koloni seçin.
  6. tek bir bakteriyel koloniden ihtiva eden halka ile 50 ml konik bir tüp içinde LB suyu 10 ml inoküle.
  7. 30 ° C'de 16 saat ve 160 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesi içinde suyu inkübe edin.

Yüzey 3. Biyofilm Oluşumu

  1. Her çip yüzeyi sterilize etmek için, 1-2 saniye her 5 kez cımbız ile hazırlanan cips her Pick up ve% 70 etanol bunları batırın. cips daldırma sırasında cımbız ile yapılan emin olun.
  2. Geri kalan etanolü çıkarmak için otoklavlanmış DI su ve LB suyu sırayla her bir çip, 1-2 sn her biri için 5 kez, batırın.
  3. 2 yongaları ve oyuk başına 5 mi LB suyu ile 6 oyuklu kültür plakaları, bu fiş yerleştirin.
  4. LB suyu ulaştığı konsantrasyon kadar bakteri kültürü sulandırınız8 x 10 8 hücre / ml (600 nm dalga boyunda optik yoğunluk: ~ 0.8).
  5. Seyreltilmiş bir bakteri kültürü 50 ul her bir inoküle.
  6. biyofilmlerin oluşturulması için 24 saat boyunca çalkalamadan 30 ° C'de inkübe edin.

4. CO 2 Aerosol Temizleme

  1. 10 mM amonyum asetat tamponunda biyofilm oluşan fiş Dip (uçucu) 5 kat gevşek bağlı planktonik bakterilerin çıkması için.
  2. Hava hafif akan bir biyo-güvenlik kabini, bu yongaları kurutun.
  3. Hemen kurutulduktan sonra, jet ekseni boyunca CO 2 memeden 20 mm yükleme yerinde, bir çip koyun. 40 ° açı jet ekseni yatırın.
  4. Gaz basınç regülatörleri kullanılarak, sırasıyla 5.3 MPa ve 0,7 MPa, CO 2 ve N 2 gazı durgunluk basınçları ayarlayın.
  5. çip orta kesiminde üzerine aerosol jet uygulayın. 2 olmalıdır katı CO dahil beyaz aerosollergörülebilir. 5 saniye CO 2 için solenoid valf "konulu" çevirin ve ardından 3 saniye "kapalı" açın: periyodik elle kontrol anahtarı kullanarak (döngü 8 sn). Azot temizleme kullanılması gerekiyorsa, N2 sürekli bir kaynağı için selenoid vana açın.
  6. 16, 40 CO 2 aerosoller cips davranın ve ile ve azot tasfiyeler olmadan 88 saniye. Negatif kontrol olarak tedavi olmadan fiş saklayın.

Kaldırma Verimliliği için 5. Analiz

  1. Kontrol ve aerosol tedavi edilen yongaları üzerinde bakteri hücreleri boyamak için DI su: 1 iM yeşil floresan nükleik asit leke (480/500 nm uyarma / emisyon dalga boyu) hazırlayın.
  2. boyama çözeltisi içinde cips yerleştirin.
  3. 30 dakika boyunca 37 ° C'de ışıksız bir kuluçka makinesi içinde fiş inkübe edin.
  4. inkübasyonu takiben, hafifçe aşırı floresan boya kaldırmak için distile su akan fiş ile durulayın.
  5. cips wi kurutuninci N2 gaz akışı.
  6. Bir Epifloresans mikroskop, 40X objektif lens ve CCD kamera kullanarak her çip için görüş 5 rastgele alanlara (321 × 240 mikron 2) mikroskopik görüntüleri floresan atın.
  7. Böyle ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımı kullanarak her resim için floresan yoğunluğu elde edin. ImageJ, "Süreç" menüsünden "Çıkart Arkaplan" işlevini kullanın ve "Analiz" menüsünden "Set Ölçümleri" penceresinde "Entegre yoğunluğu" seçeneğini seçin. floresan yoğunluğu elde etmek için "Analiz" menüsünden "Ölçüm" yapın.
  8. Aşağıdaki formüle göre biyofilm çıkarma verimliliğini hesaplama:% 100 x (kontrol fişleri I - muamele edilmiş fiş I) / I hesaplanan floresan yoğunluğu (kontrol fişleri I).
  9. giderim verimleri ve standart sapmalar ortalama edinin. kullanmakHer iki durum için en az 4 cips.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CO2 aerosoller P çıkarmak için kullanıldı putida SUS304 yüzeyler (Şekil 1) den Biyofilmlererde. yüzeylerin çoğu büyüme 24 saat sonra biyofilm ile kaplanmıştır. Biyofilm çoğu CO 2 aerosoller (Şekil 2) kullanılarak çıkarıldı. Beklendiği gibi, Şekil 3 artmış CO2 aerosol tedavi süresi olarak biyofilm giderme veriminde bir artış gösterir. 88 saniye tedavi süresi için, çıkarma verimi 97.74 ve% ile, sırasıyla, bir nitrojen akı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Daha önce CO 2aerosol temizliğinde CO2 gaz basıncı, jet açısı ve katı yüzeye olan mesafe üzerinde optimizasyon çalışmaları yapmıştık7. Önceki çalışmalarımızdan farklı olarak, bu çalışmada aerosole nitrojen tahliyesi dahil edilmemiştir (Şekil 1). Ayrıca en yaygın paslanmaz çeliklerden biri olması ve gıda endüstrisinde yaygın olarak kullanılması nedeniyle bu protokolde 304 paslanmaz çelik kullanılmıştır. Cilalı yüzey, düzgün odak uzaklığı ve azaltılmış ışık saçılımı nedeniy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir (# 2015R1A2A2A01006446).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
304 paslanmaz çelikSteelni
(Güney Kore)		Cilalı ve doğranmış olanlar
Ultrasonik temizleyiciBranson
(ABD)		5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)Becton, Dickinson and Company
(ABD)		244620500 g
AgarBecton, Dickinson and Company
(ABD)		214010500 g
6 kuyulu kültür plakasıSPL Yaşam Bilimleri
(Güney Kore)		32006
Amonyum asetat tamponuSigma-Aldrich
(ABD)		66740410 mM
Çift gaz ünitesiUygulamalı Yüzey Teknolojileri
(ABD)		K6-10DGCO2 gaz
için bir nozul ve N2 gazı için 8 nozul
SYTO9Termo Fissher Scientific
(ABD)		İnvitrojenEksiyonu: 480 nm
Emisyon: 500 nm
Epifloresan mikroskobu Nikon (Japonya)Eclipse 80i
40X objektif objektif Nikon
(Japonya)		Plan FluorNA: 0.75
CCD kamera Photometrics
(ABD)		Cool SNAP HQ2Monokrom

Kaynaklar

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Pseudomonas PutidaPaslanmaz Çelik YüzeylerFloresan MikroskobuAerosol Uygulama SüresiGiderme VerimliliğiÜç Aşamalı TemizlikBiyolojik Kontaminasyonlu Yüzeyler
Biyofilm Kaldırma azotla temizleme karbon dioksiti aerosollerle
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.