Method Article

ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili Clostridium difficile Gerilme R20291

DOI:

10.3791/54850

⸱

December 10th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol klinik olarak ilgili ve genetik uysal gerginlik, R20291 kullanarak Clostridium difficile enfeksiyonu (CDI) sefoperazon fare modeli özetliyor. Klinik hastalık izleme, C. difficile bakteriyel numaralandırma, toksin sitotoksisite ve bir fare modelinde CDI genelinde histopatolojik değişikliklere vurgu protokolde ayrıntılı olarak verilmiştir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile, anaerobik, gram pozitif, spor oluşturan, artan morbidite ve mortalite ile ilişkili ve buna bağlı olarak halk sağlığı için acil bir tehdit oluşturan enterik bir patojendir. Antibiyotiklerle başarılı bir tedaviden sonra C. difficile enfeksiyonunun (CDI) nüksü yüksektir ve hastaların% 20-30'unda görülür, bu nedenle bu patojene karşı yeni terapötiklerin keşfedilmesini gerektirir. CDI'nın mevcut hayvan modelleri yüksek mortalite oranlarına neden olmaktadır ve bu nedenle CDI'li insanlarda görülen kronik, sinsi hastalık belirtilerine yaklaşmamaktadır. C. difficile'ye karşı terapötikleri değerlendirmek için, klinik olarak ilgili bir suş kullanarak insan hastalığına yaklaşan bir fare modeline ihtiyaç vardır. Bu protokol, klinik olarak anlamlı ve genetik olarak izlenebilir bir suş olan R20291 kullanarak CDI'nin sefoperazon fare modelini ana hatlarıyla belirtir. Bir fare modelinde klinik hastalık izleme, C. difficile bakteri sayımı, toksin sitotoksisitesi ve CDI boyunca histopatolojik değişiklikler için teknikler protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. CDI'nin diğer fare modelleriyle karşılaştırıldığında, bu model uygulanan dozda eşit derecede öldürücü değildir ve insan hastalığı ile uyumlu uzun süreli bir klinik enfeksiyon seyrinin gözlemlenmesine izin verir. Bu nedenle, CDI'nin bu sefoperazon fare modeli, yeni terapötiklerin klinik hastalığın iyileştirilmesi ve C. difficile'ye karşı kolonizasyon direncinin restorasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için değerli bir deneysel platform olduğunu kanıtlamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile hayatı tehdit eden ishal 1 neden olan bir anaerobik, gram pozitif, spor oluşturan basildir. C. difficile enfeksiyonu (CDI) yıl 1-4 başına sağlık maliyetlerinde üzerinde 4800000000 $ artmış, insan morbidite ve mortalite ve sonuçları ile ilişkilidir. 2013 yılında, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri kamu sağlığı 1 acil tehlike teşkil ettiğini gösteren, acil antibiyotik direnç riski C. difficile kategorize. Şu anda, antibiyotik vankomisin ile tedavi ve metronidazol CDI 5 için standart bakım olarak kabul edilir. Hastaların 2,5-7% 30 - Ne yazık ki, antibiyotik başarıl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Açıklama:
Veteriner North Carolina State University College'da Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (NCSU) bu çalışmayı onayladı. NCSU Hayvan Bakım ve politika Kuzey Carolina Devlet 1985. Laboratuar hayvanları tesislerinin Hayvan Refahı Yasası ve Sağlık Araştırması Uzatma Yasası belirtilen standartlar ve ilkeler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuzu'nda belirtilen kurallara uymak geçerlidir kullanın. Hayvanların sağlık durumları günlük olarak değerlendirildi ve can çekişen hayvanlar insanca ikincil tedbirlerle takip CO 2 boğulma tarafından ötenazi uygulandı. Eğitimli hayvan teknisyenleri vey....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

temsili bir çalışma sırasında, 5 haftalık C57BL / 6 ağırlık fareleri 5 gün boyunca içme su (0.5 mg / ml) içinde Cefoperazone'un ile önceden işleme tabi tutulmuş ve 2 gün düzenli içme suyu ile yıkayın izin verildi. Farelere 0. günde (Şekil 1A) oral gavaj yoluyla C. difficile R20291 10 5 sporları ile tehdit edildi. Fareler 14 gün boyunca CDI kilo kaybı ve klinik bulgular (uyuşukluk, iştahsızlık, ishal ve kambur duruş) için izlenmiştir. C. difficile<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, C. difficile R20291 sporları ile mücadele edilen antibiyotikle tedavi edilen farelerin kilo kaybı, bakteri kolonizasyonu, toksin sitotoksisitesi ve gastrointestinal sistemdeki histopatolojik değişiklikler dahil olmak üzere klinik seyrini karakterize eder. Protokolde ayrıntılara dikkat edilmesinin gerekli olduğu birkaç kritik adım vardır. C. difficile spor inokulumunun doğru hesaplanması kritik öneme sahiptir. Bu hesaplama, bu protokole başlamadan önce birden fazla spor sayımı üzerinde tutar.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların şu anda açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, her ikisi de bu makalede kullanılan C. difficile R20291 sporları için Wellcome Trust Sanger Enstitüsü'nden Trevor Lawley'e ve Vero hücreleri için Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi'nden James S. Guy'a teşekkür eder. Hayvan histopatolojisi, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki LCCC Hayvan Histopatolojisi Çekirdek Tesisi'nde, Traci Raley ve Amanda Brown'ın özel yardımı ile gerçekleştirildi. LCCC Hayvan Histopatolojisi Çekirdeği, kısmen UNC Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi'ne bir NCI Merkez Çekirdek Destek Hibesi (2P30CA016086-40) ile desteklenmektedir. Ayrıca Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie ve Cassie S....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#62 Perisept Sporidiyal Dezenfektan Temizleyici SSS Navigator48027Bu ürün, üretici tarafından önerildiği şekilde seyreltme gerektirecektir
: 0.22 & mu; m filtreFisherbrand09-720-3Vero Hücre Testinde test edilen bireysel numuneler için filtre plakasına alternatif
%0.25 Tripsin-EDTAGibco25200-05637 ° C'de su banyosunda ısıtılması gerekir; Kullanmadan önce C
%0,4 Tripan MavisiGibco15250-061
%1 Peniciilin/StreptomisinGibco15070-063
%10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBSGibco16140-07137 ° C'de su banyosunda ısıtılması gerekir; C kullanmadan önce
1 ml plastik şırınga BD Tıbbi Malzemeler309628
1x PBSGibco10010-023
2 ml Mikro Santrifüj Vidalı KapakCorning430917
96 kuyulu hücre kültürü düz alt plakaCostar CorningCL3595
96 kuyulu filtre plakasıKırlangıçMSGVS2210
Yapışkan ContaThermoScientificAB-0558
Bacto AgarBecton Dickinson214010TCCFA plakalarının bir parçası (aşağıya bakınız)
Bacto Proteose PeptoneBecton Dickinson211684TCCFA plakalarının bir kısmı (aşağıya bakınız)
CefoperazoneMP Bioworks199695
CefoxitineSigmaC47856TCCFA plakalarının bir kısmı (aşağıya bakınız)
Clostridium difficile Antitoksin KitiTech LabsT5000Vero Hücre Testi için kontrol olarak kullanılır
Clostridium difficile Toksin AListesi Biyolojik Laboratuvarlar152CVero Hücre Testi için pozitif kontrol
D-sikloserinSigmaC6880TCCFA plakalarının bir parçası (aşağıya bakınız)
Damıtılmış SuGibco15230
DMEM 1x MediaGibco11965-09237 ° C'de su banyosunda ısıtılması gerekir; C kullanmadan önce
FruktozFisherL95500TCCFA plakalarının bir parçası (aşağıya bakınız)
HemositometreBright-Line, SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500TCCFA plakalarının bir kısmı (aşağıya bakınız)
MgSO4 (susuz)SigmaM2643TCCFA plakalarının bir parçası (aşağıya bakınız)
Millex-GS 0.22 & mu; m filtreMillex-GSSLGS033SSTCCFA plakaları için filtre 
Na2HPO4SigmaS-0876TCCFA plakalarının bir parçası (aşağıya bakın)
NaClFisherS640-3TCCFA plakalarının bir parçası (aşağıya bakın)
10 Numara tek kullanımlık neşter bıçağıMiltex, Inc4-410
PCR PlakalarıFisherbrand14230244
Plastik petri kabıKord-Valmark Marka2900
Steril plastik L-şekilli hücre serpmemakinesi Fisherbrand14-665-230
Şırınga StepDymax CorporationT15469
TaurocholateSigmaT4009TCCFA plakalarının bir parçası (aşağıya bakınız)
Ultra saf damıtılmış suInvitrogen10977-015
C57BL/6J FarelerJackson Laboratuvarı664Fareler 5 - 8 haftalık olmalıdır
Olympus BX43F ışık mikroskobuOlympus Life Science
DP27 kameraOlympus Life Science
cellSens Dimension yazılımı Olympus Yaşam Bilimleri

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cefoperazone Mouse ModelClostridium difficile InfectionBacterial EnumerationToxin CytotoxicityHistopathologic ChangesFecal Sample CollectionSpore Inoculum PreparationAnaerobic Chamber UseClinical Disease MonitoringColony Forming Units

Related Articles