Modifiye MicroSecure Vitrifikasyon: İnsan Blastosistlerinin A, Güvenli Basit ve Etkili Kryoprezervasyon Prosedürü

Summary

MicroSecure Vitrifikasyon, FDA iyi üretim ve doku işleme uygulamalarıyla uyumlu, ticari olmayan, aseptik kapalı bir vitrifikasyon cihazı sistemi olarak geliştirilmiştir. Hidrofobik tıkalı embriyo pipetlerinin endüstriden çekilmesi nedeniyle, vitrifikasyon prosedürü, standart iç pamuk tapadan önce bir iç conta içerecek şekilde değiştirildi.

Abstract

Klinik embriyo vitrifikasyon "açık" sistemi (yani, direkt LN ₂ kişi) ultra-hızlı soğutma vitrifikasyon başarı optimize etmek için bir zorunluluk olduğunu ^21. yüzyılda ve yanlış kanı ile benzersiz vitrifikasyon cihazlarının gelişimi ile gelişti. Soğutma oranları önemini çevreleyen dogması önemli kalite kontrol faktörlerini (örneğin, kullanım kolaylığı, tekrarlanabilirlik, güvenilirlik, etiketleme, güvenlik ve depolama güvenliği) gözardı teknik varyasyon ve vitrifikasyon cihazların yaratılmasına tabi güvenli olmayan uygulamalara yol açmıştır. içi ve arası teknisyen varyasyonu en aza indirmek amaçlanmıştır güvenli, güvenli, tekrarlanabilir ve güvenilir mS-VTF yönteminin geliştirilmesi için izin verilen diğer cihazların kalite kontrol kusurları anlama. içselleştirilmiş, çift renkli, sabotaj p 1) 0.3 mL'lik iyonomerik reçine embriyo saman: Aynı derecede önemli, iki var olan FDA uyumlu cihazların kullanılabilirliğini kombinetekrarlanabilir kaynak mühür potansiyeline sahip çatı etiketleme; ve 2) doğrudan çok etkili küresel vitrifikasyon cihazı yaratmak için embriyo (lar) yüklemek için, 300 mikron kimliği steril flexipettes sık kullanılan, kısaltılmış. Diğer aseptik gibi, vitrifikasyon sistemleri (örneğin, Yüksek Güvenlikli Vitrifikasyon (HSV), Rapid-i ve VitriSafe) etkin bir şekilde üreme tıbbında kullanılan, microSecure Vitrifikasyon (uS-VTF) yüksek sonrası ısınma sağkalım ve gebelik elde edebilirsiniz kanıtlamıştır kapalı sadeliği dikkat ve düşük teknik varyasyon sonuçları. dahili hidrofobik fiş ihtiva eden 0.3 mL'lik bir embriyo, saman, ticari olarak pamuk, polivinil pirolidon (PVP) fişler sahip olan bir standart semen saman ile değiştirildi, ancak, bu, kaynak sızdırmazlığı sağlamak için onun iyonomerik reçine bileşimini muhafaza. Ancak, pamuk fişler temas üzerine flexipettes sıvı-embriyo içeriğini fitil olabilir. Bir modifiye mS-VTF yöntemi ek iç kaynak içerecek şekilde adapte olduCihaz yükleme tarafında fiş önce mühür. mS-VTF prosedürüne ilave teknik adım başarılı bir uygulama, yüksek sağkalım oranları (>% 95) etkilenmez ve gebelik oranları bugün devam ediyor.

Introduction

Vitrifikasyon intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu gelişiminde beri in vitro fertilizasyon (IVF) sektöründe tek ve en etkili yardımcı üreme teknolojidir. Bugün, blastosist önceden geleneksel yavaş dondurma yöntemleriyle ¹ ile ilişkili embriyo canlılığı kaybı olmadan kriyoprezerve vardır. Güvenilir sonrası ısınma embriyo sağkalım, infertilite sanayi geleneksel taze embriyo transferi daha benzer veya daha yüksek gebelik sonuçlarını verim Kriyoprezerve embriyo transfer döngüleri, tercih edilen kullanım dönüşüyor. Blastosist biyopsisi ve preimplantasyon genetik tarama (PGS) ile birlikte, vitrifikasyon öploid tek embriyo transferi ^{2, 3} üzerinden sağlıklı canlı doğum sonuçlarını optimize etmek için hayati bir klinik araç haline gelmiştir.

Murin embriyo ^{vitrifikasyon,} 1980'lerin ortalarında ⁴ geliştirildi ⁵ ve 1990 ⁶ ile hayvan tarıma adapte. vitrifikasyon çözümleri buz kristali oluşumunu zarar ücretsiz metastabil glasseous devlet oluşturacak öncül dayanarak, daha verimli embriyoların tam hücresel bütünlüğünü korumak için kanıtlanmıştır. İlginçtir ki, insan embriyoloji içine vitrifikasyon umut verici kabul ^21. yüzyıla kadar gerçekleştirilecek başlamadı. Vitrifikasyon kullanımını teşvik Erken yayınlar benzersiz "açık" sistem cihazlarının ^{7, 8, 9} gelişimi ile çakıştı. Yavaş blastosist donma gelişmeler de meydana ne zaman bir anda geldi Ancak, klinik uygulamaya vitrifikasyon benimsenmesi, yavaştı. Başarılı konvansiyonel yavaş donma hızı vitrifikasyon ek olarak, hem de Incorporat sahip embriyo kültürü sistemlerinde iyileştirmeler ile hizalandısonradan, ilkel trofoblast hem genel sağkalım gelişmiş ve blastokol-çöken yaklaşımların iyon implantasyon ^10.

Son on yılda, vitrifikasyon teknoloji hızla geleneksel dondurma uygulamalarını üstlenilmekle. büyük ölçüde, bu özel vitrifikasyon cihazlarının geliştirilmesine nedeniyle oldu. Bu cihazların bazıları IVF endüstrisinde ¹¹ kullanılan cihazlara doğasında tasarım kusurları getirerek klinik vitrifikasyon genel güvenlik, etkinlik ve verimliliğinin engelli var. Nitekim, farklı cihazlar nüansları genellikle "teknik imzalar" ¹² olarak adlandırılan programlar arasında önemli teknik varyasyon, tanıtmak. Böylece, bilimsel dergiler, Visualized Deney Journal (vallahi) gibi, sonuç farklılıkları azaltmak için yardımcı olacak teknik ayrıntıları, göstermek için değerli bir kaynak olarak hizmet verebilir. Başka devam eden bir sorun olduğunu s olduğuome embriyolog bir 'açık vitrifikasyon sistemi' içinde embriyoların veya oosit "ultra-hızlı soğutma (yani, sıvı azot (LN ₂₎ ile doğrudan embriyo temas) optimize için bir ön koşul olduğunu iddia dayalı, bugün bile, yanlış bilgilendirilmiş devam başarı oranları. " Açıkçası, bu inanç sistemleri ^{13, 14, 15} kapalı aseptik kanıtlanmış başarı dayalı, yanlıştır.

Vitrifikasyon kriyobiyolojik ilkelerine dayanarak, vitrifikasyon etkinliği oranları ^{16, 17, 18,} soğutma ziyade ısınma oranları üzerine daha çok bağlıdır. Genel olarak, kullanılan vitrifikasyon cihazdan bağımsız, ısınma oranı yüksek hayatta kalma oranlarını sağlamak için soğutma hızını aşması gerekmektedir. Yüksek ısınma oranları herhangi bir buz büyüme (yani recr için fırsat aza indirmekısınma devitrifikasyon aşamasında cryo çözümler çekirdekli kirliliklerin) ve ystallization. Verilen vitrifikasyon solüsyonu (yani, tipi ve kullanılan donmaya karşı koruyucu ajanların konsantrasyonu) kararlılığı bir karıştırıcı etkisi olabilir, ama bu ayrı bir yayın ¹¹ ele alınmaktadır. Soğutma ısınma oranı sorunları göz önüne alındığında, MicroSecure Vitrifikasyon (uS-VTF) vitrifikasyon kalite kontrol yönlerini optimize ucuz, ticari olmayan, FDA uyumlu bir yöntem olarak 2008 yılında geliştirilmiştir. O kurcalamaya dayanıklı, içselleştirilmiş, çift renkli etiketleme teklif benzersiz oldu. Ayrıca, yükleme ve (ikincil aygıt yüzeyine pipetleme olmadan, yani) pipetleme için kullanılan steril flexipette doğrudan embriyoların saklayarak ve otomatik macunu kullanarak tamamen kaynak mühür, teknik varyasyon etkili bir şekilde ortadan kalkmıştır iyonomerik reçine çörek kullanarak.

c değerlendirilirken1) Etiketleme potansiyel misin etiketler güvenli uyulması: potansiyel kullanım için vitrifikasyon cihazları ompleteness dahil olmak üzere dikkate alınması gereken birçok kalite kontrol faktörleri vardır? Onlar kurcalanmamasmı mı? Onlar iki renkli kimlik potansiyeli sunuyor musunuz? Bir ikincil etiket gerektirmez ve etiket kolayca kayıt tutma amacıyla (örneğin, hastanın doğrulama) sonrası ısınma için çıkarılabilir? 2) Teknik kolaylığı misin embriyolar kolayca zamanında cihaza üstüne / yüklenen ve sadece tespit ve post-ısınma izlenebilir? 3) Usul basitlik / Tekrarlanabilirlik teknisyenleri (iç) ve programlar (harici) arasındaki değişimini en aza indirir kolayca tekrarlanabilirlik sağlayan vitrifikasyon yöntemi teklif basitlik ve güvenilirlik, -Öyle? 4) LN ₂ depolama kapasitesi kolayca ve güvenli bir şekilde ele ve tespit cihazları olmak misin? onların sto mıpotansiyel boşluk verimli öfke? aseptik kapalı sistem olarak fiziksel hasar veya olası kirletici cihaz teklif güvenlik ve emniyet mu? 5) Kurtarma potansiyeli / Beka -Bu cihaz embriyoların garantili kurtarma potansiyel sorunlara eğilimli tasarım ve güvenilir bir vitrifiye ve tam hücresel bütünlüğü sonrası ısınma koruyacaktır? İkincisi özel kalite kaygısı, geri kazanım oranı, aslında şaşırtıcı yayınlanan raporlarda minimize edilmiştir; Bu genellikle tipik-iyi sağkalım oranları olumsuz sonuç (yani, kayıp embriyo veya yumurta) gizleyerek yapılır. tutarsız kurtarma (<% 99) eğilimli herhangi bir cihaz ciddi kusurlu ve bir usul yükümlülüğü oluşturmaktadır.

Bizim aseptik, uS-VTF yöntemi stratejik her kalite kontrol önlemi açıklamak için geliştirilmiştir kapattı. Ancak, üstün klinik başarı ve doğrulama ¹⁴ 5 yıl sonra, prosedür t vardıo modifiye olacak. (Hidrofobik fişi sahip) orijinal 0.3 mL embriyo çörek IVF sanayi kaldırılır ve standart bir pamuk / PVP fişini sahip bir 0.3 mL meni saman (yani, bir meni / embriyo saman gibi relabeled) ile değiştirilmiştir. Bu usul kağıt güvenle, sadece, ve etkili mS-VTF uygulamak için gereken belirli adımlar ve stratejileri özetlenir. Alternatif İdeal saman konteyner klinik laboratuvar geri yeniden ortaya çıkar Dahası, biz bu zamana kadar, güvenilir tedarik sınırlamaları hesaba gerekli değişiklik (ler) vurgulayın.

Protocol

mS-VTF prosedürünün geliştirilmesi, insan oosit ve embriyo dondurulması üzerine 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) onaylı Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) çalışmanın bir parçası olarak yürütülmüştür. Prosedür bu yana rutin olarak aydınlatılmış onam formları imzaladı kısırlık hastalarının klinik tedavisi uygulanmıştır.

1. Kalite-Kontrol Hususlar

1. Hastaları ayırt etmek için farklı renkler (örneğin, kalem, etiket veya kimlik (ID) çubuklar veya fişler) kullanıyorsanız günde embriyo cryopreserving birden fazla grup.
2. Her hasta için farklı yemekler ve pipet kullanın. başka bir çözümden blastokist taşırken transfer ortamın hacmi en aza indirmek.
3. saman ya da cihaz başına bir blastosist cryopreserve. aseptik / steril tekniği korumak ve tüm güvenlik önlemlerine uymak.
4. Hekimlerin Sevk Formu onaylamak ve initiatin önce hasta onam imzaladıg prosedürleri. envanterindeki hastaların embriyo (lar) ın eğilim kontrol edin.
5. blastosist başka bir tesise transfer edilecekse bir "Ulaştırma Sorumluluk ve Onay Release" kullanın. tüm imzalar yerinde veya noter şahit emin olun.
6. biyoanalizlere, endotoksin tespitler ve sona ermesi / lot numarası doğrulama ve izleme de dahil olmak üzere uygun ortam için kalite kontrol önlemleri ve protein takviyeleri, uygun şekilde, onaylayın.
7. <% 95 sağkalım oranları: <% 80 ve tek öploid blastokist kullanılarak klinik gebelik oranları: <% 50, klinik dondurulması sonuç izleme ve değerlendirme gibi tahsilat oranları gibi kritik limitler (endişe, yani düşük seviyelerde) oluşturulması.

2. Kryoprezervasyon Prosedürü

1. Hazırlık
   1. çalışma sayfaları içine giren veri ve dondurulması veritabanı ve envanter günlüğüne de dahil olmak üzere, uygun evrak tamamlamak(Ler).
   2. Taze dondurma çözümleri hazırlayın ya da ticari bir kaynak (üreticinin tavsiye depolama ve raf ömrü koşulları uyarak) kullanın.
   3. Saman hazırlanması.
      1. Bireyselleştirilmiş steril paketlerin etiketleme tarafını açın. ambalaj karşı tutup kısmen kaldırma ve saman çekerek, geleneksel 0.3 mL embriyo saman bulunan dolgu memesini ayırın; saman plastik paketi içinde aseptik aittir ise bu ortam koşullarına etiket ucunu gösterecektir.
         1. 0.3-ml meni / embriyo payet için (Değişiklik), aşağı 0.5 cm fişi itin. bir bazik masa darbeli kaynaklayıcı kullanımı yoluyla pamuk PVP fiş önüne, bir iç sızdırmazlık uygulanır.
         2. Sadece fiş önünde, elektrodun teflon yüzeyine saman ayarlayın. ısı etkinleştirmek için kolu bastırın. kırmızı ışık göründüğünde kolu bırakın. bir sıcaklıkta yeterli flatte bir tam kaynak mühür, ısı sağlamak için,ns karşıt yüzeyleri, daha sonra 180 ° 'den fazla çevirmek ve gerektiği gibi karşıt yüzeyi ¹⁹ kapatın.
   4. Bir cryomarker kullanarak, her saman / aygıt etiket ve hasta adı, benzersiz bir kimlik numarası (örneğin, SSN, DOB, veya hasta kimlik numarası) ve donma tarih cryogoblet. Ayrıca her saman / cihaza (örneğin, 1, 2, 3, vs.) benzersiz bir numara bulunur.
      1. Bir renk ağırlıklı İD çubuk üzerine etiket (tercihen renkli) elde edin yerleştirilir ve 0.3 ml embriyo damlacık içine mühürlü olması. kullanılıncaya kadar kendine özgü steril pakete saman dönün.
         Not: sadece 30 mm renk ağırlıklı kimlik çubuklar kimlik çubuk her iki tarafına bitişik, daha sonra iki rulman ek yerleştirme gereklidir, varsa.
   5. benzersiz bir yazıtlı kimlik numarası ile her bastonu tanımlayın. Bir LN ₂ depolama tankı sayısını ve her hastanın örnek (ler) st olabilir bir teneke kutu numarasını belirlemekORed uzun dönem.
   6. Damlacık kimliği (Şekil 1A) tutan / hasta adı, çözüm kimliği ve embriyo ile alt yüzeyi etiketleme taze cryo yemekleri (100 mm) hazırlayın. Spesifik olarak, damlacıkların 4 satır ayarlamak: izotonik HEPES-tamponlu ortamı (yukarıda), V1 (dengeleme çözeltisi (ES)), V2 (ara madde çözeltisi (IS)), V3 (vitrifikasyon çözeltisi (VS) alt). etiketli sütunlarla sağ üst tarafta embriyo kimliğini yazın.
      Not: 25- arasında bir dizi 50 uL (n = 3), her bir son 10 ya da 15 uL damlacık / solüsyon türü tutma sağlamak için kullanılan damlacıkları yıkama (örneğin, V1, V2, veya V3) saftır ve sulandırılmamış. Beş ayrı embriyolar kadar, bu yaklaşımı kullanarak, tek bir çanak kullanılarak vitrifiye yapabilirsiniz tarafından. kullanılmadığı damlacıkların herhangi oda sıcaklığı buharlaşma / dehidratasyonu önlemek için zaman örtülü her yemeğin tutun.
   7. baz ucunda 3 cm kesilmesiyle steril flexipettes hazırlama ( "VTF uçları" olarak anılacaktır). Bireysel üzerine onları takınpipetler (3 uL ayarlanır) ve bir strafor tüp raf (Şekil 1B) dik pipet-VTF ipuçları ayarlayın.
2. embriyo Seçimi
   1. hasta / örnek tanımlama onaylayın.
   2. - (400X büyütme 200) notu ve sınıflandırmak blastokistlerle Gardner derecelendirme sistemine ²⁰ göre, erken sırasıyla yumurtadan blastosist, için 1'den 6'ya kadar bir sayısal sınıflandırması kullanılarak ve A, B veya C sınıfı atanmış ters bir mikroskop kullanılarak iç hücre kütlesinden (ICM) ve ilkel trofoblast (TE).
      Not: blastosist biyopsisi ve euploidy analiz için hazırlanırken, zona pellucida TE erken herniasyonunu teşvik etmek Gün 3 lazer ablasyon öncesi yumurtadan ve böylece değiştirilmiş derecelendirme sınıflandırması ² gerektirir. % 50 yumurtadan, ve 5. sınıf kuluçka blastosist>% 50 TE ke var - Kısacası,% 10 TE herniasyonu kadar Sınıf 3 tam blastosist sergi, 4. sınıf blastosist 10 olan genişletilmişN (Şekil 2A-C).
      Not: Bizim tercih (Grade 1 veya 2 blastosist geç morula dahil Sınıf 3 veya Ancak Gün 5 veya 6 tarihinde ≥BB kalitesi yüksek blastokistlerle, erken aşamalarda daha düşük kalitede (C) ve post-sıkıştırma embriyoların vitrifiye blastosist cryopreserve için ) kesinlikle tamamen sağlam ısınma hayatta ve canlı doğum elde etme yeteneğine embriyo elde edebilirsiniz.
   3. Düşük molaritesi vitrifikasyon çözümleri kullanılıyorsa cryodilution işleminin başlamasından önce, bir trofoektoderm birleşme micropuncturing veya bir trophectodermal hücresi ^21, bir laser darbesi ablasyon gerçekleştirerek, her blastosist blastokoel kapa (<6.5 M veya% 40 h / h).
      Not: blastosist daraltmak için gerek cihaz bağlı değildir. mS-VTF (2008) Kendi erken gelişim, başlangıçta etilen glikol (EG) / oosit ile başarılı bir şekilde DMSO çözeltileri (1 1 term gebelik dışında) kullanılan, ancak bir alt-optimal (<% 80)Fare blastokist ¹⁶ hayatta kalma / geliştirme başkaları ²¹ tarafından yaşandı. yüksek molar gliserol tabanlı çözümler yana, fiziksel blastokol çöküşü gereksizdir (2009 den beri) mevcut VTF sisteminde kullanılan (7.9 M aşan). Bununla birlikte, yumurtadan blastosist seçici kuluçka, genel olarak tavsiye edilir.
3. Cryodilution ve Blastosist Yükleme
   1. Inkübatör hasta kültür çanak çıkarın ve embriyo (lar) vitrifiye için çıkarmadan önce başka bir kişi (yani, ikincil bir kaynak tarafından tanık) ile hasta / örnek tanımlama onaylayın.
   2. stereomikroskobi altında, adım 2.2.2 başına blastosist gelişimi onaylamak cryo fiş güncellemek ve cryo yemeğin izotonik tutma damlacık içine kültür çanak pipet blastosist (ler).
   3. Vitrifikasyon flexipette (yani, VTF ucu) kullanarak bireysel tutma damlacıklar halinde her blastosist taşıyın.
   4. taşı herV1 (ES) çözeltisi içine blastosist.
      1. V1 solüsyonu (3 uL) ile flexipette önceden doldur ve embriyo üzerine yarım içeriğini yerleştirin.
      2. embriyo aspire ve (adım 2.1.6 anılacaktır) üç V1 yıkama damlacıklarının ilk hareket, embriyo 2 pipetle - çevresinde 3 kez, ve dışarıda (kabarcık oluşumunu kaçınarak) damlacık pipet içeriğini temizlemek veya çanak yüzey.
   5. Bir sonraki V1 yıkama damla ile VTF ucu doldurun ve embriyo (lar) ın aspirasyonu tekrarlayın. üçüncü kez tekrarlayın ve bireysel V1 tutma damlasına kadar blastosist (ler) hareket ettirin. seyreltme / yıkama adımları 30 ile 45 s almalıdır. Ön yük sonraki çözüme her VTF uç (örneğin, V2), rafa pipet takın ve bir sonraki pipet (adım 2.1.7 kuruluma göre) (Şekil 1B) kullanın.
      Not: V1 ve V2 çözümleri içeren olmayan dimetil sülfoksit içinde toplam maruz kalma süresi (DMSO) için, Indivi pipet 5 dakika her biriÇift blastosist eşit nihai V3 adımı gerçekleştirmek için blastokist başına en az 1 dakika gerektirdiğini düşünüyor, bu aralık içinde sendeleyerek edilmelidir. Örneğin, bir camlaştırma grubunda 4 blastosistleri, blastosist pipetle 75-S aralıklarla # 1-2-3-4 varsa.
      Not: Yenilikçi Cryo Enterprises (ICE) seyreltme protokolü yukarıda açıklanan genel DMSO içeren çözümler içeren diğer birçok ticari vitrifikasyon işlemleri, daha farklı. Bu protokoller yıkama solüsyonu (yani, izotonik ortam) birleşmesi, kademeli yoluyla aynı kademeli dilüsyonları elde, ancak daha az kontrollü, ES, ve VS.
   6. Tekrarlama V2 (IS) çözümlerini kullanarak 2.3.4 ve 2.3.5 adımları.
   7. Tekrarlayın 2.3.4 ve 2.3.5 kullanarak V3 (VS) çözümleri yineleyin.
   8. V3 tutan damlacık her blastosist koyarak üzerine, (damlacık dışında) VTF ucundan artık çözüm ve kabarcıklar temizleyin ve sonra embriyo etrafında temiz V3 ile tamamen ucu doldurun. UzmEl, yaklaşık hacmi (1 uL) üçte biri tamamen VTF ucu içine blastosist (ler) ve geri kalan V3 pipetle.
   9. , Pipetle VTF ucu çıkarın steril bir gazlı bez ile dış yüzeyinde kalan V3 ucu kuru silin ve önceden etiketlenmiş saman açık ucunu sonu ilk ucu takın. Bir "kuru ipucu" olası iç saman yapışmasını önleyerek için çok önemlidir.
   10. (Etiket aşağı sonunda) saman haricindekileri iç fiş veya mühür de ucu gözlemlemek ve güvenli bir şekilde hava sahasını 1 cm açık ucunu mühür. Tercihen, (örneğin, Syms I) teknik varyasyonu ortadan kaldırmak için bir otomatik yapıştırma cihazı kullanın.
       Not: Bir iyonomerik reçine plastik oluşan payet kullanmanın avantajı (örneğin, HSV veya uS-VTF) adım 2.1.3.1 de belirtildiği gibi cihazı sızdırmazlık herhangi düzgün çalışan ısıyı kullanarak, güvenilir "kaynak" mührü yaratmasıdır.
   11. Bir kez mühürlenmiş, bir stainl içinde LN ₂ doğrudan kapalı saman dalmaess çelik Dewar şişesi ve depolama için hastanın baston bağlı açık kadehine içine saman (ler) yerleştirin.
       Not: uS-VTF çörek hava dolu saman yüzdürme dengelemek için 40 mm ağırlıklı kimlik çubuklar kullanmak için, ters kadehler veya boş cryovials kullanımı ulaşım dahil sürece gerekli değildir numune (ler) kapsayacak.
4. Isınma ve Cryo-çözüm Elüsyon / Sulandırma
   1. Hekimlerin Sevk vitrifiye embriyo transfer tarihine ilişkin Formu, planlanan zaman ve embriyo ayrıntıları (PGS test eğer çözülmeye sayı / transferi, özel embriyo sayısı, vs.) onaylayın.
   2. ticari bir kaynak taze ısınma çözümleri (1.0 M sükroz stok çözelti) ve / hazırlayın veya kullanmak (bir kez raf ömrü 1 hafta-1 ay kullanımda, 4 ° C depolama önerilir).
      1. Nedeniyle sakaroz gra endotoksin birikimi risklere ilk açılışında (örneğin, haftalık arz kaynağı) üzerine 50 ml steril şişeler içine sakaroz Kısım 17.1 grtekrar oda maruziyet üzerine Nules.
      2. çözelti içine önceden tartılmış zerre sukroz karıştırın (1.0 M stok = 3.42 g / 10 ml HEPES-tamponlu insan tuba sıvısı [lH-HTF]) ve granüller çözünürlüğünü geliştirmek için 37 ° C'ye kadar çözüm ısıtın. Tekrar tekrar hız yukarı yardım ve nihai karıştırma tamamlamak için konteyner ters.
         Not: filtrasyonu (0.22 mikron filtre) pozitif basınçlı filtrasyon birimi kullanılarak yerine yapışkan çözeltilerine (> 0.5 M sukroz) veya yüksek hacimli için önerilir. El basınç pompaları elektrik pompa gürültülü ise, titreşimleri neden olur ve sadece gerekli değildir, yeterli ve ucuz.
   3. Sıcak (37 ° C) bir 10 ml tüp uS-VTF ısıtma banyosu kullanım için hasta başına 1.0 M sukroz çözeltisi ve H-HTF bir maddenin her birinden.
   4. hasta adı ve çözüm kimlikleri ile kapak yüzeyi etiketleme taze çözülme yemekleri (6-plaka) hazırlayın.
      Not: Bu durumda, kullanılan: (1) T1, yıkama (200 uBir yağ kaplaması olmayan L yağı yağ yağ 1 ml (2) T1 (100 uL), (3), T2 (100 uL), (4) T3 (100 uL), (5), T4 (100 uL) bir yağ kaplaması olmayan bir yağ, ve% 10 insan serumu albümini (HSA) ya da% 20, serum yerine (6) T5 / 200 uL izotonik HEPES-tamponlu ortam ile. Evrensel bir sakaroz çözüm adım aşağı protokol-T1 = 1.0 M, T2 = 0.5 M, T3 = 0.25 M ve uygulamak T4 = 0.125 M-eğer yavaş dondurulmuş embriyoların ²² için önerildiği gibi ICE veya başka bir ticari kaynak mevcut değildir . Bundan başka, ilk T1 yıkama ve son T5 equilibrations 30 mm Petri tabaklarda gerçekleştirilebilir ve 4 oyuklu yemeğin bir yağ kaplamayı kapsayan, yukarıdaki adımları 2-5 için kullanılan unutmayın.
   5. Bir seferde sadece bir hastanın embriyo (lar) çözülme.
      1. Hekimlerin Sevk Formu kontrol edin ve belirtilen sayıda (yani 1 ya da 2 blastosist) ısınma önce döngüsünü teyit; shr, yani (ozmotik değişimleri gözlemleyerek hayatta kalma / muhtemel canlılığını değerlendirmekinkage ve rehidrasyon) ve bozulmamış membranlar ve sorgulanabilir eğer, başka bir blastosist ısınma önce doktor ve / veya hasta başvurun.
   6. Bir meslektaş ile hasta / örnek tanımlama onaylayın (örneğin, ikincil bir kaynak tarafından tanık).
   7. LN ₂ ile dolu bir Dewar şişesi hasta baston yerleştirin ve ılık olan saman belirlemek izole eder.
   8. stereomikroskopta sahnenin merkezine 6-kuyu seyreltme yemek getirmek. Bir tarafta bir 60 mm Petri kabı kapalı yerleştirme (yani sol-el ya da teknisyen sağ tercihine göre), ısıtılmış sükroz (1.0 M) ekleyin ve H-HTF çözümleri 0.5 M sükroz ısınma oluşturmak için banyo (ortaya).
      Not: VTF ipuçları bir embriyo hızlı ısınma ²² üzerine atılır nadir olay embriyo canlılığı tutulmasını sağlamak için, bir QC koruma olarak 0.5 M sükroz çözümleri ısındı.
   9. Sıvı seviyesinin üzerinde üst saman mühür tutunkimliğini doğrulamak ve sonra kavramak ve Mayo makas kullanarak iç kapağın altında saman sabitlemek için (VTF ucu hala LN ₂ batık olmalıdır).
      1. Sıkıca bir QC önlemi olarak iç saman yan duvarından VTF ucu kaldırmak için Dewar şişesi üzerinde makas (birkaç kez) dokunun; VTF ucu yapışık ise, dinleme ucu taban böylece fiş sonuna yakın bir hava alanı sağlayan, etiketli sonunda karşısındaki kapalı sonuna kadar düşer sağlar.
   10. (Bir sonraki stereoskop yüzeyine veya altında) bir yatay konumda ortam havaya makas ile saman kaldırın ve olmayan etiketli ucunu (sağ tarafına etiket) kavramak. İç fiş de saman kesmek veya mühür ve ısınma banyo çanak üzerinde kaldırın. tamamen haddelenmiş ve (> 6.000 ° C / dak) hızla olmuştur ısınıncaya kadar 60 ° açıyla sıcak sakaroz banyoya VTF ucu dökün; flexipette taban çanak yan duvarına üzerinde duracaktır.
       1. VTF ti izinp-ücretsiz sonbahar banyosu içine kadar. ucu hemen ortaya değilse hafifçe üst saman yüzeyini hafifçe vurun. sadece kısmen yol belirirse, makas ya da ince forseps ile flexipette milini tutarak ekstrüzyon yardımcı olur.
   11. 5 Sonra - 10 s, pipet tabanını kavramak ve tek kullanımlık pipet cihaza takın; ampul bir delik ekleme üzerine baskı serbest bırakmak için hareket eder. T1 yıkama içine vitrifiye blastosist serbest bırakmak için ampul sıkmak hafifçe bir parmağı ile ampul deliği kapatın ve (# 1) stereomikroskobi ile izlerken. Bir kez doğruladı, iyi, merkezi haline içeriğini tahliye, pozitif basınç kullanılmayan imha edilmesini artık V3 (VS) solüsyonu ve kabarcıklar temizleyin. 5 dk Sayacı başlat.
       Not: Tüm sükroz seyreltme aşamalar oda sıcaklığında (21 ± 2 ° C) gerçekleştirilir.
   12. VTF ucunu çıkarın ve bir pipet üzerine yerleştirin. (- 4 dak yaklaşık 3) kalan süre için yağ altında T1 2. içine embriyo hareket ettirerek devam edin.
       1. adım 2.4.12 başlatmadan önce hastadan - ikinci blastosist transferi için gerekli ise, derhal (2.4.11 adım 2.4.9 yineleyerek) ikinci bir saman ve VTF ucu sıcak. en az 3 dakika T1 minimum elüsyon (1.0 M sükroz) birlikte her iki blastosist taşıyın.
   13. bir sonraki çözüme flexipette ön doldurun ve sonra taşımak ve 3 dakikalık aralıklarla T2, T3 ve T4 blastosist (ler) seyreltin. Pellusida önce lazer ablasyon olmamıştır zona (yani, yumurtadan), T4 Bunu yaparsanız. ters bir mikroskop ve görüntü bir bilgisayar monitöründe embriyo sahnesine çanak yerleştirin. Belirlenmiş bir kırmızı daire içinde zona hizalayın ve bir diyot lazer (perivitelline alanı kenarında başlayan ve dışa hareketli) bir açıklık ^{2, 19} oluşturmak için 2 veya 3 dürtüleri etkinleştirin.
   14. Sıcak bir yüzeye (37 ° C) 5 dakika süre ile T5 (örneğin, izotonik ortamı) blastosistler dengelenmesi.
   15. piknotik koyulaşması yoksun bile, saydam sitoplazmalı sağlam hücre zarlarının baskın varlığına dayalı ilk embriyo hayatta değerlendirin. Embriyo transferi öncesi 6 saat, hangi zamanda, embriyo gelişimi / hayatta kalma yeniden değerlendirilmeli ve dokümante edilmelidir - 2 kültürüne embriyo (lar) yerleştirin.
       Not: 1'den fazla yaşayabilir blastosist transferi sırasında mevcut ve hasta adımları 2.3.3 tekrarlayarak sadece 1 blastosist, ek blastosist sonra başarıyla yeniden vitrifiye edilebilir (rVTF) ile devam etmek seçerse - 2.3.11. Biz tek rVTF olaylarından sonra birkaç doğruladı canlı doğum var.
       Not: rVTF deneysel olarak meta kararlı gliserol tabanlı çözelti içinde vitrifiye Anöploidi de insan blastosistleri, hayatta kalma / canlılığı üzerinde önemli bir etkisi olmaksızın 5 kez gerçekleştirilmiştir.

Results

1316 (98.1%) hayatta iken 1341 vitrifiye blastosist Haziran 2014 2012 arasında ısıtılmış ve 1341 embriyolar (% 100) elde edildi. Biyopsi blastosist% 99.5 hayatta kalma üzerine yaşadı. Ağırlıklı olarak tek genetik test, öploid, vitrifiye embriyolar transfer üzerine, biz Merkezi tarafından bildirilen son ulusal istatistiklere göre, (Şekil 3) ^20, en yüksek implantasyon oranları ve ABD'de canlı doğum oranları, yaştan bağımsız bazı ulaşmak için başardık Hastalık Kontrol ve Yardımcı Üreme Teknolojileri Derneği (Tablo 1 ve 2) için. Yalnız Kriyoprezerve döngüleri (Tablo 1) (az 35 yaşında) iyi bir prognoz hasta popülasyonu değerlendiren laboratuvar hem implantasyon oranları (yani, bir embriyonun verimliliği gebelik kurmak) için ulusal ortalamasının üzerinde bir performansla ve sonuçta doğum oranları canlı üzerinde% 30 oranında. Buna ek olarak, 70 araştırma-rıza gösterilen, yeniden vitrifiye anöploid blastokist kullanarak ortalarında 2014 yılında Modifiye depolama payet ilk geçerlilik / doğrulama% 100 geri kazanım ve% 100 sağkalım sonuçlandı.

1. MicroSecure VTF Kur rakam. VTF çanak (A) farklı numaralı tutma damlacıkları yerleştirme önce 3 yıkama damlacıkları kullanan vitrifikasyon çözümleri 3 ayrı satırlar ile monte edilir. Ayrıca, kısaltılmış VTF ipuçları (yani 300 mikron kimliği flexipettes) ile bireysel pipetler güvenli ve düzenli kullanım için döndürülebilir bir strafor tüp raf (B) düzenlenir. temsili bir tek kullanımlık mikropipet ampul pipet montaj strafor raf üzerinde duran unutmayın. arget = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Blastosist Değerlendirme Sistemi Modifiye. Bizim modifiye Gardner blastosist derecelendirme sistemi blastosist biyopsisi kolaylaştırmak için TE hücrelerinin neden olduğu herniasyonu oluşturmaktadır. Bir tarama blastosist (C)% 50'den daha fazla herniasyonu sahipken, (derece 4 = Yukarı herniasyonu% 50 B) (Sınıf 3 =% 10'dan daha az herniasyonu A) ve genişletilmiş blastosist modifikasyonu tam blastosistlerin erken taramayı dikkate ^16. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

54871fig3.jpg "/>
3. Karşılaştırmalı Gebelik Çıktıları rakam. kümülatif 1,5 yıllık bir zaman aralığında, gebelik verileri vitrifiye ısıtılmış öploid blastokist transferi etkilerini değerlendirmek için karşılaştırılmıştır olmayan PGS döngülerine göre (n = 172 devir / 144 transferler) ağırlıklı olarak taze tutan (n = 160 devir / 153 transferler) ¹⁸ aktarır. Deneysel amaçlı, bu veriler açıkça uS-VTF prosedürü ile vitrifiye biyopsi blastosist canlılığını korumak olduğunu ortaya koymaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Veri kaynağı	# döngüleri	transfer edilen embriyo # ortalama	İmplantasyon Oranı (%)	Canlı Doğum Oranı (%)
NB Lab *	144	1.2	74.00%	74.50%
Ulusal ortalama	20.423	1.7	39.60%	44.10%
* Veri Orange County Doğurganlık, Güney Kaliforniya Fertility Center ve 2008 yılında microSecure vitrifikasyon prosedürü kurdu geçerli Ovation Doğurganlık laboratuvarı (NB Lab) kullanarak Üreme Tıbbı klinikler için Southern California Merkezi'nin 2014 performansa dayalı ortalaması alınmıştır.

Tablo 1. 2014 CDC Üreme İstatistikleri Destekli. üç ila 35 yaş altı kadınların dondurulmuş embriyo transferi gebelik verileri 450'den fazla raporlama kliniklerinde ABD 2013 Ulusal ortalamaya göre bizim NB Lab kullanarak hekim klinikleri raporlama.

SART Ulusal Ortalamalar
Klinik - Devlet	Kadınlar	Kadınlar	Kadınlar	Kadınlar
	<35 yıl	35-37 yıl	38-40 yıl	41-42 yıl
SCCRM-CA *	% 63.1	% 58.3	% 40.6	32.3%
CCRM-CO *	64.7%	% 61.5	% 40.4	% 32.2
RMA-NJ *	% 63.2	% 59.7	% 34.6	% 18.7
Ulusal ortalama	% 48.6	% 38.3	% 24.3	% 12.3
Üreme Tıbbı SCCRM-Güney California Merkezi; Üreme Tıbbı için CCRM-Colorado Merkezi; ve RMA-REPRODuctive Tıp Associates
* Bu önde gelen klinikler hepsi ağırlıklı olarak nakledilen embriyo başına canlı doğum başarısını optimize etmek için hasta bakımının standart uygulamaya, preimplantasyon genetik testler ile birlikte, vitrifiye embriyo transferi döngüleri hayata geçirdik.

Tablo 2. 2014 Kümülatif canlı doğum oranları, diğer bazı saygın programlar yanı sıra, SART ile tezat Newport Beach, CA, bizim Ovation Doğurganlık Lab kullanarak SCCRM Kliniği için Yardımcı Üreme Teknolojileri Derneği (SART), tarafından bildirilen ulusal ortalamalar.

Discussion

Bugün, tam blastosist sağkalım (>% 95) elde ve taze embriyo benzer implantasyon başarı elde yüksek bir beklenti var. Bazı gruplar vitrifiye embriyo transfer döngülerinin canlı doğum oranları bozulmamış Kriyoprezerve embriyo sağlıklı olmayan hormonal uyarılan rahim içine nakledilen taze blastokist daha yüksektir belki olduklarını ileri sürmüşlerdir. Bizim verilerimiz açıkça vitrifikasyon etkin ve güvenilir taze embriyo canlılığını koruduğunu göstermektedir. Ayrıca, MicroSecure Vitrifikasyon (uS-VTF) denilen aseptik kapalı yöntem, IVF endüstrisinde kullanılan ticari standartlara (yani, açık cihaz sistemleri) daha karşılaştırılabilir veya daha fazla optimal sonucu elde edebilirsiniz kanıtlamıştır.

Varyasyon vitrifikasyon cihazları / bir sürü yöntem kullanan bireyler arasında teknik tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik ile ilişkilidir. Buna karşılık, bu inconsi sonuçlandıvitrifikasyona uygulama programları arasındaki stencies. Nedenle, cihaz aşinalık laboratuvar yeterlilik ve başarılı sonuçlar ile ilgili önemli bir faktör olması şaşırtıcı değildir. Bu programlar arasında tekrarlanabilirlik sorunlu olabilir açıklıyor "teknik imza" ¹¹ Bu kavramdır. Sadece ticari cihazlar bu fenomeni karmaşık bir düzineden fazla bir gelişme var, bu kalite kontrol kaygıları yarattı. Neyse ki, mS-VTF, Rapid-I gibi, vitrifikasyon kapalı sistemler ve VitriSafe, şimdi cihaz sistemleri ^{12, 13, 14} açmak için eşit derecede etkili olduğunu kanıtlamaktadır.

MicroSecure VTF akılda teknik kolaylığı, güvenilirlik ve cryo-güvenlik ile geliştirilen bir roman, aseptik vitrifikasyon tekniktir. İki önceden onaylanmış, FDA uyumlu cihazların kullanımını birleştirerek, ticari olmayan bir vitrifikasyon sistemi wözel cihazların aksine, kurulu bir düşük maliyetli olan ve ayrı bir avantajı i. Buna ek olarak, eşsiz ulaşılamaz ve içselleştirilmiş çift renkli etiketleme sistemi, yanı sıra çok sayıda diğer kalite kontrol avantajları, yapmış mS-VTF çekici küresel seçenek ^11. ticari olmayan bir VTF aygıtı olarak, ancak, onun yaygın sanayi uygulama yavaş yavaş gelişmektedir. Sadece emniyet, güvenlik ve klinik etkinliğinin sürekli yayın yoluyla kullanımı uS-VTF kazanç büyüyen olacaktır.

2014 yılının Ağustos ayında, zaman bir iç olmayan esneklik hidrofobik fişi ile üretilen orijinal 0.3 mL embriyo saman elde etmek için yetersizlik ile karşı karşıya, biz güvenilir uS-VTF yöntemini değiştirmek başardık. Kısacası, kendi pamuk-PVP fişleri ile yeni 0.3 mL meni / embriyo çörek etkin bir şekilde adapte edilmiştir. Bu sadece bu şekilde, pamuklu bir tıkaç önce bir iç yalıtım elde temasın önlenmesi ve sıvı ile emme ile elde edilmiştiraçık uçlu VTF ucu (yani, embriyo veya yumurta içeren flexipette). 40-mm ID çubuklar erişilebilir değilse Dahası, hafif 30 mm çubuklar ile ilişkili yüzdürme sorunu iki rulman kullanılarak Karşı ağırlıklı olabilir.

Bu ek adımlar hala son derece etkili bir tekniktir biraz daha az basit yaptık ama. onların euploidy durumu genetik raporunda teyit edilene kadar biyopsi blastosist tipik bireysel vitrifiye gibi Günümüzde, ekonomi ve etkinliği, giderek daha önemli kaygıları haline gelmektedir. bir teyit cansız anöploidi durumu ile blastosist genellikle hafta içinde, hasta onayı ile atılır olsun. Böylece, VTF cihazların bir çoğunluğu (>% 50) ticari cihazlar kullanarak tırmanan yıllık maliyeti neden kısa süreli depolamadan sonra atılır. Genel olarak, uS-VTF de insan blastosistleri, kriyokorunması için bir, yüksek etkili, güvenilir ve tekrarlanabilir bir işlemdir. üstün kalite-kontrol tasarımı securelkurtarma hatasını ortadan kaldırılması ve embriyo vitrifikasyon evrensel bir yaklaşım olarak sistemin kullanımını haklı sonrası ısınma sağkalım ve canlılığı, optimize ederken güvenle y etiketleri ve embriyolar / oosit saklar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alüminyum Kamış	IVM	XC055
Bilyalı rulmanlar, 3/32"	VXB.com	KIT15977	paslanmaz çelik
CBS sperma/embriyo samanı, 0,3 mL	CryoBioSystems	25292	ayrı steril
Renkli, iç dişli çubuklar, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	ağırlıklı
Kültür tüpleri, 15 mL	Falcon	352099	Konik
Kültür tüpleri, 10 mL	Falcon	352057	Çıtçıtlı
Kriyosleeve	Nalgene	5016-001
Filtre, 250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 μ m
Şişeler, Doku Kültürü 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes, 300 & mu; m Kimlik	Aşçı Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Steril, 20/paket
Forseps, Büyük	Miltex	6-30TC
Forseps, Kıymık - ince	Miltex	17-305
Kadeh	IVM	PA003
Isı Yalıtıcı, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V veya 220 V adaptörlü
Hepes tamponlu ortam	Life Global veya	LGGH-100; 100  mL veya	2 - 8 >m'de saklanır; C
	Irvine Bilimsel	H-HTF; 90126; Gerekli	olmayan AA Etiketleriyle
, Cryo	GA International	CL-23T1	Çeşitli renkler
Sıvı Azot Tankı, 40 nbsp; L	MVE veya Taylor Warton	çeşitli	sıvı depolama
LN2; Dewar şişesi, 0.5  L	Hampton Research	HR4-695	Paslanmaz çelik
6 kuyulu Custer Tabakları	Biogenics	015/020	kutuya göre plastik eşyalar
Pipet Ampulü, Mikro Kapaklı	Drummond	Fisher#13681451	Ampul apex
Petri Kapları üzerindeki delik, 35 mm	Falcon	351006
Petri Kapları, 58 mm	Nunc	150288
Petri Kapları, 100 mm	Falcon	351029
Pipet Uçları, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μ L
Pipet Yardımı	Drummond veya Falcon	çeşitli	şarj edilebilir
Pipetleme Cihazı, Stripper	Cooper Cerrahi	MXL3-STR
Pipetleri, Serolojik 1 ve nbsp; mL	Falcon	357521
Pipetleri, Serolojik 2  mL	Falcon	357507
Pipetleri, Serolojik 5  mL	Falcon	357543
Pipetleri, Serolojik 10  mL	Falcon	357551
Makas, Cerrahi Mayo	Miltex	5-SC-16
Stereomikroskop	Nikon, Olympus, Leica	çeşitli
Steril Gazlı Bez pedleri, 4 "x 4"	Kendall Healthcare	6939
Sentetik serum	Life Global veya	LGPS-20; 20 mL veya	2 - 8 >m'de saklanır; C
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 mL	düşük endotoksin lotu satın
alın Sucrose	Sigma Chemical Co.	Aliquot'u	50 'ye #S9378; mL şişeler, 1 yıl; 17,1 g/şişe + Orta ila 50 mL; 1 M'lik bir çözelti yapar; 0.22 ve mikro ile filtre; m birim
Zamanlayıcı	Nalgene	5016-001
Çözdürme Çözümü	Yenilikçi Cryo Enterprises	BL-TS (≤ 1.0 M sükroz)	T1, T2, T3, T4; 2 - 8 º'de tored; &le için C; Vitrifikasyon Çözümü açıldıktan 1 ay sonra
*,**Yenilikçi	Cryo Enterprises	BL-VS (≥ 7.9 M [gliserol/EG])	V1, V2, V3; 2 - 8 >m'de saklanır; &le için C; Açıldıktan 1 ay sonra
* Geçirgen olmayan kriyoprotektif katkı maddeleri şunları içerebilir: sükroz, ficoll ve sodyum hiyalüronat
** Diğer ticari müstahzarlar tipik olarak etilen glikol (EG)/dimetil sülfoksittir (DMSO; %30 v/v; 4,8 M), ancak EG/propilen glikol (%32 h/h; 5,2 M) olabilir. Karışık çözeltiler tipik olarak yüksek molar çözeltinin kriyo-toksisite endişelerini azaltmak için kullanılır. Ticari çözümler genellikle bir ES ve VS çözümü içerir. Ticari müstahzarın formülasyonu tipik olarak tescilli mülkiyettir.